全硫代反义寡核苷酸对卵巢癌细胞生长抑制作用.docx

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全硫代反义寡核苷酸对卵巢癌细胞生长抑制作用

全硫代反义寡核苷酸对卵巢癌细胞生长抑制作用

【摘要】目的采用针对人端粒酶hTR基因的反义寡聚脱氧核苷酸，探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸对卵巢癌HO-8910细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响。

方法①将实验分为空白对照组、脂质体对照组、端粒酶全硫代正义寡聚脱氧核苷酸组和不同剂量的全硫代反义寡聚脱氧核苷酸组；②脂质体介导的细胞转染后，PS-ASODN和PS-SODN分别作用于卵巢癌HO-8910细胞后并培养24、48、72h，分别采用酶联免疫吸附法、吖啶橙染色法、四甲基偶氮唑蓝比色法、流式细胞术检测HO-8910细胞的端粒酶活性、细胞形态、体外增殖、细胞凋亡和细胞周期的改变。

结果①ELISA法检测结果显示端粒酶PS-ASODN作用卵巢癌HO-8910细胞72h后端粒酶活性表达为阴性，说明端粒酶PS-ASODN能够抑制端粒酶活性；②吖啶橙染色观察细胞形态:

PS-ASODN作用的卵巢癌HO-8910细胞有明显凋亡现象，凋亡细胞体积缩小，染色质浓缩，说明PS-ASODN能够促进卵巢癌HO-8910细胞凋亡；③MTT实验：

PS-ASODN明显抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖（），并呈一定剂量和时间依赖关系；④流式细胞仪检测细胞凋亡和周期：

与空白对照组比较，PS-ASODN组G0/G1期细胞明显增多，差异显着；在G0/G1期前出现亚二倍体凋亡峰，表明细胞被阻止在G1/S期。

结论①PS-ASODN作用于卵巢癌HO-8910细胞后，卵巢癌HO-8910细胞增殖受到明显抑制，并出现凋亡；②PS-ASODN对端粒酶活性的抑制率与PS-ASODN的浓度和作用时间呈依赖关系，即抑制率随着反义寡核苷酸的浓度和作用时间的增加而增大；③以端粒酶RNA模板区为靶点的PS-ASODN明显抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖，其机制可能是通过降低细胞的端粒酶活性而诱发细胞的凋亡，PS-ASODN对卵巢癌的治疗具有重要价值。

　　【关键词】

　　端粒酶全硫代反义寡聚脱氧核苷酸；卵巢癌HO-8910细胞；端粒酶；细胞凋亡

　　【Abstract】ObjectiveInthisstudy，weapplyOligonucleotideaimeddirectlyathumantelomeraseRNA,TostudytheeffectsoftelomerasePhosphorathioateantisenseoligodeoxynucleotides（PS-ASODN）ontelomeraseactivityandproliferationofHO-8910ovarycarcinoma　①HO-8910ovarycarcinomaCellwastransfectedbyPS-ASODN,PhosphorathioatesenseoligodeoxynucleotidesmediatedbyLipotapLiposomalTransfection　experimentswereclassifiedintonormalgroup、PS-ASODNgroupsatvariedconcentrations、PS-SODNgroupandoligofectamineTMalone.②TheproliferationactivityofHO-8910ovarycarcinomacelllinewasdeterminedbyusingmethylthiazolyltetrazolium　telomeraseactivitywasdeterminedbyusingenzyme-linkedimmunosorbent　cellmorphologywasobservedbyfluorescencemicroscopestainedwithacridine　cytometrywasadoptedtoexamineapoptoticrateandcell　①WithELISA,TelomeraseofHO-8910ovarycarcinomacellwasrepressedbytelomerasePS-ASODNafter72hlater,itshowedthattelomerasePS-ASODNcouldleadinhibitionoftelomeraseactivity.②Thecellmorphologywasobservedbyfluorescencemicroscopestainedwithacridineorange：

ApoptoticmorphologicalcharacteristicofHO-8910ovarycarcinomacelltransfectedbyantisenseoligonucleotideswas,theapoptoticcellphysicalvolume　HO-8910ovarycarcinomacellgrowthwasinhibitedbyPhosph-orathioateantisenseOligonucleotideandappearedtheapoptosis.③PS-ASODNcausedsignificant（）inhibitionofcellgrowth，andtherateofinhibitionhasthediscrepancybetweenthedifferentdoseanddifferenttime（and）.④TheapoptoticpeakwasdetectedwithFCMandcellswerestayedinG1/Sstageandasub-GlstagecellapoptoticpeakappearinfrontofGO/G1stage.Typicalapoptoticmorphologicfeaturewasdiscoveredunderlight　①TheHO-8910ovarycarcinomacellgrowthwasinhibitedbyPhosphorathioateantisenseOligonucleotideandappearedtheapoptosis.②Itshowedthattherateofinhibitionhasthediscrepancybetweenthedifferentdoseanddifferent　otherwords，therateofinhibitionenhancealongwiththeaugmentofthedoseandtime.③PS-ASODNinhibitsstronglytheproliferationofHO-8910ovarycarcinomacellbyinhibitingtelomeraseactivitywhichinducecell　mightbeanewtargettoovarycarcinomatherapy.

【Keywords】

　　Telomerasephosphorathioateantisenseoligodeoxynucleotides;HO-8910ovarycarcinomacell;Telomerase;Cellapoptosis

　　目前随着人类生存环境污染的加剧，生活方式的改变，癌症已成为威胁人类健康和生命的主要杀手。

卵巢癌作为我国最常见的恶性肿瘤之一［1］。

卵巢癌的发生和进展涉及多种癌基因和/或抑癌基因的异常改变以及几个遗传基因的遗传失稳［2］。

然而除了这些分子生物学变化之外，卵巢癌可能还有另外一个非常重要的生物学特性，即以细胞的永生化来维持它的无限生长［3］。

研究表明这种永生化的维持主要是依赖肿瘤细胞中的端粒酶被激活后，使得端粒的长度维持到一定程度，从而使细胞获得无限增殖的能力［4］。

　　端粒是真核细胞染色体末端含有串联重复的DNA序列,其功能为体细胞分裂时端粒的末端会随每次的复制被逐渐缩短，当缩短到一定程度不能维持染色体的稳定时细胞最终死亡。

端粒长度保持在延长和缩短的动态平衡中，在这个平衡体系中端粒酶是关键因素［5］。

有关研究报告在多种肿瘤细胞中都可能有端粒酶的活性［6］。

端粒酶由蛋白催化亚基和指导端粒合成的RNA模板组成，即为具有逆转录酶特性的核蛋白酶［7］。

端粒酶几乎在所有恶性肿瘤组织中都有强阳性表达，而在正常体细胞及良性肿瘤组织中表达为阴性［8］，因此端粒酶已成为新的肿瘤标志物［9］。

　　端粒酶的三个主要组成成分:

端粒酶RNA（humantelomeraseRNA,hTR）、端粒酶相关蛋白质（telomeraseprotein1,TP1/TLP1）及端粒酶催化亚单位（humantelomerasereversetranscriptase,hTRT/hTERT）己经被阐明，基因序列也已经被克隆［10］。

设想应用反义寡核苷酸封闭该模板区，就可以抑制端粒酶活性，阻止端粒序列的合成，使细胞退出增殖周期，达到治疗肿瘤的目的。

所以端粒酶不但是特异性恶性肿瘤标志物，更是一个肿瘤治疗的理想靶点。

　　本实验设计了一段互补于hTR模板区的反义核酸，用寡核苷酸脂质体（OligofectamineTM）介导，将互补于人端粒酶RNA模板区的反义寡核苷酸作用于体外培养的卵巢癌HO-8910细胞，采用酶联免疫吸附法及流式细胞学等技术观察反义hTR对卵巢癌HO-8910细胞端粒酶活性、细胞增殖、细胞凋亡及细胞周期的影响,旨在探讨端粒酶PS-ASODN在卵巢癌治疗中的价值。

　　1材料与方法

　　材料

　　细胞来源人HO-8910卵巢癌细胞,辽宁医学院科学实验中心。

　　主要试剂及药品达尔伯克必需基础培养基培养基有GIBCO公司生产；小牛血清由Hyclone公司生产；胰蛋白酶由Hyclone公司生产；端粒酶全硫代反义寡核苷酸及对照正义全硫代寡核苷酸均由上海生物工程公司合成。

端粒酶PS-ASODN序列为5′-CTCAGTTAGGGTTAGACA-3′；端粒酶PS-SODN序列为5′-TGTCTAACCCTAACTGAG-3′；端粒酶检测试剂盒由大连泛邦化工技术有限公司生产。

恒温培养箱由美国FormaScientific生产；流式细胞仪由美国BD公司生产。

　　方法

　　引物的合成端粒酶全硫代反义寡核苷酸（PS-ASODN）及对照正义全硫代寡核苷酸（PS-SODN）:

均由上海生物工程公司合成。

PS-ASODN序列为5‘-CTCAGTTAGGGTTAGACA-3‘；PS-SODN序列为5‘-TGTCTAACCCTAACTGAG-3‘。

　　实验分组实验分组:

空白对照（Control）组;浓度为3μmol/L的脂质体对照组;浓度为3μmol/L的PS-SODN组;PS-ASODN浓度分别为1、2及3μmol/L三个浓度组。

　　实验方法

　　细胞培养卵巢癌HO-8910细胞以5×104/ml密度接种在含10%新鲜小牛血清、100U/ml庆大霉素的RPMI-1640培养液中，置370C、5%CO2孵箱中培养，隔天换液一次，取对数生长期细胞用于实验。

　　细胞传代:

倒除原培养液，无菌PBS洗涤两次后加入%的胰蛋白酶ml消化细胞，倒置显微镜下观察细胞变圆时倒掉胰酶，加入RPMI-1640培养液，用吸管轻轻吹打，制成细胞悬液，以适当细胞密度分装于几个培养瓶中，补加培养液，放入培养箱中培养。

　　复苏冻存的细胞:

从-80℃冰箱中取出冻存管，迅速放入37℃水浴箱中摇匀解冻后，在超净工作台中，用吸管吸出细胞悬液装入离心管，补加10mlRPMI-1640培养液，混匀后以800转/分离心5min，倒除上清，加入培养液1ml吹匀，再移入培养瓶中，如入培养液适当稀释后，置培养箱培养，2h后更换培养液一次，再继续培养。

　　细胞转染先将装有10OD干膜状寡聚脱氧核苷酸的EP管离心（10000g，10s），然后加入550μl双蒸水，充分振荡5s，配成存储浓度为100μmol/L寡聚脱氧核苷酸溶液，之后再对其进行稀释，使其存储浓度为20μmol/L以后根据实验需求再稀释（PS-SODN为3μmo1/L;PS-ASODN为1、2及3μmo1/L）。

　　脂质体介导的端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸转染按说明书操作。

实验分6组，每组设4个复孔。

6组分别为终浓度为3、2及1μmol/L的PS-ASODN组、终浓度为3μmol/L的脂质体对照组、终浓度为3μmol/L的PS-SODN组以及空白对照组。

用药后将小牛血清的浓度调至5%，以减少寡聚脱氧核苷酸的降解。

24h后弃去转染液，换新鲜培养液，并继续培养，收集细胞用于以下实验。

　　ELISA法检测端粒酶活性①细胞提取物的制备：

取处理因素作用后的细胞5×104，PBS洗涤后离心去上清，加裂解液10μl，冰浴放置30min，4℃、15000g离心10min，取上清液保存于-800C，以备端粒酶活性检测。

按试剂盒说明书操作，检测每组在450nm处的A值，并计算相应的端粒酶活性；②分组:

本实验按ELISA试剂盒说明书共分为8即：

　　阴性对照组:

阴性反应液+酶联反应物+底物A+底物B+终止液;

　　阳性对照组:

阳性反应液+酶联反应物+底物A+底物B+终止液;

　　空白对照组:

空白反应液+酶联反应物+底物A+底物B+终止液。

作用时间为72h的不同浓度PS-ASODN检测组、脂质体对照组（3μmol/L）和PS-SODN（3μmol/L）。

各浓度提取物+酶联反应物+底物A+底物B+终止液;③实验操作：

96孔培养板每组4个孔重复3次，（各组的实验条件都相同只有药物浓度不同）。

待试剂混匀、平衡到室温再进行实验操作。

　①阳性对照组加入50μl阳性对照液；阴性对照组加入50μl阴性对照液；空白对照组加入50μl空白对照液；各实验组分别加入50μl不同浓度药物的提取物;②8组中每孔都加入50μl酶联反应物，轻轻混匀,30s后用自黏封孔盖箔封住板孔,37℃温育60min;③洗板时甩尽板内液体，8组中每孔内分别加入洗涤液350μl洗涤反应板,并去除水滴（在厚叠吸水纸上拍干），反复洗涤5次;④8组中每孔依次加入50μl底物A和50μl底物B;⑤8组中每孔加100μl终止液轻轻混匀30s，30min内在450nm处读OD值（再换算成A值）。

　　结果判断：

检测组的A值与空白组的A值之比≥为阳性，在~之间为可疑阳性：

≤为阴性。

　　吖啶橙染色法观察细胞形态取对数生长期细胞1×105/ml接种于24孔板中，细胞接种、转染和培养方法同上。

10mg吖啶橙溶解于100mlpH值为的PBS中，4℃避光保存。

取转染3μmol/LPS-ASODN和3μmol/LPS-SODN72h后的细胞，按照说明书操作，荧光显微镜观察细胞形态。

　　MTT法测定PS-ASODN对卵巢癌HO-8910细胞增殖的影响细胞以5×104/ml密度接种在96孔培养板上，每孔100μl，待细胞生长活跃时加处理因素，分组方法与细胞转染的方法一样，分别培养24、48、72h后检测。

检测方法：

每孔加入5mg/ml的MTT20μl，继续培养4h，翻板倒掉液体，每孔加入二甲基亚砜150μl,轻轻振荡10min,用自动酶标仪检测540nm处的吸光度值。

　　抑制率=/空白对照组平均A值×100%

　　流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期①PI染色：

取对数生长期细胞1×105/ml细胞数接种于6孔培养板中，细胞接种、培养，转染方法同端粒酶检测实验。

将转染72h的细胞离心收集，PBS洗一次，离心弃PBS，用剩余的PBS充分混匀细胞，加入预冷的75%乙醇固定，混匀，用封口膜封口，4℃冰箱过夜。

上机检测前弃乙醇，PBS清洗细胞，调整细胞浓度至1×106/ml，加入PI（50μg/ml）800μl混匀，4℃避光染色1h,300目尼龙网滤过，上机检测，进行DNA含量、细胞周期的分析，低于G1期DNA含量主峰（亚G1期峰）的细胞为凋亡细胞。

每项实验重复3次；②AnnexinV-FITC/PI染色:

将各组细胞用胰酶消化，再用PBS洗涤，调整待测细胞的浓度为1×106个/ml。

取1ml细胞，1000g，4℃离心10min，弃上清；用PBS洗3次后将细胞重悬于200μlBindingBuffer；加入10μlAnnexinV-FITC和5μlPI，轻轻混匀，避光室温反应15min；加入300μlBindingBuffer，在1h内上机检测

　　统计学方法实验数据用表示，用SPSS软件包处理，组间比较采用单因素方差分析。

　　2结果

　　PS-ASODN对卵巢癌HO-8910细胞端粒酶活性的影响检测72h各组端粒酶活性阴阳性结果表明：

μmol/L的PS-SODN和μmol/L脂质体对照组的端粒酶活性表现均为阳性；而浓度分别为1、2、3μmol/L的PS-ASODN组端粒酶活性表现均为阴性，表明PS-SODN和脂质体对卵巢癌HO-8910细胞端粒酶活性无影响，而PS-ASODN对卵巢癌HO-8910细胞端粒酶活性有抑制作用（见表1）。

　　形态学观察结果吖啶橙染色72h后荧光显微镜下观察发现，空白对照组细胞呈圆形或椭圆形，胞浆丰富，胞核及分裂正常（见图1）；PS-ASODN组卵巢癌HO-8910细胞体积缩小，核皱缩并有细胞膜出芽，有明显凋亡现象，表明PS-ASODN具有促进卵巢癌HO-8910细胞凋亡的作用（见图2）。

　　PS-ASODN对卵巢癌HO-8910细胞增殖的影响与空白对照组比较,正义寡聚脱氧核苷酸组和脂质体组细胞增殖不显着（）；浓度分别为1、2、3μmol/L反义寡聚脱氧核苷酸组均能显着抑制细胞增殖（）并呈一定的时间和剂量依赖关系。

　　抑制率的计算结果表明，PS-ASODN各浓度组差异显着（），并呈一定的时间和剂量依赖关系，即抑制率随着PS-ASODN的作用时间和剂量的增加而增大。

　　流式细胞仪检测结果与空白对照组比较，浓度分别为、、μmol/L的PS-ASODN转染细胞72h后，G0/G1期细胞明显增多，差异显着，在G0/G1期前出现亚二倍体凋亡峰，表明细胞被阻止在G1/S期。

　　在双变量流式细胞仪的散点图上，转染72h后空白对照组活细胞数量占%，凋亡细胞数量占%；浓度为μmol/LPS-ASODN组活细胞数量占%，凋亡细胞数量占%。

表明PS-ASODN能够明显促进细胞调亡（见图9、图10）。

　　3讨论

　　端粒是真核线形染色体末端结构，由端粒DNA和端粒结合蛋白组成。

它由一端高度保守的重复序列（TTAGGG）n组成，方向5＇→3＇，长度约5~15kb［11］，端粒长度的维持需要端粒酶的激活。

自身携带模板是端粒酶区别于一般的纯蛋白逆转录酶的主要特征之一。

　　端粒酶调节细胞分裂及细胞的寿命，参与细胞增殖、分化、衰老等活动，尤其与细胞的癌变密切相关，在正常人胚胎组织中，未分化的神经上皮细胞中有最高的hTR表达，大多数分化高的组织其表达缺乏或降低。

成人组织中，睾丸细胞hTR高表达，淋巴小结中度表达，上皮细胞微弱表达，而且只限于特定的有丝分裂期细胞，神经系统和间质来源细胞无表达［12］。

1995年Feng［13］首次克隆了人端粒酶RNA（hTR）组分，发现反义或突变的RNA结构都可能影响端粒酶的活性，从而抑制肿瘤细胞增殖。

　　国外学者［14］对乳腺癌、卵巢癌、肺癌、膀胱癌、食管癌等进行广泛深入研究。

研究证实反义寡聚脱氧核苷酸对癌细胞的端粒酶活性和细胞增殖均起到了抑制作用，并促进细胞周期改变和诱导细胞发生凋亡。

其作用机制是:

特定反义核酸分子与进入细胞质的mRNA上的特异位点杂交，形成DNA-RNA复合物，抑制mRNA与核糖体的结合，同时激活RNaseH,RNaseH能使mRNA降解，从而使特定的基因不能表达，相应的蛋白质合成受到抑制［15］。

但尚未发现反义寡聚脱氧核苷酸能对卵巢癌HO-8910细胞起同样作用的报道。

　　本实验采用反义hTR转染卵巢癌HO-8910细胞，为减少细胞对反义核酸的降解作用并增加其入胞效率，采用全硫代磷酸修饰其分子。

其中PS-ASODN是根据靶基因序列，以碱基互补配对方式设计而成，因此进入细胞后只能作用于靶基因，而不与非相关基因作用，故针对性强，特异性高且片段短，可以完全被细胞吸收进入细胞核，经硫代修饰后具有很强的抗核酶能力，再经寡聚脱氧核苷酸脂质体转染入卵巢癌HO-8910细胞。

实验结果显示反义寡聚脱氧核苷酸转染细胞后，卵巢癌HO-8910细胞的增殖明显受到抑制、端粒酶活性明显降低，与空白对照组、脂质体组、正义寡聚脱氧核苷酸组比较，差异均有统计学意义互补于hTR模板区的反义寡聚脱氧核苷酸明显抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖及端粒酶活性，作用方式呈时间和剂量依赖性，即随着反义寡聚脱氧核苷酸浓度加大和培养时间延长，抑制作用逐渐增强。

这主要是由于反义寡聚脱氧核苷酸封闭了hTR模板区，阻止了端粒酶合成端粒，从而有效地抑制了卵巢癌HO-8910细胞的增殖；反义寡聚脱氧核苷酸转染卵巢癌HO-8910细胞后，端粒酶活性显着下降。

笔者认为，很可能反义寡聚脱氧核苷酸本身不一定具有调节凋亡的作用，其对凋亡的调节可能是通过改变端粒长度所致，因为端粒长度的维持、染色体的稳定是凋亡的一个抑制因素，而端粒的缩短可触发细胞凋亡。

以上结果说明反义寡聚脱氧核苷酸能够通过抑制hTR基因的表达，抑制卵巢癌HO-8910细胞端粒酶活性，从而达到抑制卵巢癌HO-8910细胞的增殖。

这也为卵巢癌基因治疗提供了新的靶点，结合其他治疗方法有望提高卵巢癌基因治疗的成功率。

　　尽管端粒酶在几乎所有恶性肿瘤都有强阳性表达，而且反义hTR寡核苷酸制剂由于特异性封闭hTR模板区而抑制了端粒酶活性，在肿瘤的治疗方面显示出巨大的潜力。

但对端粒酶阳性的生殖细胞和干细胞所带来的后果不得不引起我们的关注，尤其是生殖细胞，如果针对肿瘤细胞的端粒酶抑制剂同样可以进入人生殖细胞，使其端粒酶失活，后果将是一个种属的灭绝;但也有人持不同的观点，认为正常细胞的端粒较多数肿瘤细胞的长，并且原始干细胞较少进行有丝分裂，其端粒缩短的速度远低于肿瘤细胞，因此端粒酶抑制剂的疗程可在正常细胞的端粒酶耗尽前停止，当抑制端粒酶治疗结束后，正常细胞的端粒酶活性可得到修复。

此外部分肿瘤细胞具有较长的端粒，而随细胞有丝分裂的进行，端粒的缩短是一个缓慢的过程，在这种情况下端粒酶抑制剂是否有效，尚待进一步研究。

　　参考文献

　　［1］李连弟，鲁凤珠,张思维,等.1990-1992年中国恶性肿瘤死亡流行分布情况分析.中华肿瘤杂志，1996，18:

403-407.

　　［2］PalmerJE,SantCassiaLJ,IrwinCJ,et　prognosticandpredictivevalueofsyntacticstructureanalysisinserouscarcinomaofthe　JGynecolPathol,2008,27

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