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实验讲义电子教案

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵

酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。

一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。

酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。

酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。

此作用即酒精发酵。

C6H12O6（葡萄糖）→2C2H5OH（酒精）+2CO2↑

在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。

而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。

微生物细胞固定化方法主要有三种：

载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。

包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。

目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。

【实验一】

一、酵母菌的分离与培养

一、【实验目的】

学习用选择性培养基分离酵母菌。

二、【实验原理】

大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH值为4.5～6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。

酵母菌生长迅速，在液体培养基中比霉菌生长得快。

利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。

三、【实验仪器和材料】

1、实验材料：

成熟葡萄

试剂：

0.1%吕氏（Loeffier）美蓝染液

配制方法：

A液：

美蓝（methyleneblue,又名甲烯蓝）0.3g,95%乙醇30ml；

B液：

0.0l%KOHl00ml。

混合A液和B液即成，根据需要可配制成稀释美蓝液。

2、培养基：

（1）乳酸豆芽葡萄糖培养液（300ml）：

豆芽（60g）、葡萄糖（6g）,pH值4.5。

配制方法：

　　1）先将豆芽称60g加蒸馏水300ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至250ml左右，制成20%的豆芽汁；

　　2）加入葡萄糖，用乳酸调pH值至4.5左右，然后加蒸馏水定容至300ml；

3）分装9ml于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115℃，20min。

（2）YPG培养基（500ml）：

酵母膏（5g）、蛋白胨（10g）、葡萄糖（10g）、琼脂（10g）、pH值6.5～6.8。

配制方法：

1）称取酵母膏5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，放入500ml烧杯中，然后加入400ml蒸馏水；

2）使用HCl及NaOH调整pH值6.5～6.8，加蒸馏水定容至500ml，再放入琼脂10g；

3）装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。

高压蒸汽灭菌，于115℃，20min，冷却至50-55℃左右时倒入无菌平皿。

3、器材

烧杯、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、纱布、瓷缸、接种环、刮铲、载玻片、显微镜、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片

四、【实验步骤】

1、富集培养（第1天）：

取葡萄皮于90ml无菌水，放置于摇床150rpm，摇晃5min，取出后稍静置。

用无菌枪头吸取上清液1ml接入9ml的乳酸豆芽葡萄糖培养液中，同时做一个不接菌液的空白对照管一起培养。

置28～30℃培养箱中培养20-24小时（第2，3天）。

2、观察：

用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。

活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。

（第2天）

水一碘液浸片的观察：

在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌液放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片。

3、镜检：

取少许富集的菌液观察酵母菌的形态。

（第2天）

4、菌液稀释：

用无菌枪头吸取0.5ml富集菌液，加入装有4.5ml无菌水的试管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，稀释成10-1稀释液。

再用1ml无菌枪头，吸取10-1稀释液0.5ml，移入装有4.5ml无菌水的试管中，吹吸混匀，即成10-2稀释液。

同样做法再一次，做成10-3稀释液。

5、倒平板培养（第2天）：

倒YPG培养基平板，凝固待用。

用无菌枪头分别吸取10-2、10-3浓度的稀释液0.1ml于YPG平板上，用涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀。

平放桌面30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，置28～30℃再培养24h或稍长（过长则霉菌长出）（第3，4天）。

6、纯化：

从长有单菌落的平板中选取典型的酵母菌菌落，用接种环挑取一环的酵母菌，在YPG平板中采用划线分离法分离酵母菌。

并同时制片做纯度检查。

若不纯，应进一步挑取该菌落采用划线分离，直至获得纯培养体为止。

涂片镜检，菌落观察。

（第4，5天）

7、菌种保藏：

将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4℃下保存。

（第4，5天）

五、【注意事项】

1、美兰染色浓度和时间严格掌握；

2、平板培养时间不宜过长，过长则霉菌长出。

六、【思考题】

1、绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。

2、说明观察到的吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间对死活细胞数的影响。

【实验二】

二、发酵菌株的筛选

一、【实验目的】

学习用显色剂及杜氏小管判断各分离酵母菌的发酵能力。

二、【实验原理】

TTC（2，3，5一氯化苯基四氮哇）是一种显色剂，它对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低。

在一定培养基上培养的酵母菌落上覆盖一层TTC显色剂后会显不同颜色，产酒精能力强的酵母菌落成深红色，次之为粉红色。

酵母进行酒精发酵过程会产生CO2，根据杜氏小管中产气多少可以间接判断酵母发酵能力的强弱。

三、【实验材料】

A、培养基

TTC上层培养基:

TTC0.05g、葡萄糖0.5g、琼脂1.5g、水l00ml:

TTC下层培养基:

YPG琼脂。

乳酸豆芽葡萄糖培养液（300ml）：

豆芽（60g）、葡萄糖（6g），乳酸调pH值至4.5。

B、器材

平皿、试管、杜氏小管、接种针

四、【实验步骤】

（l）酵母菌一级筛——TTC法:

将分离得到的各菌株依次接入TTC下层培养基的平皿中，每个平板接8～10株（第4天），培养24h（第5天），长出菌落然后倒入TTC上层培养基，30℃下保温（阴暗处）2～3h。

比较各菌株间的颜色深浅，颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力。

选取原始平板中对应的颜色较深的10～20株菌，作为二级筛的出发菌株。

（2）酵母菌二级筛——杜氏小管观察法

选取上述显色较深的酵母菌落（同时接种一颜色较浅的菌落作为对照），挑取一接种环接入乳酸豆芽葡萄糖培养液中，同时试管内倒置一杜氏小管（第5天），培养24h后（第6天），观察杜氏管中产气情况。

打开棉塞，嗅闻是否有酒精气味。

记录产气及酒精气味情况，并于显色情况进行比较。

根据杜氏小管中产气多少分为5个等级:

（1）“++++”表示杜氏小管中充满气体；

（2）“+++”表示杜氏小管中充满3/4气体；

（3）“++”表示杜氏小管中充满1/2气体；

（4）“+’’表示杜氏小管中充满l/4气体；

（5）“一”表示杜氏小管中没有气体。

五、【注意事项】

1、TTC法筛选要注意避光；

2、放置杜氏小管时，注意把杜氏小管中的气体排干净，不要残留气体。

六、【思考题】

1、列表并对比分析酵母菌落显色深浅与杜氏小管中产气多少之间的关系。

2、使用显色指示剂进行酵母初筛有哪些好处？

【实验三】

三、发酵菌株的鉴定

一、【实验目的】

学习酵母菌的鉴定方法，熟悉使用分子生物学手段进行微生物鉴定。

二、【实验原理】

微生物鉴定是科研及生产过程中非常重要的工作。

可以通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行鉴定。

三、【实验仪器和材料】

A、DNA提取需要配置的试剂

高盐的TEbuffer

终浓度配制50ml

10mMTris.Cl,pH8.00.5ml（1M母液）

0.1mMEDTA,pH8.00.01ml（0.5M母液）

1MNaCl1.8g

室温可保存几年

CTAB提取液

终浓度配制200ml

2%（W/V）CTAB4g

100mMTris.Cl,pH8.020ml（1M母液）

20mMEDTA,pH8.08ml（0.5M母液）

1.4MNaCl10.22g

室温可保存几年

10×CTAB/NaCl溶液（10%CTAB/0.7MNaCl）

在80mlH2O中溶解4.1gNaCl，缓慢加入10gCTAB，同时加热并搅拌。

如果需要，可加热至65℃溶解。

定容至100ml。

其它化学试剂：

异丙醇、乙醇、液氮、Taq酶、dNTPs、引物。

B、仪器

移液枪（10、100、1000μl）,0.2mlPCR管，枪头，2mleppendorf管，饭盒。

四、【实验步骤】

1.形态学鉴定：

（第7天）

A．菌落形态观察

按普通微生物实验指导书观察所分离的真菌菌落特征。

B.细胞形态学观察

按普通微生物实验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察并绘制细胞形态图。

2.分子生物学鉴定：

（1）酵母DNA的提取（CTAB法提取真菌基因组DNA）（第7,8天）

1）取少量酵母菌落连同部分培养基一起放入研钵中，加入液氮粉碎，然后加入800μl2%65℃保温的2×CTAB抽提液，混匀，65℃保温30～60min。

2）加入800μl的氯仿/异戊醇（24：

1），轻缓颠倒混匀，10000r/min，离心5min。

3）取上清（约600μl），加入1/10体积（约60μl）的65℃的CTAB/NaCl溶液，颠倒混匀。

4）用等体积（约600μl）的氯仿/异戊醇（24：

1）抽提，10000r/min，离心5min。

5）取上清（约450μl），加入0.8V的异丙醇沉淀核酸，颠倒混匀，（如沉淀可见，继续做下步，否则，-20℃保温10~20min）。

6）4℃，12000r/min，离心10min。

7）去上清，用高盐的TEbuffer重悬（约100μl）。

（可65℃保温30min，至大部分溶解）。

8）加入0.8体积的异丙醇沉淀核酸，充分混匀（如没有沉淀，-20℃保温10~20min），4℃，12000r/min，离心15min。

9）去上清，70%乙醇洗涤沉淀，干燥，用尽可能少的TEbuffer重悬（30~60μl）。

（2）DNA质量检测（第7,8天）

以1%琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA大小及提取质量；紫外分光光度计法检测DNA纯度（将DNA稀释50倍后分别测OD260和OD280，并计算OD260/OD280的比值）。

DNA浓度计算：

（3）PCR扩增（第9天）

核糖体DNA普遍存在于生物中,真核生物的核糖体RNA中包括26S、18S、5.8S和5S4种不同沉降系数的核糖体RNA片段,它们分别对应的基因片段既具有遗传上的相对稳定性,同时由于各种原因具有一定的突变,使它们作为一种良好的生物分类鉴定材料得到广泛的重视。

早期一般选取大小适中的18S序列作为鉴定的标准,随后26S的D1/D2区序列和ITS序列也被用于应用于鉴定工作中（图1）。

本实验使用ITS序列进行鉴定，包括ITS1和ITS2两个转录间隔区。

PCR反应引物使用ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）。

图1真核生物钟编码核糖体的序列（5'-3'）

取一PCR管，按下述PCR体系加入PCR扩增所需的试剂：

ddH2O

10×PCRbuffer（withoutMgCl2）

MgCl2（25mM）

dNTP（10mM）

5’primer（10mM）

3’primer（10mM）

Template（50-500ng/μl）

TaqDNApolymerase（5U/μl）

34.6μl

5μl

4μl

1μl

2μl

2μl

1μl

0.4μl

Total

50μl

将上述加样后的PCR管放到小离心机低速甩一下，放入PCR扩增仪进行扩增。

扩增反应程序按如下设定：

94℃预变性5min

94℃变性30sec

52℃退火30sec40个循环

72℃延伸60sec

72℃延伸5min

4℃保温（到达此温度时停止PCR扩增，将PCR管取出）

（4）PCR扩增检测

以1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增是否有所想要的大小的目标条带，大概浓度如何。

（5）测序

将符合要求的样品（选5-6个），按公司测序订单要求填写。

（测序一般可以分为将PCR扩展目标DNA连接到T载体上和直接利用PCR产物测序两种方法，本方法采用直接利用PCR产物测序，需要自己提供测序引物）

（6）生物信息学分析方法演示（第10天）

使用软件Bioedit除去测序不可靠部分及无用的部分，然后登陆NCBI网站，进行在线比对分析。

五、【注意事项】

1.PCR扩增时PCR反应缓冲液，特定公司的特种型号的Taq酶会自带自己所需的PCR反应缓冲液，不同的公司的产品（Taq酶与PCR反应缓冲液）之间一般不可以混用；

2.观察PCR反应缓冲液是否包含Mg2+，如果包含，则不需要另加入；如果不包含，则必须加入。

六、【思考题】

进行微生物物种鉴定时为什么使用不同的鉴定方法综合进行鉴定？

【实验四】

四、酿酒酵母细胞PVA-海藻酸钠固定化技术

一、【实验目的】

（1）了解细胞固定化的原理和方法

（2）学习和掌握酵母细胞的固定化的方法

二、【实验原理】

在微生物胞内酶的生产和应用中，由于要进行细胞破碎和酶的分离纯化等操作，提取的酶往往活性和稳定性都大受影响。

如果将微生物细胞固定化后，既免除了复杂的细胞破碎、酶提取和醇化过程，而且酶活性和稳定性也得到较大提高，更可以作为固体催化剂在多步酶促反应中应用并进行连续操作。

微生物细胞固定方法主要有三种：

载体结合法，交联法和包埋法。

PVA-海藻酸盐是包埋法中常用的一种，即将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性载体的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。

三、【实验仪器与材料】

1、培养基：

（1）酵母膏0.15g，葡萄糖20g，（NH

）2SO40.2g，K2HPO4•3H2O1g，MgSO4•7H2O0.25g，pH值7.0，去离子水定容至1000ml，115℃灭菌15min。

（2）葡萄糖培养液：

酵母膏0.15g，（NH4）2SO40.2g，无水葡萄糖20g，K2HPO4•3H2O1g，MgSO4•7H2O0.25g，pH值为6.5～6.8，蒸馏水定容至1000ml，115℃灭菌20min。

2、试剂：

1）2%CaCl2溶液，121℃灭菌15min。

2）聚乙烯醇PVA-海藻酸钠混合胶（第2天）：

称量PVA8g、海藻酸钠2g放入100ml去离子水中，沸水浴加热溶解，并室温下密封存放24h后使用。

3、器材：

250ml烧杯，平皿，试管，无菌的250ml、500ml三角瓶，注射器

四、【实验步骤】

1、菌种活化：

挑取酵母菌斜面菌种一环，接1环斜面菌苔于装有20mL培养基的150mL三角瓶中活化，置于恒温摇床内，150r/min培养24h，25℃培养30h。

然后按10%接种量进行扩大培养，将扩大培养后的菌液10000r/min，离心15min，倾去上清液，用0.85%生理盐水离心洗涤3次，再将其用0.85%生理盐水制成菌悬液，酵母数控制在108个/ml。

（第3天）

2、固定化：

聚乙烯醇PVA-海藻酸钠混合胶于无菌烧杯中加热融化，冷却至45℃左右。

酵母菌液（预热至35℃左右）与聚乙烯醇PVA-海藻酸钠按1:

4比例（v/v）混合均匀后，制备固定化细胞。

用注射头直径为2ml注射器以恒定速度滴到250ml三角中，瓶中预先盛有50ml的含2%CaCl2溶液使形成凝胶珠。

（第5天）

3、待凝胶珠在溶液中浸泡0.5-6h；置于温度4℃，过夜平衡。

然后取100粒凝胶珠加入150ml无菌葡萄糖培养液中，置25℃下发酵7-9d。

发酵结束后品尝其口味，测定其酒精含量（第13-15天）。

4、固定化颗粒强度测试：

挑选50个颗粒均匀的固定化小球，放于500ml的烧杯中，加水100ml。

以500～3000r/min的速率搅拌5min，观察小球的直径变化和破损情况,以此来描述小球的强度。

（第7天）

5、颗粒膨胀性测定：

取数粒大小均匀的固定化小球在4℃的去离子水中浸泡24h，用游标卡尺测量浸泡前后的颗粒平均直径的变化，计算颗粒的膨胀性。

（第8天）

五、【注意事项】

1、聚乙烯醇PVA-海藻酸钠混合胶先室温下密封存放24h后，再与微生物混合，颗粒成形后再冷藏，可以在一定程度上进一步改善颗粒的性能、抑制颗粒的吸水膨胀性。

2、聚乙烯醇PVA-海藻酸钠混合胶要水浴或者微火加热溶解，待温度降低后再与酵母菌液混合，防止烫死细胞。

六、【思考题】

实验中海藻酸钠和CaCl2的作用是什么？

【实验五】

五、酿酒酵母的酒精发酵

一、【实验目的】

（1）了解酒精发酵的主要类型及其控制条件

（2）掌握酒精发酵的操作方法

二、【实验原理】

在厌氧条件下，己糖分解为乙醇并放出二氧化碳的作用，称为酒精发酵作用。

酒精发酵的类型分为三种：

即通过EMP途径的酵母菌酒精发酵、通过HMP途径的酵母菌酒精发酵,通过ED途径的酵母菌酒精发酵。

酵母菌通过EMP途径分解己糖（如葡萄糖）生成丙酮酸，在厌氧条件下和微酸性条件下，丙酮酸继续分解为乙醇。

因此，如果酵母菌要进行酒精发酵，就必须控制发酵液处于微酸性条件。

三、【实验仪器与材料】

1、菌种材料：

酿酒酵母

2、酒精发酵培养液：

红糖100g，（NH4）2SO42.0g，KH2PO41.0g，pH自然，去离子水定容至1000ml,。

150ml小三角瓶装上述培养基50ml，250ml三角瓶装100ml，大试管中装10ml，包扎，115℃灭菌30min。

3、溶液或试剂：

10%H2SO4，1%K2Cr2O7，10%NaOH

4、器材：

酒精计、试管（内装一倒置的杜氏小管）、移液枪、滴管、载玻片、显微镜、三角瓶、培养箱、烧杯

四、【实验方法】

1、液体种子的制备和发酵液的接种培养：

1）取活化培养的酵母斜面菌种一满环，接入150ml小三角瓶的种子液中（第10天），28～30℃培养箱中保温培养24h（第11天），此即三角瓶液体种子。

2）将上述液体种子以5%接入250ml三角瓶中的待发酵液中。

3）放入28～30℃培养箱中培养24～36h后观察结果。

（第12,13天）

2、二氧化碳生成的检验：

（第12,13天）

1）先观察三角瓶中的发酵液有无泡沫或气泡逸出，再察看发酵试管里的杜氏小管中

有无气体聚集。

2）取10%NaOH溶液1ml注入发酵试管中，轻轻搓动发酵管，观察液面是否上升，如气体逐渐消失，则证明其中气体为发酵过程中生成的CO2，其化学反应式如下：

CO2+NaOH→NaHCO3。

3、酒精生成的检验：

（第12,13天）

1）打开大三角瓶棉塞，嗅闻有无酒精气味。

2）从大三角瓶中取出发酵液5ml，注入空试管中，再加入10%H2SO4溶液2ml。

3）向试管中滴加1%K2Cr2O7溶液10～20滴，如管中由橙黄色变成黄绿色，则证明有酒精生成，反应式如下：

2K2Cr2O7+8H2SO4+3CH3CH2OH→3CH3COOH+2K2SO4+2Cr（SO4）3+11H2O

4、酒精度测定：

利用酒精计测定酒精含量。

五、【注意事项】

在CO2检测过程中。

大试管中杜氏小管内有气体聚集，说明发酵过程中有二氧化碳的生成，在加入加NaOH后，轻轻搓动发酵管，发现液面上升，因为在此过程中发酵产生的二氧化碳与氢氧化钠反应生成碳酸氢钠，液面上升，并且杜氏小管内部气体全部消失，充满液体后降到试管底部，这些现象证明了发酵过程中CO2生成。

  在检验酒精生成的过程中，打开三角瓶瓶塞，可闻到明显的酒香味，在加入H2SO4溶液及K2CrO7溶液，溶液由橙黄色变为了黄绿色，在静置一段时间后，颜色加深，这些现象证明了发酵过程中乙醇的产生。

六、【思考题】

1、什么是巴斯德效应，如何利用其指导酒精发酵？

附页2实验进程安排

第1天8：

00实验说明

9：

00全班准备试验：

对所需玻璃器皿（平皿，三角瓶，试管）用去污粉洗涤至玻璃壁不挂水珠，晾干。

（湿热灭菌法含有葡萄糖的培养基使用115℃，其余使用121℃灭菌）

配豆芽培养液400ml，分装9mlx30支试管；其余分装5mlx20支试管（加杜氏小管）

配YPG培养基3000ml，倒斜面20支；其余分装120mlx10个三角瓶

葡萄糖培养液100ml：

10mlx10支试管

4.5ml蒸馏水试管60支

90ml无菌水：

10瓶

平皿：

200套（干热灭菌）

100μl，1000μl枪头各9盒；10μl枪头4盒

10ml注射器：

20个（报纸包扎）

取葡萄皮放有90ml无菌水的三角瓶中，振荡20min

富集：

1ml样品+9ml豆芽培养液，28℃富集24h

酵母菌种活化：

挑取酿酒酵母在斜面上划线，28℃培养24h

第2天镜检，观察酵母菌形态及死活情况

倒YPG平板，酵母富集液梯度稀释，取10-2、10-3各0.1ml涂平板，28℃，24h以上

挑取已活化的酵母斜面菌种满一环，接种于10ml葡萄糖培养液中，28℃，30h。

配制1%Ca（NO3）2500ml，分装50mlx10瓶，灭菌

配制PVA-海藻酸钠溶液200ml，室温封存24h

准备下次实验其它所需的试剂及器材

第3天观察所分离的酵母生长情况

制片显微镜下检测纯度，如果不纯，继续划线分离

菌种保藏：

将分离的部分酵母菌纯种转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4℃下保存。

挑取酵母菌斜面菌种一环，接种于含10ml葡萄糖培养液的试管中，25℃培养30h

配制含有YPG琼脂的平皿若干

第4天制片显微镜下检测纯度

菌种保藏：

将分离的剩余酵母菌纯种转接于YPG斜面培养基上，28℃培养24h以上

酵母菌一级筛——TTC法：

将分离得到的各菌株