《生物化学实验》精.docx
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《生物化学实验》精
《生物化学实验》
教学方案
湖南文理学院生命科学学院学院
生化与分子生物学教研组
实验一蛋白质的性质实验
（1）—蛋白质和氨基酸的呈色反应
授课题目：
蛋白质的性质实验
（1）——蛋白质和氨基酸的呈色反应（3学时）
授课对象：
生科、农学、动科专业
授课教师：
教学目标及基本要求：
1、了解蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2、了解某些蛋白质和氨基酸的呈色反应原理。
3、学习几种常见的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
教学内容提要及时间分配：
1、实验原理讲解：
12分钟
Ø双缩脲反应的原理
Ø茚三酮反应的原理
Ø黄色反应的原理
Ø坂口反应的原理
Ø考马斯亮蓝反应的原理
2、实验试剂与器材2分钟
3、实验步骤讲解：
10分钟
4、总结。
2分钟
教学重点及难点：
1、 双缩脲反应的原理。
2、蛋白质、氨基酸与水合茚三酮的显色反应。
教学方法：
采用启发式教学，结合理论，对实验步骤进行分析并给于适当示范。
教学手段（挂图、幻灯、多媒体…等）：
采用板书等手段进行教学。
使用的教材及参考资料：
1、生物化学实验指导，自编讲义。
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年。
思考题：
1、如果蛋白质水解后双缩脲反应呈阴性时，可以对水解反应程度作出什么样的推论？
2、茚三酮反应的阳性结果为何颜色？
能否用茚三酮反应可靠鉴定蛋白质的存在？
3、考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么？
4、如何正确使用分光光度计？
5、测定蛋白质含量还有哪些方法，测定原理有哪些不同？
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在的问题、改进措施等）
1、结合理论内容讲述实验内容，效果较好。
2、强调实验基本操作规范，让学生养成良好的实验习惯，具有扎实的实验技能。
实验二蛋白质的性质实验
（2）—蛋白质等电点的测定和沉淀反应
授课题目：
蛋白质的性质实验
（2）——蛋白质等电点的测定和沉淀反应（3学时）
授课对象：
生科、农学、动科专业
授课教师：
教学目标及基本要求：
1、了解蛋白质的两性解离性质。
2、学习测定蛋白质等电点的一种方法。
3、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
4、了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
5、了解蛋白质变性与沉淀的关系。
教学内容提要及时间分配：
1、实验原理讲解：
10分钟
Ø 蛋白质的两性解离性质
Ø 蛋白质等电点的概念
Ø 测蛋白质溶解度最低时的溶液pH值为其等电点
Ø稳定蛋白质亲水胶体颗粒的因素
Ø蛋白质沉淀反应的类型
2、实验操作讲解：
10分钟
Ø 蛋白质的盐析
Ø 重金属离子沉淀蛋白质
Ø 某些有机酸沉淀蛋白质
Ø 有机溶剂沉淀蛋白质
Ø 乙醇引起的变性与沉淀
3、总结。
2分钟
教学重点及难点：
1、 稳定蛋白质亲水胶体颗粒的因素。
2、蛋白质变性与沉淀的关系。
教学方法：
采用启发式教学，结合理论，对实验步骤进行分析并给于适当示范。
教学手段（挂图、幻灯、多媒体…等）：
板书，PPT。
使用的教材及参考资料：
1、生物化学实验指导，自编讲义
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年
思考题：
1、稳定蛋白质亲水胶体颗粒的因素有哪些？
2、蛋白质变性与沉淀的关系。
3、解释蛋白质两性反应中颜色及沉淀变化的原因。
4、该方法测定蛋白质等电点的原理是什么？
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在的问题、改进措施等）
1、结合理论内容讲述实验内容，效果较好。
2、强调实验基本操作规范，培养学生对实验现象的观察和实验结果的思考。
实验三牛乳中蛋白质的提取与鉴定
授课题目：
牛乳中蛋白质的提取与鉴定（3学时）
授课对象：
生科、农学、动科专业
授课教师：
教学目标及基本要求
1、学习从牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
教学内容提要及时间分配
1、实验原理讲解：
8分钟
Ø 蛋白质在其等电点pH溶液中溶解度降底。
根据这个原理，将牛乳的pH调整至4.8，即酪蛋白的等电点时，酪蛋白即沉淀出来。
用乙醇除去酪蛋白沉淀中不溶于水的脂肪，得到纯的酪蛋白
Ø 所得酪蛋白的定性鉴定
2、实验条件及步骤讲解：
7分钟
Ø 酪蛋白的制备
Ø 酪蛋白的性质鉴定
Ø 乳清中可凝固性蛋白质的鉴定
教学重点及难点：
酪蛋白的制备。
教学方法：
1、结合理论实际，深入浅出。
2、实验操作过程给于示教。
教学手段（挂图、幻灯、多媒体⋯⋯等）
板书，PPT。
使用的教材及参考资料
1、生物化学实验指导，自编讲义
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年
思考题：
1、牛乳中制备酪蛋白的原理和方法。
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在问题、改进措施等）
1、实验内容结合理论内容进行讲述，效果较好。
2、强调实验基本操作规范，让学生养成良好的实验习惯，具有扎实的实验技能。
实验四氨基酸的分离鉴定——纸层析法
授课题目：
氨基酸的分离鉴定——纸层析法（3学时）
授课对象：
生科、农学、动科专业
授课教师：
教学目标及基本要求
通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法。
教学内容提要及时间分配
1、实验原理的说明10分钟
Ø纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法
Ø层析溶剂由有机溶剂和水组成
Ø物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示
Ø在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。
Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。
2、实验操作讲解：
5分钟
教学重点及难点
1、扩展剂的制备。
2、氨基酸样品的点样。
教学方法
理论与实际相结合，深入浅出，培养学生综合运用所学课程知识。
实验过程中向学生提出问题，让学生在实验中观察思考，提高学生的分析问题，解决问题的能力。
教学手段（挂图、幻灯、多媒体..等）
板书，PPT，示教。
使用的教材及参考资料
1、生物化学实验指导，自编讲义
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年
思考题：
1、何谓Rf值？
影响Rf值的主要因素是什么？
2、层析缸中平衡溶剂的作用是什么？
3、滤纸为什么要在层析缸中预先悬空密封饱和30min？
4、展开时为什么要调节滤纸使溶剂前沿线平行于点样线？
5、实验结果为什么有时会产生拖尾、相邻氨基酸分不开等异常现象？
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在的问题、改进措施等）
在实验中向学生提问题，可增强学生的好奇心，对于理解实验原理很有帮助。
实验五酶的特性（设计型实验）
授课题目：
酶的特性（设计型实验）（6学时）
授课对象：
生科、农学、动科专业
授课教师：
教学目标及基本要求
1、加深对酶的性质的认识：
本实验由温度对酶活力的影响；PH对酶活力的影响；酶的激活剂及抑制；酶的专一性4组实验组成。
2、学会设计并实施影响酶催化活性因素的实验方案。
教学内容提要及时间分配
1、实验原理讲解：
10分钟
Ø酶的催化作用受温度的影响。
在最适温度下，酶的反应速度最高。
大多数动物酶的最适温度为37-40℃，植物酶的最适温度为50-60℃
Ø酶的活力受环境pH的影响极为显著。
不同酶的最适pH值不同
Ø酶的活性受活化剂或抑制剂的影响
Ø酶具有高度的专一性，淀粉和蔗糖无还原性
2、实验设计方案讲解：
5分钟
教学重点及难点
1、影响酶催化活性的因素。
2、实验方案设计及原理方法选择。
教学方法：
结合理论实际，深入浅出。
实验操作过程给于示教。
教学手段（挂图、幻灯、多媒体⋯⋯等）
多媒体，板书，画图，示教。
使用的教材及参考资料
1、生物化学实验指导，自编讲义
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年
思考题：
1、 实验方法设计及选择的原理和依据
2、 进行设计性实验的经验与体会
3、什么是酶的最适温度及其应用意义？
4、什么是酶反应的最适pH？
对酶活性有什么影响？
5、什么是酶的活化剂？
6、什么是酶的抑制剂？
与变性剂有何区别？
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在的问题、改进措施等）
1、学生实验结合理论内容进行自行设计，讲述实验设计方法，效果较好。
2、学生自己设计实验方案，探讨影响酶催化活性的因素，培养学生分析和解决实际问题的能力，提高学生的主动性和创造性，得到能力的培养。
实验六酵母核糖核酸的分离及组分鉴定
授课题目：
酵母核糖核酸的分离及组分鉴定（3学时）
授课对象：
生科、农学专业
授课教师：
教学目标及基本要求：
了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。
教学内容提要及时间分配：
1、实验原理讲解：
10分钟
Ø酵母核酸中RNA含量较多。
RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。
核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。
加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。
2、实验操作讲解：
5分钟
3、总结2分钟
教学重点及难点：
核酸组分鉴定的实验依据。
教学方法：
理论结合实践，深入浅出。
实验操作过程给予示教。
教学手段：
板书，PPT，示教。
使用的教材及参考资料
1、生物化学实验指导，自编讲义
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年
思考题：
1、如何得到高产量RNA的粗制品？
2、现有三瓶未知溶液，已知它们分别为蛋白质、糖和RNA，采用什么试剂和方法鉴定？
（自行设计简便的实验）
本单元教学总结：
对学生的实验预习、实验纪律、实验操作、实验报告、实验整理等环节进行督导，使学生养成良好的实验习惯，提高实验技能。
实验七紫外分光光度法测定核酸的含量
授课题目：
紫外分光光度法测定核酸的含量（3学时）
授课对象：
生科、农学、动科专业
授课教师：
教学目标及基本要求
1、了解紫外分光光度计的基本原理和使用方法。
2、学习用紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法。
教学内容提要及时间分配
1、实验原理讲解：
10分钟
Ø核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光。
RNA和DNA的紫外吸收高峰在A260nm波长处。
一般在A260波长下，每mL含1ugRNA溶液的光吸收值为0.020。
故测定未知浓度RNA或DNA溶液A260nm波长的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。
此法操作简便。
若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测定误差较大，故应设法预除去。
2、实验操作讲解：
5分钟
Ø紫外分光光度计的使用
教学重点及难点
1、核酸的制备
2、紫外分光光度计的使用
教学方法：
理论结合实践，深入浅出。
实验操作过程给予示教。
教学手段（挂图、幻灯、多媒体⋯⋯等）
板书，PPT，示教。
使用的教材及参考资料
1、生物化学实验指导，自编讲义
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年
思考题或作业：
1、紫外分光光度计的使用方法和操作要点？
2、若样品中含有蛋白质和核苷酸等杂质，如何排除干扰？
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在的问题、改进措施等）
1、强调实验基本操作规范，让学生养成良好的实验习惯，具有扎实的实验技能。
实验八 维生素C的定量测定
授课题目：
维生素C的定量测定（3学时）
授课对象：
生科、农学、动科专业
授课教师：
教学目标及基本要求
1、学习维生素C定量测定法的原理和方法。
2、进一步熟悉、掌握微量商定法的基本操作技术。
教学内容提要及时间分配
1、实验原理讲解：
8分钟
Ø测定维生素C（抗坏血酸）的化学方法，一般是根据它的还原性。
本实验即利用维生素C的这一性质，使其与2,6-二氯酚靛酚作用。
2,6-二氯酚靛酚钠盐的水溶液呈蓝色，在酸性环境中为玫瑰色，当其被还原时，则脱色。
2、实验操作讲解：
5分钟
教学重点及难点
1、含维生素C的样品提取液的制备
2、熟练掌握滴定操作
教学方法
理论结合实践，深入浅出。
实验操作过程给予示教。
教学手段（幻灯、多媒体等）
板书，PPT，示教。
使用的教材及参考资料
1、生物化学实验指导，自编讲义
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年
思考题：
试述本实验介绍的2,6-二氯酚靛酚滴定法的优缺点。
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在问题、改进措施等）
1、实验内容结合理论内容进行讲述，效果较好。
2、强调实验基本操作规范，让学生养成良好的实验习惯，具有扎实的实验技能。
实验九 血糖的定量测定—GOD-PAP法
授课题目：
血糖的定量测定—GOD-PAP法（3学时）
授课对象：
生科、动科专业
授课教师：
教学目标及基本要求
学习用GOD-PAP法测定血糖含量。
教学内容提要及时间分配
1、实验原理讲解：
8分钟
Ø动物血液中的糖主要是葡萄糖，正常情况下，其含量较恒定。
健康家兔的血糖水平为80-120mg/dL。
GOD-PAP法，即过氧化物酶-抗过氧化物酶法是近几年临床血糖定量测定普遍采用的方法。
该法测定血糖依据的酶反应为：
葡萄糖
氨基安替比林＋酚
醌亚胺＋
醌亚胺在A480nm~A550nm波长有最大吸收，所产生颜色的深浅与血清中葡萄糖的量成正比。
2、实验操作讲解：
5分钟
教学重点及难点：
样品中葡萄糖浓度的计算方法。
教学方法：
1、结合理论实际，深入浅出。
2、实验操作过程给于示教。
教学手段（挂图、幻灯、多媒体⋯⋯等）
板书，PPT，示教。
使用的教材及参考资料
1、生物化学实验指导，自编讲义
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年
思考题：
1、制取样品时应主要什么？
2、体液血糖测定有哪些方法
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在问题、改进措施等）
1、实验内容结合理论内容进行讲述，效果较好。
2、强调实验基本操作规范，让学生养成良好的实验习惯，具有扎实的实验技能。
实验十DNA的琼脂糖凝胶电泳
授课题目：
DNA的琼脂糖凝胶电泳（3学时）
授课对象：
生科、农学、动科专业
授课教师：
教学目标及基本要求
1、了解琼脂糖凝胶电泳的原理和使用范围。
2、了解琼脂糖凝胶电泳的操作技术。
教学内容提要及时间分配
1、实验原理讲解：
10分钟
ØDNA片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。
对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。
Ø在凝胶中加入少量溴化乙锭，其分子可插入DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧光，因此可对分离的DNA进行检测。
Ø电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝）作为双色电泳指示剂。
其目的有：
①增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内；②使样品呈现颜色，了解样品泳动情况，使操作更为便利；③以0.5×TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长300bp的双链DNA相同，二甲苯氰（蓝）则与4kb的DNA相同。
2、实验操作讲解：
5分钟
Ø琼脂糖凝胶的制备
Ø样品配制与加样
Ø电泳
Ø观察和拍照
3、凝胶成像系统的使用2分钟
教学重点及难点
1、 利用电泳方法分离核酸的原理。
2、 如何使用电泳仪和水平式电泳槽。
3、 凝胶的制备和加样操作。
教学方法
结合理论实际，深入浅出。
实验操作过程给于示教和个别指导。
教学手段（多媒体、录像等）
PPT，录像，示教。
使用的教材及参考资料
1、生物化学实验指导，自编讲义
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年
思考题：
1、DNA在电场中的迁移率取决于哪些因素？
2、琼脂糖凝胶有哪些注意事项？
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在的问题、改进措施等）
首先让学生观看录像，要求学生注意电泳技术的基本原理和基本操作。
在此基础上，学生进入实验操作阶段。
实验十一 蛋白质的透析
授课题目：
蛋白质的透析（3学时）
授课对象：
生科专业
授课教师：
教学目标及基本要求
学习透析的基本原理和操作
教学内容提要及时间分配
1、实验原理讲解：
3分钟
Ø蛋白质是大分子物质，它不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。
在分离提纯蛋白质的过程中，常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分开。
2、实验操作讲解：
5分钟
Ø用蛋白质溶液作双缩脲反应
Ø向火棉胶制成的透析管中装人10~15mL蛋白质溶液并放在盛有蒸馏水的烧杯中
Ø检查氯离子的存在。
做双缩脲反应，检查是否有蛋白质存在。
Ø不断更换烧杯中的蒸馏水以加速透析过程。
教学重点及难点
火棉胶制成透析管
教学方法
理论结合实践，深入浅出。
实验操作过程给予示教。
教学手段（幻灯、多媒体等）
板书，示教。
使用的教材及参考资料
1、生物化学实验指导，自编讲义
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年
思考题：
蛋白质透析的操作要点及主要事项。
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在问题、改进措施等）
1、实验内容结合理论内容进行讲述，效果较好。
2、强调实验基本操作规范，让学生养成良好的实验习惯，具有扎实的实验技能。
实验十二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细菌蛋白质
授课题目：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细菌蛋白质（12学时）
授课对象：
生科
授课教师：
教学目标及基本要求
1、 掌握不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和实验方法。
2、 能够熟练使用电泳仪和垂直板式电泳槽进行凝胶电泳操作。
教学内容提要及时间分配
1、凝胶电泳分离蛋白质的原理。
5分钟
2、聚丙烯酰胺凝胶电泳的组成成份。
3分钟
3、影响电泳分离效果的因素。
2分钟
4、实验条件及步骤。
10分钟
5、仪器的使用方法。
4分钟
6、具体实验过程包括：
凝胶贮液和工作液的配制、电泳装置的安装、制分离胶和浓缩胶、样品的制备、加样、电泳、取胶、染色、固定、背景脱色。
3分钟
7、评价并总结实验结果1分钟
教学重点及难点
1、 利用电泳方法分离蛋白质、核酸等生物大分子物质的原理。
2、 如何使用电泳仪和垂直板式电泳槽。
3、 分离胶和浓缩胶的制备及灌胶和加样的操作。
教学方法
首先让学生观看录像，要求学生注意电泳技术的基本原理和基本操作。
在此基础上，学生进入实验操作阶段。
教学手段（多媒体、录像等）
多媒体、录像，示教
使用的教材及参考资料
1、生物化学实验指导，自编讲义
2、基础生物化学实验，高等教育出版社，王秀奇主编，第二版，2003年
思考题：
1、 电泳后上下槽缓冲液可否混合后再使用？
为什么？
2、上样缓冲液中加入甘油的作用是什么？
3、贮液配制及贮存应注意什么？
4、过硫酸铵、TEMED和考马斯亮蓝在实验中有什么作用？
本单元教学总结（教学的主要经验、效果、存在的问题、改进措施等）
1、分离胶和浓缩胶的制备过程不要与皮肤接触，管胶过程缓慢不能产生气泡。
2、电泳仪应从低压电流逐步到高压电，以免直接影响实验结果。
3、 此实验过程中需要凝胶过程，所以最好选择于室温达到25°C的季节进行。
强调实验基本操作规范，让学生养成良好的实验习惯，具有扎实的实验技能。
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