EPC10膜片钳放大器的使用.docx
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EPC10膜片钳放大器的使用
EPC10膜片钳放大器的使用
东乐科技有限公司技术部主任刘振伟
一、概述
德国HEKA公司生产的EPC（Extracellularpatchclamp）系列放大器的早期型号为EPC5，这是世界上最早的膜片钳放大器。
此后陆续升级为EPC7、EPC8、EPC9和EPC10，EPC9和EPC10为全电脑控制的膜片钳放大器。
目前EPC放大器的最高版本为EPC10膜片钳放大器（截至到2011年7月），有EPC10USB和EPC10Plus两大类机型。
本文讲解EPC10USB的使用。
EPC10USB膜片钳放大器主要有如下应用：
●单通道记录：
可记录亚pA级的单离子通道电流。
●低噪声全细胞膜片钳记录、电压钳/电流钳/低频电压钳（LFVC）记录：
可记录全细胞膜各种离子通道电流、细胞动作电位等。
●传统细胞内记录：
可记录动作电位、细胞放电等。
●使用金属电极的场电位记录：
如整体动物与脑片的诱发场电位记录。
●突触长时程增强（LTP）/长时程抑制（LTD）记录：
整体动物与脑片的LTP/LTD记录。
●松散封接记录、人工脂膜离子通道、纳米孔等的记录：
放大器探头有足够的大电流测量能力，最大可测量2μA的电流。
●离子选择性测量：
采用离子选择性电极检测溶液中某一离子浓度。
●电化学检测（伏安法/安培测量法）：
如采用碳纤电极的细胞或膜片安培测量法，检测细胞某些物质的释放。
●细胞胞吞/胞吐或突触递质释放的研究：
采用膜电容测定法，可测量因细胞胞吞、胞吐或突触递质释放所引起的全细胞膜电容的微小变化。
EPC10膜片钳放大器具有如下显著特点：
●仪器面板的各个功能钮/键均为计算机控制，所有操作均在程序面板中通过鼠标与键盘进行。
●面板程序可在PC机（Windows2000\XP\Vista操作系统）和苹果机（MacOS10.4及以上版本操作系统）上运行。
●放大器本底噪声小于90fA。
●探头有三种反馈电阻，可测量的最大电流分别为200pA（50GΩ）、20nA（500MΩ）、2μA（5MΩ），测量范围满足绝大多数电生理实验信号的要求。
●电极电容（快电容）和膜电容（慢电容）补偿可自动进行。
●液接电位实现了自动校正，无需其他常见膜片钳放大器的手工计算与校正。
●具有Lock-in放大器功能，可对膜电容微小变化进行精确检测，用于与膜面积有关的细胞分泌等的研究。
●通过软件扩展功能，可进行离子浓度荧光检测，实现光电联合检测。
EPC10USB主要具有如下四种机型：
1）EPC10USB：
含有一个探头，为一台膜片钳放大器。
2）EPC10USBDouble：
含有两个探头，为两台组合在一起的EPC10放大器。
3）EPC10USBTriple：
含有三个探头，为三台组合在一起的EPC10放大器。
4）EPC10USBQuadro：
含有四个探头，为四台组合在一起的EPC10放大器。
上述任何一种机型在机箱内都包含一个LIH8+8AD/DA转换器，提供4个DA输出通路，满足每个放大器同时输出刺激的需要；同时提供8个独立的AD通路，满足独立的放大器对电流、电压信号的输入。
对于含有多个放大器的EPC10USB机型，可通过放大器软件面板选择某一放大器，使其激活。
被激活的放大器可接受软件设置的命令，并在放大器面板上通过DigitalBus绿灯显示，当有软件命令输出给放大器时，DigitalBus灯会闪烁。
未被激活的放大器不能接受命令信号，但只要选择上，仍然可随时被激活。
以下介绍的是EPC10USB。
二、探头
（一）探头特点
（1）EPC10的探头呈狭窄长条形，体积较小，这样设计的目的是为了在有限的显微镜工作距离下，便于记录电极的操作。
（2）探头表面有探头的序列号，如果是Double机及以上机型，探头表面还有“Probe2”等字样。
（3）底部有能固定在微操纵器上的塑料底座适配器，可与绝大多数类型的微操纵器直接进行匹配。
在购置某些微操纵器时，要注意选择与探头匹配的适配器。
（4）探头内部有一个电流-电压转换器（Current-to-voltageconverter），即摄入电流，输出电压。
这与一般的微电极放大器探头不同，后者摄入和输出的均为电压。
（5）探头具有5MΩ、500MΩ和50GΩ三种反馈电阻，分别用于记录双分子层膜、松散封接模式、大细胞等的大电流（～2μA），一般的全细胞电流（～20nA）和单通道电流（～200pA）。
（二）探头连线
（1）信号输入端口：
用聚四氟乙烯（Teflon，白色）绝缘的BNC插口，与电极夹持器（Holder）直接连接。
（2）地线连接口（GND）：
为黑色插孔，承载高质量接地信号，用于将浴池（参比）电极接地，也可用于将探头附近的物体（如显微镜）、屏蔽设施等接地。
该接地口通过探头电缆线与放大器前面板上的信号地（SignalGND）相连通。
（三）探头使用注意事项
●在放大器开启的情况下，应尽量避免用手直接触碰信号输入端口，否则可能由于手上带有静电而损伤探头内部电路！
在更换玻璃电极时，若一定要触碰信号输入端口，请一定先除去手上的静电（通过触摸其他金属物体，如屏蔽网等），再触碰信号输入端口。
●若由于探头损坏而更换探头，则需要在连接新探头后对放大器进行校正，方法为：
开启EPC10，预热30min后，放大器与探头均处于正常工作的温度。
打开Patchmaster软件的EPC10_USB菜单，选择TestandCalibrate条目，即可对EPC10放大器进行全方位校正。
校正的内容包括放大器软件面板上所有的数码开关和控制按钮，这些结果仅是针对正在被校正的放大器的，不适用于其他EPC10放大器。
校正的结果可存储为Scale.epc文件。
该校正应该每隔半年进行一次，如果发现放大器的频响不准确或者偏移比较明显时，应随时进行校正。
校正过程耗时5-10min，依计算机的速度而异。
放大器校正后，再用Re-InitializeEPC10_USB功能对放大器进行初始化。
三、电极夹持器
为了获得低噪声记录，电极夹持器必须直接插入探头中。
不推荐将电极夹持器屏蔽的做法，因这样可引入更多的随机噪声（背景噪声可增加1-2倍），这些随机噪声来自夹持器塑料材质（聚碳酸酯）的非理想化绝缘特性和液体水膜上的热电压波动。
金属的屏蔽物质可使更多的噪声通过电容耦合方式进入放大器探头，尤其是单通道记录更不能屏蔽夹持器。
聚碳酸酯具有低介电损失性，若自己制作电极夹持器，要考虑采用低介电损失的材料，表面要具有疏水性，以防液膜的形成。
聚碳酸酯是目前发现的符合上述特点的最佳材料。
使用电极夹持器时，将银丝（长度一般在4.5cm）焊接在铜针上，后者插入探头BNC插口内。
银丝表面需要镀上AgCl，可用含Cl离子的溶液（如100mMKCl溶液或生理盐溶液）电镀（与铜针焊接处部位的银丝不要电镀）。
电极夹持器的噪声测定：
将含有银丝电极的夹持器插入探头，探头用锡箔纸包裹，采用放大器的NoiseTest功能测量噪声。
良好的夹持器应该只增加噪声10%左右，例如从95到105fA。
四、模型细胞
一般的膜片钳放大器均配备模型细胞，它的用途有如下两个：
（1）用于模拟真实细胞的膜反应，帮助初始者演练放大器各项功能的使用；
（2）用于检测放大器的功能是否正常，如果用模型细胞检测放大器时没有问题，则表明放大器功能是正常的。
与EPC10放大器配备的是MC10模型细胞，它通过BNC适配器与探头信号输入接口连接，通过另一根细线与探头GND接地口连接。
其上有三个位置，通过扳手来选择：
●10M位置：
模拟电极入浴液，电极电阻为10MΩ。
可模拟进行施加测试脉冲和补偿失调电位（如液接电位等）。
●中间的位置：
模拟电极与细胞膜形成高阻封接，电极电容（及其他漂浮电容）为6pF。
可模拟进行电极电容（C-fast）的补偿功能。
●0.5G位置：
模拟形成了全细胞记录模式，串联电阻为5.1MΩ，膜阻抗为500MΩ（0.5GΩ），膜电容为～22pF。
可模拟进行膜电容（C-slow）的补偿功能和电流钳模式，还可用于检测软件Patchmaster编辑输出的刺激脉冲。
五、仪器面板
（一）前面板
1.PowerSwitch
电源开关。
为让放大器能正确地初始化，一般是要先开启放大器电源开关，再打开采样软件（Patchmaster或TIDA）。
当然，在忘记先开启放大器时，也可通过采样软件重新对放大器进行初始化。
注意，在开始实验前，放大器需要预热至少15分钟。
2.Probe
用于连接探头。
3.ChassisGnd（CHAS）
EPC10放大器的机壳地。
与大多数仪器一样，该机壳地与电源地相连通。
为避免形成地线环路，在放大器设计上，信号地与机壳地之间不直接连通，而是中间连接了一个10Ω的电阻。
4.ExternalStim.InputCC
外部来源的电压刺激信号从这里输入，放大器会根据需要设定的比例转化为刺激电流，
可与放大器内部的电流刺激信号叠加，用于电流钳模式。
5.ExternalStim.InputVC
外部来源的电压刺激信号从这里输入，它们可与放大器内部的电压刺激信号叠加，用于电压钳模式。
叠加的刺激信号通过2极滤波器滤波，以去除电压变化初始与结束时产生的跃迁，这避免了刺激命令处理电路出现非线性特性，同时也降低了电极电容快速充电时产生的电流瞬变值幅度。
软件提供两个滤波等级（用10-90%瞬变值幅度上升时间表示）：
2μs（是防止放大器内部电路出现非线性化所需的最小上升时间）和20μs（最适合于那些除了最快速测量以外的所有测量，用于降低电容瞬变值幅度）。
6.VoltageMonitor
将电极上的电压输出给监视系统（如示波器），该电压是将输出给电极的电压放大了10倍。
该输出的阻抗为50Ω。
在Patchmaster的示波窗口中可显示原始的未被放大的信号。
7.CurrentMonitor
输出电极电流，该信号经过了在放大器软件面板中所设置的滤波器滤波。
正电压与从电极输出的电流相对应。
通常，左手边的输出（Filter1）是经过放大器软件面板中Filter1滤波后的输出，可输出给数据记录装置（如磁带记录仪等），用于记录宽频信号，如可记录单通道活动。
右手边的输出（Filter2）是经过放大器软件面板中Filter2额外滤波后的输出，用于输出给示波器，监视整个实验过程（如封接、破膜等）。
上述任何一种输出都可在软件Patchmaster的示波窗口中显示。
8.SignalGND
为香蕉插口，是高质量的信号地，可用做膜片钳系统中其他仪器的公共地。
9.Clipping
这是一个二极管指示灯，当放大器输入电流饱和时该指示灯亮。
在电压钳实验中，电容充放电伪迹将被电脑去除，而去除过程只有在不出现饱和的情况下完成，该指示灯起到这样一个监督的作用。
特别地，虽然通过滤波后输出的电压没有达到饱和，但如果滤波前输出的电压是饱和的，则该指示灯也会指示饱和！
10.DigitalBus
该指示灯显示计算机正发送数码信息到EPC10放大器。
11.A/DInputs
放大器内设的转换器（EPC10采用LIH1600，EPC10USB采用LIH8+8）提供8个模拟/数码（A/D）输入通道，其中3个在仪器内部与EPC10连接（若使用EPC10Double或EPC10Triple，则分别有5或7个与放大器在内部连接）。
剩余的输入通道可提供给其他应用程序软件，如Patchmaster可利用这些通道监测从温度传感器、压力传感器或其他传感器的输出。
12.TriggerIn
外部触发信号输入口。
当在采样软件Patchmaster中的PulseGenerator选择TriggerSeries或TriggerSweeps时，外部触发信号通过该输入口触发放大器进行数据采集。
13.TriggerOutput
TTL触发输出。
有3个输出，用于使其他设备与膜片钳实验同步化.
14.D/AOutputs
提供3个数码/模拟（D/A）信号输出通道（0-2），它们携带如下信号：
DA-0-Free（C-slowduringCap.Track）
DA-1-Free（G-seriesduringCap.Track）
DA-2–Free
在Patchmaster采样软件的Capacitance-Tracking模式，DA-0和DA-1接口可作为特殊用途的输出口，这可在软件中设定。
如果在EPC10放大器软件面板中执行CapTrack功能，则DA-0将输出C-slow数值，DA-1将输出G-series（=1/R-series）的数值。
上述数值是以电压形式输出的，G-series的转换因子为100nS/V，C-slow的分别是0.5、5或50pF/V（对应于30、100和1000pF范围的电容值）。
DA-2通常用于触发示波器或隔离器。
注意：
（1）当在软件面板中使用Reset时，上述输出的数值将都变为0。
（2）当需要使用软件面板CapTrack功能时，不能将DA-0和DA-1用做触发信号的输出。
（3）这3个接口是输出口，千万不要将刺激信号从这里输入。
（二）后面板
EPC10USB后面板上有2个25针的连接口、1个40针的连接口和4个通信输入器口，用于放大器与其他设备的连接。
1.USB
接计算机USB2.0口，连接放大器软件与EPC10USB主机。
在连接有多个EPC10USB放大器时，为使采集时钟同步化，需要将一个放大器的MASTERSYNC和另一个放大器的SLAVESYNC用标准CAT5网线连接，而且该线要求越短越好。
2.DIGTALIN
从外部设备来的TTL逻辑电路的触发信号输入口，为25针的输入口。
3.DIGTALOUT
TTL逻辑电路的数字信号输出口，为25针的输入口。
用于输出触发信号给其他设备，如给药灌流系统。
第21-23针输出的触发信号也可通过前面板的TRIGGERINPUT/OUTPUT中的OUT0至OUT2输出。
4.DigitalIN/OUT
只用于和HEKA公司的其他设备连接，如连接EPC8或TIB14到EPC10USB放大器。
为40针的输入/输出口。
5.TELEGRAPHINPUTS
4个通信输入器插口，用于将EPC10USB放大器的滤波频率（Frequency）、所测膜电容（Cm）、增益（Gain）大小等信息输出给软件。
6.AUXDAC
辅助数模通路。
7.SOUND
声音输出口。
8.Power
电源线插口，输入电压有90-210V和220-250V两个交流电范围段，可自动调节。
保险丝的规格是1mA。
六、软件面板
（一）主要功能
1.单机与多机
无论单机还是多机，都共用一个LIH8+8型AD/DA转换器。
该转换器提供4个DA通道（可允许同时输出4个刺激信号）、8个AD通道（可同时摄取不同放大器的8个电压或电流信号）。
当前正在激活的放大器可通过仪器前面板上的DigitalBus绿灯在闪亮判断出来。
当使用EPC10Double、Triple或Quadro放大器时，软件面板会显示“1.Amplifier、2.Amplifier，…”等。
点击其中任何一个放大器，则将激活该放大器，显示为红色。
各放大器的设置是互不影响、相互独立的。
2.Gain
电流输出的增益。
数值范围为0.005-2000mV/pA，分为三档：
0.005-0.002、0.5-20和50-2000mV/pA，分别对应于探头5MΩ、500MΩ和50GΩ的反馈电阻，用于记录不同范围大小的电流（见下表）。
当选择不同Gain数值（通过键盘上的上下箭头或拖动鼠标来选择）时，软件会自动选择相对应的探头反馈电阻的大小来通过电流。
低范围的Gain用于双层膜、松散封接膜片和大细胞的实验，在这类实验中，记录的电流比较大（可高达2μA左右），电容补偿可达1nF，可补偿小至10Ω的串联电阻。
中范围的Gain主要用于一般大小的细胞的全细胞记录，记录的电流范围可达20nA，电容补偿可达1000pF，可进行串联电阻补偿和电流钳记录模式，背景噪声比高范围Gain的噪声大，但提供100kHz的频带宽。
高范围Gain用于单通道记录，其噪声极低，但记录的最大电流大约在200pA以内，最大频带宽约为60kHz，但是一些在中范围Gain情况下的功能不能使用（如电容补偿最大为100pF、电流钳模式不能使用等）。
表.EPC10增益Gain的三个范围
低范围
中范围
高范围
Gain（mV/pA）
0.005-0.002
0.5-20
50-2000
对应的反馈电阻大小
5MΩ
500MΩ
50GΩ
电压钳模式能够测量的最大电流
±2μA
±20nA
±200pA
电流钳模式能够输出的最大电流
±100nA
±10nA
---
摄取信号的频带宽（kHz）
100
100
60
C-slow慢电容补偿范围（pF）
30/100/1000
30/100/1000
30/100
是否具有电流钳模式
是
是
否
能否进行串联电阻补偿
能
能
能
适用的记录模式
大电流记录
（双分子层膜、松散封接或大细胞）
全细胞记录
单通道记录
3.ClippingIndicator
当放大器的输入发生饱和时，在Gain的标框处出现一个闪烁的“Clip”，警示电流超载。
这个Clip与放大器前面板上的Clipping灯的功能相同，但它给人的感觉好像比后者更敏感，其实不然，它只是将处于超载的时间显示得长些而已。
4.V-membrane
电压钳模式下，用于设定（双击鼠标左键或单击右键输入）钳制电位（范围为±1,000mV）。
电流钳模式下（显示为I-membrane），用于设定（双击鼠标左键或单击右键输入）钳制电流（范围为±1,000pA）。
如果零电位（该电位下通过电极的电流为零）已经被正确设置，则软件会将液接电位和其他失调电位进行校正，以保证钳制电位的准确性。
5.I-mon
显示实际测量的通过电极的直流电流（基线位置的电流）。
在对液接电位等失调电位进行补偿后，该电流应接近0。
6.V-mon
显示对液接电位等失调电位校正后实际测量的通过电极的电压。
在施加钳制电位（V-membrane）后，则显示钳制电位。
但注意的是，在某些情况下（如在长刺激脉冲期间），V-mon可能会暂时与所设定的钳制电位有些不一致，因为它显示的是钳制电位V-membrane与所设定的刺激脉冲电压之和的平均值。
7.R-memb
在电极进入浴液到形成封接前，R-memb（R-membrane）显示串联电阻Rs（主要为电极电阻）的大小，封接形成后显示封接电阻Rseal的大小，形成全细胞记录模式后则显示细胞膜电阻Rm的大小。
其数值是通过测量基线与测试脉冲后半部分的电流幅度来获得的。
可通过本软件面板下部的“Sound”功能（见后）对R-memb大小进行声音监控。
8.InputADC
在这里选择Patchmaster采样软件示波窗口中可显示的输入信号，包括如下几种：
●F2-EXT：
外部刺激命令，从放大器前面板上的“ExternalStimInputVC”输入，经过滤波器（Filter2）滤波，显示在示波窗口。
●Imon-1：
电流输出1
●Imon-2：
电流输出2
●Vmon：
电压输出
●AD0-4：
任何其他的AD通道
9.RecordingMode
用于选择记录模式，包括InOut（内面向外记录模式）、OnCell（细胞贴附记录模式）、OutOut（外面向外记录模式）、WholeCell（全细胞记录模式）和C-Clamp（电流钳模式）
10.TestPulse
可产生一定幅度（在Amplitude中设定）与频率（在Length中设定脉冲宽度，间接决定了脉冲频率）的测试刺激脉冲施加给细胞，记录电流反应，仅适用于电压钳模式，用于监测封接过程或其他需要给予刺激脉冲来监测一些实验设置参数的情形。
要关闭测试脉冲，可选择其左侧的off；要选择单向脉冲，可选择其左侧的Single。
可通过TestPulse右侧的框选择显示输出脉冲电压还是电流反应或都显示。
11.Amplitude/Length
设定测试脉冲的幅度与持续时间。
测试脉冲幅度的范围为±100mV，持续时间范围为0.1-1000ms。
当脉冲持续时间为1ms时，每个测试脉冲含有100个采样点，即采样间隔时间为10μm。
12.Noise
该功能用于检测放大器的内部噪声和环境噪声，当将探头屏蔽时，检测的是放大器的内部噪声，当将探头裸露时，检测的是环境噪声。
执行该功能时，rms噪声电流被持续检测与更新，此时将没有测试脉冲输出。
rms噪声电流通过当前激活的AD数模通道采集，通常经过Imon2输出，频带宽由Filter2决定。
电流的采样间隔为100μs，获得一个噪声数值需要持时256ms，噪声数值显示在Noise仪表中。
噪声的详细测量方法见“七、功能检测”。
13.LJ（Liquidjunction）
液接电位（mV），该框内需要手工输入液接电位的数值，放大器会根据这个数值对液接电位自动进行校正。
在线校正需要在封接前操作Auto-Vo、输入LJ合适的数值。
如果LJ输入0mV，则放大器将不执行校正功能。
双击鼠标左键输入LJ数值（范围±200mV），可以拖动鼠标改变LJ数值。
LJ数值的计算方法见文献（Neher,E.（1992）Correctionforliquidjunctionpotentialsinpatchclampexperiments.In:
MethodsinEnzymology207,123-131,AcademicPress,NewYork.），用于计算LJ的常见离子迁移率见文献（Barry,P.H.&Lynch,J.W.（1991）Liquidjunctionpotentialsandsmallcelleffectsinpatch-clampanalysis.J.Memb.Biol.121,101-117）。
下表列出了常见溶液与生理盐溶液（140mMNaCl）之间的LJ值。
LJ的极性是生理盐溶液相对于表中溶液的。
注意：
LJ不受Reset按钮功能的影响，也不能用宏命令（macros）设定，这一限定是为了避免LJ的意外变化引起错误的LJ校正。
如果我们用的电极内液和细胞浴液是同一种溶液（且浓度也相同），则LJ应该为0mV。
对于标准的液接电位校正，LJ中输入数值的正负极性应该是浴液相对于电极内液的电位，例如，如果电极内液含有谷氨酸或天门冬氨酸，浴液中含有Cl离子，LJ的极性应该为正（如+10mV）。
点击Auto-Vo，V-membrane将变为-10mV（WholeCell和OutOut模式时）或+10mV（OnCell和InOut模式时），此时LJ得到了准确校正。
在膜片钳实验中，需要考虑的偏移电位主要有放大器偏移电位（范围±30mV）、电极电位（范围±200mV），依赖于玻璃电极内与参比电极附近的Cl离子浓度）、液接电位以及与要研究的细胞膜串联的其他细胞膜的电位（如在细胞贴附式时）。
实验中一些偏
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