冰淇淋微生物检验方法.docx

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冰淇淋微生物检验方法

冰淇淋微生物检验方法

一、大肠菌群检验………………………………………………第110页

二、菌落总数的测定……………………………………………第117页

三、嗜冷菌的检测………………………………………………第120页

四、单核细胞增生李斯特氏菌的检验…………………………第120页

五、涂抹检验……………………………………………………第125页

六、空气净度检验………………………………………………第126页

七、水样的检测…………………………………………………第127页

一、大肠菌群检验（依据国标GB/T4789.3-2003）

（一）概念：

大肠菌群：

经37℃24h培养，能发酵乳糖，产酸、产气，需氧或兼性厌气的G-无芽胞杆菌。

该菌主要条件来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中是否有污染肠道致病菌的可能。

食品中大肠菌群数系以100ml（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。

（二）培养基配制：

1.乳糖胆盐发酵管：

成分：

蛋白胨20g

胆盐5g

乳糖10g

0.04%溴甲酚紫水溶液25ml

蒸溜水1000ml

PH7.4

制法：

将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水中，校正PH加入指示剂，分装每管10ml，并放入一个小倒管，115。

C高压灭菌15min。

注：

双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其它成分加倍。

2.乳糖发酵管：

成分：

蛋白胨20g乳糖10g0.04%溴甲酚紫水溶液25ml

蒸溜水1000mlPH7.4

制法：

将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正PH值，加入指示剂，分装3--5ml，并放入一个小倒管，115。

C高压灭菌15min。

3.伊红美蓝培养基：

成分：

　　蛋白胨　　　　　　　10g

　　乳糖　　　　　　　　10g

　　磷酸氢二钾　　　　　2g

　　琼脂　　　　　　17g

　　2％伊红水溶液　　　20ml

0.65％美蓝水溶液　13ml　

蒸馏水　　　　　1000ml

pH为7.1

制法：

　　将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于热蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。

临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50-55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。

（三）大肠菌群检验程序：

（四）操作程序：

1.检样稀释

（1）以无菌操作将检样25ml（g）放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成1:

10的均匀稀释液。

固体检样最好用均质器，以8000-10000r/min的速度处理1min，做成1:

10的均匀稀释液。

（2）用1ml灭菌吸管吸取1:

10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混匀，做成1：

100的稀释液。

（3）另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌吸管。

（4）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。

3.乳糖发酵试验

将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。

每一稀释度接种3管，置36±1℃温箱内，培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。

3.分离培养

将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃温箱内，培养18-24h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实试验。

菌落形态：

Ⅰ紫黑色，有金属色泽

Ⅱ紫黑色，无金属色泽

Ⅲ中心紫黑色，外缘为粉红色

4.证实试验

在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1-2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±1℃温箱内培养24±2h，观察产气情况。

凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。

革兰氏染色：

挑取可疑菌落

灭菌盐水→取菌→火焰上固定→结晶紫染色1min水洗→革兰氏碘液染色1min→水洗→95%乙醇染色30S→水洗→复染液染色1min→水洗→待干→镜检。

大肠菌群采用三步法（初发酵，分离培养和证实试验）

第一步乳糖发酵试验是样品的发酵结果，不是纯菌的发酵试验，所以初发酵阳性管，经平板分离和证实实验后，有时可能成为阴性。

因此，初发酵与证实实验相差较大。

5.报告

根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）大肠菌群的MPN值。

6.注意事项：

（1）乳糖胆盐发酵管内有无倒立小导管，且观察小倒管内是否有气泡。

（2）小导管不能缺裂，口不能被堵。

（3）平板分离：

挑取菌落3~5个。

（4）加样液时要沿管壁缓慢加入，防止小倒管里冲入气泡。

（5）加入样液时一定要混匀。

（五）染色法：

1.美兰染色法：

（1）吕氏美蓝染色液

美蓝0.3g95%乙醇30ml0.01%氢氧化钾溶液100ml

将美蓝溶解于乙醇中，然后于氢氧化钾溶液混合。

（2）染色法

将涂片在火焰上固定，待冷。

滴加染液，染1-3分钟，水洗，待干，镜检。

（3）结果：

菌体呈兰色。

2.革蓝氏染色法：

（1）原理：

G-菌（革兰氏阴性菌）细胞壁厚，细胞壁中脂类化合物多，含肽聚糖少，酒精溶解脂类，细胞壁通透性好，酒精可以碘和结晶紫的复合物溶出，番红进入→红色。

G+菌（革兰氏阴性菌）细胞壁薄，细胞壁中脂类化合物少，含肽聚糖多，细胞壁通透性差，碘和结晶紫的复合物滞留→蓝紫色。

（2）染液的配制：

1）结晶紫染液：

结晶紫1g+95%乙醇20ml+1%草酸铵水溶液80ml，将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

2）革蓝氏碘液：

碘1g+碘化钾2g+蒸馏水300ml，将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，等完全溶解后，再加蒸馏水至300ml。

3）沙黄复染液：

沙黄0.25g+95%乙醇10ml+蒸馏水90ml，将沙黄溶解与乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

（3）染色法：

1）用接菌环取一滴灭菌生理盐水于载玻片上，然后再用灭菌环挑取少量菌种于载玻片上与生理盐水充分混合。

2）涂片自然干燥或在火焰上固定，滴加结晶紫，染1分钟水洗。

3）滴加革蓝氏碘液，作用1分钟，水洗。

4）滴加95%乙醇脱色，约30秒；或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10秒。

5）水洗，滴加复染液，复染1分钟。

水洗，待干，镜检。

（3）结果：

革蓝氏阳性菌呈紫色。

革蓝氏阴性菌呈红色。

附：

大肠菌群最可能数（MPN）检索表

阳性管数

MPN

100mL（g）

95%可信限

1ml（g）×3

0.1ml（g）×3

0.01ml（g）×3

下限

上限

0

0

0

0

0

0

0

0

0

1

2

3

＜30

30

60

90

＜5

90

0

0

0

0

1

1

1

1

0

1

2

3

30

60

90

120

＜5

130

0

0

0

0

2

2

2

2

0

1

2

3

60

90

120

160

0

0

0

0

3

3

3

3

0

1

2

3

90

130

160

190

1

1

1

1

0

0

0

0

0

1

2

3

40

70

110

150

＜5

10

200

210

1

1

1

1

1

1

1

1

0

1

2

3

70

110

150

190

10

30

230

360

1

1

1

1

2

2

2

2

0

1

2

3

110

150

200

240

30

360

1

1

1

1

3

3

3

3

0

1

2

3

160

200

240

290

2

2

2

2

0

0

0

0

0

1

2

3

90

140

200

260

10

30

360

370

2

2

2

2

1

1

1

1

0

1

2

3

150

200

270

340

30

70

440

890

2

2

2

2

2

2

2

2

0

1

2

3

210

280

350

420

40

100

470

1500

2

2

2

2

3

3

3

3

0

1

2

3

290

360

440

530

3

3

3

3

0

0

0

0

0

1

2

3

230

390

640

950

40

70

150

1200

1300

3800

3

3

3

3

1

1

1

1

0

1

2

3

430

750

1200

1600

70

140

300

2100

2300

3800

3

3

3

3

2

2

2

2

0

1

2

3

930

1500

2100

2900

150

300

350

3800

4400

4700

3

3

3

3

3

3

3

3

0

1

2

3

2400

4600

11000

≥24000

360

710

1500

13000

24000

48000

注：

（1）本表采用3个稀释度（1ml（g）、0.1ml（g）、0.01ml（g）），每稀释度3管。

（2）表内所列检样量如改用10ml（g）、1ml（g）、0.1ml（g）时，表内的数字应相应降低10倍，如改用0.1ml（g）、0.01ml（g）、0.001ml（g）时，则表内数字应相应增加10倍。

其余可类推。

二、菌落总数的测定（依据国标GB/T4789.2-2003）

（一）概念：

菌落总数：

是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分培养温度和时间、PH值、需氧性等）所取1ml（g）检样中所含菌落的总数。

主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌对食品被污染程序的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。

（二）培养基：

营养琼脂:

成分：

蛋白胨10g

牛肉膏3g

氯化钠5g

琼脂15-20g

蒸馏水1000ml

制法：

将除琼脂以外的成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2ml校正PH至7.2-7.4。

加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。

分装烧瓶，121。

C高压灭菌15分钟。

（注：

现化验室用直接配制好的营养琼脂混合物）

（三）操作步骤：

（1）以无菌操作，将检样25g（25ml）剪碎放于含有225ml，灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内，经充分振摇或研磨做成1：

10的均匀稀释液。

固体检样最好用均质器，以8000-10000r/min的速度处理1min，做成1:

10的均匀稀释液。

（2）用1ml灭菌吸管吸取1：

10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管，混合均匀，做成1：

100的稀释液。

（3）另取1ml灭菌吸管，按上面操作顺序，做10递增稀释液，如此每增加一次，即换用1支1ml灭菌吸管。

（4）根据样品卫生标准要求或对样本污染情况进行估计，选择2-3个适宜稀释度，分别在做10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。

（5）稀释液移入平皿后，应及时（从检样稀释到倾注平板不超过20min）将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿内15ml，并转动平皿使混合均匀。

同时，将营养琼脂培养基倾入不加有1ml稀释液的灭菌平皿内作空白对照。

（6）待琼脂凝固后，翻转平板，置36±1℃温箱内培养48±2h。

注意事项：

（1）操作要快而准，包括材料、加样、倒培养基。

（2）吸液体时液体不能进入吸头。

（3）样品稀释时一定要混匀。

（4）倒培养基前，瓶口要过火焰。

（5）一定要有空白对照。

（6）培养基温度控制，培养基薄厚。

（7）检测时一定要使平皿完全暴露于空气中。

2、检测完要迅速进行培养。

（四）菌落计数的方法

（1）平板菌落数的选择

选取菌落数在30—300之间的平板作为菌落总数测定标准，一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌数生长时，则不宜采用，应以无片状菌数生长的平板柞为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2代表全皿菌落数，平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线）若仅有一条链，可视为一个菌落，如有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。

（2）稀释度的选择

1应选择平均菌落数在30~300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告。

2若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30~300之间，则视两者之比如何来决定，若其比值小于或等于2，应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的数字。

3若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应以稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告。

4若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落乘以稀释倍数报告。

5若所有稀释度无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

6若所有稀释度的平均落菌数均不在30~300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300平均菌落数乘以稀释倍数。

（3）菌落数的报告

菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时采用两位有效数字，在两位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数，也可以用10的指数来表示。

（见下表）

稀释度选择及菌落数报告方式

例次

稀释液及菌落数

两稀释液之比

菌落总数（cfu/g或ml）

报告方式

（个/g或ml）

10-1

10-2

10-3

1

多不可计

164

20

—

16400

16000或1.6×104

2

多不可计

295

46

1.6

37750

38000或3.8×104

3

多不可计

271

60

2.2

27100

27000或2.7×104

4

多不可计

多不可计

313

—

313000

31000或3.1×105

5

27

11

5

—

270

270或2.7×102

6

0

0

0

—

＜1×10

＜10

7

多不可计

305

12

—

30500

31000或3.1×104

三、嗜冷菌的检测

（一）培养基：

CVT培养基配制：

成分：

酵母浸膏2.5g，蛋白胨5.0g，结晶紫0.002g，琼脂条冬季加15g、夏季加20g，TTC0.05g，葡萄糖1.0g，蒸馏水1000ml。

制法：

在未加琼脂条和指示剂前、在室温下用4%的氢氧化钠调PH=7.0，溶解后，再15P，20分钟条件下高压灭菌。

（二）操作步骤：

1.以无菌操作称取检样25g（或25ml），放入含有225ml灭菌水的三角瓶中，振摇30min，即为1：

10稀释液。

2.用灭菌吸管吸取1：

10稀释液1ml注入含有9ml无菌生理盐水的试管中，即为1：

100稀释液。

依此类推，做成稀释倍数为1：

1000和1：

10000的稀释液，做一次递减稀释液换一次吸管。

3.用无菌管吸取1ml1：

1000的稀释液于灭菌平皿中，作2个平皿；再吸取1：

10000的稀释液1ml于灭菌平皿中，作2个平皿。

1.将凉至45。

C左右的嗜冷菌培养基（最好是CVT培养基）注入平皿中，待凝固后，倒置于7~10。

C冰箱中，培养10天后开始计数。

（三）菌落计数方法：

见国标GB/T4789.2-2003菌落总数的测定中7.3菌落计数的报告（即菌落总数记数方法）。

（四）菌落形态：

呈红色或紫色。

四、单核细胞增生李斯特氏菌的检验（依据国标GB/T4789.29-2003）

1培养基：

1.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）

1.1.1成分：

胰胨17g，多价胨3g，酵母膏6g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000mL

1.1.2制法：

将上述各成分加热搅拌溶解，调至PH7.2~7.4，分装，121℃高压灭菌15min，备用。

1.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSA-YE）

1.2.1成分：

胰胨17g，多价胨3g，酵母膏6g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL

1.2.2制法：

将上述各成分加热搅拌溶解，调至PH7.2~7.4，分装，121℃高压灭菌15min，备用。

1.3EB增菌液

1.3.1成分：

胰胨17g，多价胨3g，酵母膏6g，氯化钠5g，磷酸氢二钾2.5g，葡萄糖2.5g，蒸馏水1000mL，盐酸丫啶黄15mg/L，萘啶酮酸40mg/L

1.3.2制法：

除盐酸丫啶黄和萘啶酮酸外，其余成分加热混合，调PH至7.2~7.4，分装，121℃高压灭菌15min。

使用前加盐酸丫啶黄15mg/L和萘啶酮酸40mg/L，此两种成分要无菌配制或过滤除菌。

1.4李氏增菌液（LB1，LB2）

1.4.1成分：

胰胨5g，多价胨5g，酵母膏5g，氯化钠20g，磷酸二氢钾1.35g，磷酸氢二钠12g，七叶苷1g，蒸馏水1000mL

1.4.2制法：

将上述各成分加热溶解，调PH至7.2~7.4，分装，121℃高压灭菌15min。

1.4.2.1李氏Ⅰ液（LB1）200mL加入：

1%萘啶酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）0.45mL

1%盐酸丫啶黄（用灭菌蒸馏水配制）0.27mL

1.4.2.2李氏Ⅱ液（LB2）200mL加入：

1%萘啶酮酸（用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制）0.40mL

1%盐酸丫啶黄（用灭菌蒸馏水配制）0.50mL

无菌分装于10mL大试管中。

1.5三糖铁（TSI）琼脂：

GB/T4789.28-2003中4.26、27。

1.5.1成分

蛋白胨20g,牛肉膏5g,乳糖10g,蔗糖10g,葡萄糖1g,氯化纳5g,

硫酸亚铁铵[Fe（NH4）2（SO4）2•6H2O]0.2g,硫代硫酸钠0.2g,琼脂12g,

酚红0.025g,蒸馏水1000mL,pH7.4

1.5.2制法

将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH。

加入琼脂，加热煮沸，以溶化琼脂。

加入0.2%酚红水溶液12.5ml，摇匀。

分装试管，装量宜多些，以便得到较高的底层。

121 ℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。

1.6SIM动力培养基

1.6.1成分：

胰胨20g，多价胨6g，硫酸铁铵0.2g，硫代硫酸钠0.2g，琼脂3.5g，蒸馏水1000mL

1.6.2制法：

将上述各成分加热混合，调PH至7.2，分装小试管，121℃高压灭菌15min。

1.7血琼脂：

GB/T4789.28-2003中4.6。

1.7.1成分:

豆粉琼脂（PH7.4~7.6）100mL,脱纤维羊血（或兔血）5~10mL

1.7.2制法:

加热溶化琼脂，冷却50℃,以灭菌手续加入脱纤维羊血,摇匀,倾注平板.亦可分装灭菌试管,置成斜面.亦可用其他营养丰富的基础培养基配制血琼.

1.8改良的McBride（MMA）琼脂

1.9硝酸盐培养基：

GB/T4789.28-2003中3.17。

1.9.1成分：

硝酸钾0.2g，蛋白胨5g，蒸馏水1000mL，PH7.4。

1.9.2制法：

熔解，校正PH，分装试管，每管约5mL，121℃高压灭菌15min。

1.9.3硝酸盐还原试剂：

甲液：

对氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/l乙酸溶液100mL中。

乙液：

甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/l乙酸溶液100mL中。

1.9.4试验方法：

接种后在36±1℃培养1~4天，加入甲液和乙液各一滴，观察结果。

硝酸盐还原为亚硝酸盐时于于立刻或数分钟内显红色。

注：

本试验阴性原因有三:

细菌不能还原硝酸盐；亚硝酸盐继续分解，生成氨和氮；培养基不适于细菌的生长。

如欲检查培养基中硝酸盐是否未被分解，可再加入锌粉少许，可使硝酸盐还原为亚硝酸盐而呈现红色。

1.10缓冲葡萄糖蛋白胨水：

GB/T4789.28-2003中3.4。

1.10.1成分：

磷酸氢二钾5g、多胨7g、葡萄糖5g、蒸馏水1000mL、PH7.0。

1.10.2 制法：

加热熔解，校正pH。

分装试管， 每管1mL，121℃高压灭菌15min。

1.11糖发酵培养基：

GB/T4789.28-2003中3.2。

1.11.1成分：

牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠3g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2g，0.2%滇麝香草酚蓝溶液12mL，蒸馏水1000mL，pH7.4

1.11.2制法：

1.11.2.1葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5%加入葡萄糖，分装于有一个倒置小管的小试管内，121℃高压灭菌15min。

1.11.2.2其他各种糖发酵管可按上述成分配好后，分装每瓶100mL，121℃高压灭菌15min。

另将各种糖类分别配好10%溶液，同时高压灭菌。

将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。

注：

蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

1.11.3试验方法：

从琼脂斜面上挑取小量培养物接种，于36±1℃培养，一般观察2～3d。

迟缓反应需观察14～30d。

1.12Rustigian尿素培养液：

GB/T4789.28-2003中4.38。

1.12.1成分：

尿素20.0g，酵母浸膏0.1g，磷酸二氢钾0.091g，磷酸氢二钠0.095g，酚红0.01g，蒸馏水1000mL

1.12.2制法：

将上述成分于蒸馏水中溶解，校正PH为6.8±0.2。

不要加热，过滤除菌，无菌分装于灭菌小试管中，每管约为3mL。

1.131%盐酸丫啶黄溶液：

用灭菌蒸馏水配制

1.141%萘啶酮酸钠盐溶液：

用0.05mol/L氢氧化钠溶液配制

2操作步骤：

2.1样品的收集及处理

　　无菌取样品25g（mL）放灭菌均质器中加225mLEB和LB增菌液中，充分搅拌成均质。

如不能及时检验，可暂存4℃冰箱。

2.2增菌培养

EB增菌液放30±1℃培养48h，LB1增菌液225mL放30±1℃培养24h，吸0.1mL，加入10mLLB2增菌液中二次增菌。

2.3分离培养

　　将EB增菌液和LB2二次增菌液，分离于选择培养基MMA琼脂平板上，培养30±1℃48h，调取可疑菌落，在白炽灯45º角斜射光照射平板，李斯特氏菌的菌落为灰蓝或蓝色，小的圆形菌落。

2.4选5个以上的上述可疑菌落接种三糖铁（TSI）琼脂和SIM动力培养基，培养于25±1℃，观察是否有动力，且成伞状或月牙状生长。

一般观察2~7天，阳性者可做下一步鉴定。

2.5纯培养

将上述有动力、形成伞状者并在三糖铁琼脂培养基上层、下层的产酸而不产生硫化氢的可疑培养物接种于胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA-YE）上纯培养，做以下鉴定。

2.6染色镜检

将上述可疑纯培养物做革兰氏染色并做湿片检查；李斯特氏菌为革兰氏阳性小杆菌，大小为（0.4~0.5m）х（0.5~2