内质网应激与心房颤动全文.docx

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内质网应激与心房颤动全文

2021内质网应激与心房颤动（全文）

  心房颤动（atrialfibrillation，AF）是一种以快速、无序电活动为特征的持续性心律失常，可显著增加脑卒中和充血性心力衰竭的发生风险，有很高的致残和致死率[1]。

AF的产生和持续可以改变心房原有的电学和组织学特征，即出现心房电重构和结构重构，形成一种更有利于AF触发和维持的基质。

心房重构的早期主要以电重构为主，表现为有效不应期缩短和频率适应性下降，晚期则出现显著的结构重构，主要表现为心房肌细胞内质网和线粒体等超微结构的改变，并出现细胞凋亡、蛋白沉积、间质纤维化等[2]。

研究表明，心房重构的发生与心房肌细胞内Ca2+超载、氧化应激、细胞凋亡等机制有关[3,4]。

内质网（endoplasmicreticulum，ER）是调控细胞蛋白合成、细胞内Ca2+浓度、氧化应激水平、诱导细胞凋亡信号通路的重要细胞器[5]。

近年来，ER应激（ERstress，ERS）在心房重构及AF的发生和发展中的作用日益受到重视。

本文旨对ERS和AF研究进展作一综述。

一、内质网应激（ERS）

  ER是细胞中最大的膜网络结构，也是细胞内主要的Ca2+库，其腔内较胞质呈高氧化状态，参与蛋白质合成与修饰、类固醇物质的代谢及细胞内信号处理。

同时ER又是细胞应对外界刺激的主要细胞器，通过调节蛋白质的表达而适应环境的变化，是细胞重要的防御机制。

在缺血缺氧、氧化应激、异常糖基化反应以及Ca2+稳态失衡等因素刺激下，ER的正常功能被干扰，大量蛋白质被错误折叠，导致未折叠蛋白质（unfoldedprotein）在ER中堆积，促使ER启动应急响应机制来缓解未折叠蛋白质的压力，维持细胞内稳态和正常功能，此过程即为ERS[6]。

目前认为ERS主要包含两条途径，即未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR）和内质网过载反应（ERoverloadresponse，EOR），以上两条途径并无时间先后顺序。

UPR可上调蛋白折叠相关基因的表达，提高蛋白质正确折叠能力；调节蛋白翻译速率，抑制蛋白质的产生和聚集；促进错误折叠蛋白的内质网相关性降解（ERassociateddegradation，ERAD），提高自身修复能力[6]。

EOR则通过核因子κB（NF－κB）介导的信号通路促进炎症激活和细胞增殖[7]。

（一）未折叠蛋白反应（UPR）

  ER合成和修饰蛋白的功能依赖于分子伴侣、折叠酶和丰富的Ca2+环境，当ER腔内未折叠形态的蛋白聚集时，固有的分子伴侣蛋白葡萄糖调节蛋白78（Glucose－regulatedprotein78/Bindingprotein，GRP78/Bip）从ER跨膜蛋白的ER腔面解离下来，结合到未折叠蛋白。

跨膜蛋白在与分子伴侣GRP78解离之后被活化，启动UPR。

其中最重要的三种ER跨膜蛋白是蛋白激酶R样ER激酶（proteinkinaseR－likeERkinase，PERK）、肌醇需要酶（inositolrequiringkinase，IRE1）和活化转录因子6（activatingtranscriptionfactor6，ATF6），分别介导三条不同的信号通路[8,9]。

见图1。

  PERK是丝/苏氨酸蛋白激酶，通过寡聚化和磷酸化激活，使其下游的真核细胞翻译起始因子（eukaryoticinitiationfactor2，elF2α）磷酸化，造成elF2α不能再被重复利用，因而使mRNA的翻译速率广泛下调，新合成的蛋白减少，ER的蛋白负荷减轻。

与此相伴随的是一些抗应激蛋白和氨基酸转运体的mRNA被优先翻译，例如活化转录因子4（activatingtranscriptionfactor4，ATF4）。

ATF4可上调C/EBP同源蛋白（C/EBPhomologousprotein，CHOP）的表达，激活ER介导的细胞凋亡[10]。

图1内质网应激相关信号通路

注：

ERstress:

内质网应激；ERAD:

内质网相关性降解；GRP78/Bip:

葡萄糖调节蛋白78;IRE1:

肌醇需要酶;PERK:

蛋白激酶R样内质网激酶;ATF6:

活化转录因子6;elF2α:

真核细胞翻译起始因子2α;ATF4:

活化转录因子4;CHOP:

C/EBP同源蛋白;XBP1:

X－盒结合蛋白－1;TRAF2:

肿瘤坏死因子相关受体2;ASK1:

凋亡信号调节激酶1;JNK:

氨基末端激酶;NF－κB:

核因子κB

  IRE1是一种含有α和β两种亚型的跨膜蛋白，含有丝/苏氨酸激酶区和核酸内切酶区，通过寡聚化和磷酸化激活。

IRE1激活后通过其核酸内切酶活性剪切X－盒结合蛋白－1（X－boxbindingprotein1，XBP1）mRNA的前体，切除含26碱基对的内含子序列，使其成为成熟mRNA并翻译为XBP1蛋白[11]。

XBP1及其剪接体结合ERS反应元件（endoplasmicreticulumstresselement，ERSE）的启动子区，上调GRP78、CHOP等ERS相关基因的转录，增强ER蛋白折叠和ERAD功能[12]。

活化的IRE1还可通过与胞浆酶结构域招募接头分子TRAF2（TNF－receptor－associatedfactor2）结合而激活ASK1（apoptosissignalingkinase1），并级联激活JNK（c－JunN－terminalkinase）和NF－κB而介导细胞凋亡。

  ATF6是真核细胞内质网膜上的II型跨膜蛋白，其N端是胞质含b－ZIP的转录激活功能域，C端是位于ER腔内应激响应结构域。

通常情况下，ATF6通过GRP78对其上的高尔基体定位信号（golgilocalizationsignal，GLS）的抑制作用而停留在ER膜上。

GRP78与ATF6解离后，后者暴露出GLS而移位到高尔基体上，在高尔基体Site－1/2蛋白酶的水解作用下释放出N－端胞浆区，成为具有转录活性的活性片段。

活化的ATF6以同源或异源二聚体的形式结合于启动子ERSE，诱导XBP－1转录表达，上调GRP78、CHOP等基因的转录，从而促进蛋白在ER腔内的正确折叠和介导凋亡[13]。

  如果ER处理蛋白折叠的能力不能恢复，失去维持ER腔内氧化还原及Ca2+平衡的能力，则ER损伤变为不可逆，此时凋亡信号即被启动[14]。

（二）内质网过载反应（EOR）

  有关EOR的研究目前远不如UPR深入，Ca2+在EOR的过程中发挥了关键性作用。

EOR可以被ER腔内过度积累的蛋白诱发，而并非需要未折叠蛋白。

ER释放腔内的Ca2+，被线粒体摄取后产生活性氧簇（ROS），后者进一步激活NF－κB信号通路[15]。

NF－κB可以上调多种转录因子而促进增殖和炎症。

EOR的具体机制，尤其是和细胞自噬之间是否存在关联尚不清楚[7]。

有研究显示EOR可以抑制病毒蛋白复制，表明其作为一种快速抗病毒反应而具有抗病毒作用[15]。

二、内质网应激介导心房颤动的可能机制

（一）未折叠蛋白反应与心房颤动

  在各种致病因素的作用下，ER的功能和结构失衡，激活UPR，细胞翻译速率下调，ER伴侣蛋白的表达上调，错误折叠的蛋白质被降解。

通常情况下，ERS可以通过激活UPR能成功恢复ER的内环境平衡而维持细胞功能。

研究发现，PERK的激活可以下调心力衰竭患者心肌钠通道（Nav1.5）和快速激活钾通道（Kv4.3）的表达而促进心律失常的发生[16]。

一项入选了239例接受心脏手术患者的研究[17]，通过对左心耳组织进行全基因组mRNA芯片分析发现，AF易感性与几种细胞应激反应、炎症和氧化应激相关的转录因子靶蛋白表达降低有关，其中包括ATF6等CREB/ATF家族成员，而离子通道表达的重塑则发生在持续性AF患者抑或是AF的后果，提示UPR功能的缺失不能有效维持ER稳态，是AF发生的可能机制之一。

充血性心力衰竭可以促进心房结构重构而造成一种利于AF促发和维持的心房基质，有研究利用犬心室快速起搏造成的心力衰竭模型，通过对心房整体蛋白组学分析发现，起搏2周后ERS标志性蛋白GRP78水平明显增高[18]。

Vitadello等[19]在山羊心房快速起搏模拟AF的模型中发现，起搏4周以后ERS相关蛋白GRP94水平较正常心房组织升高2倍，在心房肌细胞未出现不可逆损伤前复律，8周后心房组织GRP94水平恢复至基线水平；而在慢性AF患者心房组织中同样发现，GRP94蛋白水平较非AF患者显著升高。

作者认为，GRP对Ca2+具有低亲和力而高容量的结合能力，GRP94升高可能通过其分子伴侣功能而抑制内质网蛋白聚集，促进正常折叠，也可能通过其Ca2+结合位点参与恢复细胞内Ca2+稳态，从而提高心房肌细胞的生存率。

也有研究发现，AF与ERS时UPR的过度激活有关。

在一项高频刺激HL－1心房肌细胞模拟AF的研究中发现，GRP78蛋白与对照组相比表达明显增加，UPR中三条经典途径p－PERK、p－IRE－1及ATF6蛋白水平均显著升高，而在应用ERS抑制剂4－苯基丁酸（4－PBA）后上述蛋白表达水平明显被抑制，并且高频刺激引起的HL－1细胞凋亡也被显著抑制[20]。

（二）内质网应激介导的细胞凋亡与心房颤动

  ERS诱导的凋亡存在多种途径，包括CHOP通路、Caspase－12的活化、JNK通路、Bcl－2蛋白家族以及Ca2+等。

转录因子CHOP被认为是介导ERS诱导细胞凋亡的最具特征性信号通路，UPR中PERK、IRE－1及ATF6均可以诱导CHOP表达，但PERK－eIF2α－ATF4是CHOP蛋白表达所必需的[21]。

CHOP促凋亡的具体机制尚不完全清楚，主要通过对促凋亡和抗凋亡基因的直接和间接调控来介导细胞凋亡。

活化的IRE1通过与TRAF2及ASK1相互作用激活JNK，后者从胞质转移到细胞核后通过磷酸化激活c－jun、c－Fos、EIK－1等凋亡相关靶基因而促进细胞凋亡[22]。

ERS能够通过多种途径使ER膜上的caspase－12（人类为caspase－4）活化，其促凋亡作用不依赖于其他途径，而是直接激活下游的caspase－3诱导细胞凋亡[23]。

Bcl－2蛋白家族分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白两大类，除线粒体外亦存在于ER膜上，调节ER内Ca2+平衡，调控ERS诱导物以及过ROS导致的细胞死亡[7]。

此外，ERS会导致ER腔内Ca2+外流，致使ER腔内分子伴侣活性下降，进一步加重ERS；同时细胞内Ca2+浓度升高促进依赖钙离子/钙调蛋白的蛋白激酶II（Ca2+/calmodulin－dependentproteinkinaseII，CaMKII）磷酸化，促进氧化应激，进一步激活p－JNK、Fas等的表达，从而导致细胞凋亡。

  心房肌细胞凋亡是心房纤维化的初始阶段，被证实与AF的发生、发展及预后密切相关。

Zhang等[24]研究发现，犬心房快速起搏可诱导衰老心房肌细胞表达单核细胞趋化蛋白－1诱导蛋白（MCPIP），表现为严重的心房纤维化和心肌细胞凋亡，MCPIP升高程度与IRE1相关，提示其通过ERS导致心房肌细胞自噬和凋亡。

研究发现，快速起搏HL－1心房肌细胞，出现明显的细胞凋亡，其机制与ERS和UPR被激活有关，通过上调具有促凋亡作用的CHOP蛋白水平，以及线粒体凋亡途径（mitochondrialapoptoticpathway，MAP）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen－activatedproteinkinases，MAPKs）途径介导细胞凋亡，在应用ERS抑制剂4－PBA后ERS相关蛋白表达下调，细胞凋亡被显著抑制[20]。

Ghavami等[25]在研究他汀类药物对原代人心房成纤维细胞的稳态、生存和程序性死亡时发现，通过抑制HMG－CoA还原酶，可诱导原代人心房成纤维细胞凋亡，其机制涉及ERS和UPR的过度激活。

也有研究显示，过氧化氢培养的乳鼠心肌细胞凋亡现象明显增加，ERS相关蛋白GRP78，GRP94，CHOP水平升高，应用伊布利特可以通过抑制ERS而减轻心肌细胞凋亡[26]。

  （三）内质网应激介导细胞内的Ca2+超载与心房颤动

  ER具有很强的Ca2+缓冲能力，是细胞内重要的“Ca2+库”，其浓度比胞浆内高数千倍。

ER腔内Ca2+浓度的改变可以影响蛋白的合成，而未折叠蛋白的聚集又会破坏ER内的Ca2+平衡。

生理状态下，ER中的Ca2+大部分呈游离状态，主要通过兰尼碱受体（RyR）和三磷酸肌醇受体（IP3R）两种途径进入细胞质内，又可通过Ca2+泵（SERCA）由细胞质进入到ER内，共同维持Ca2+的动态平衡。

ER内还存在伴侣蛋白和缓冲分子等Ca2+结合蛋白，如集钙蛋白（calsequestrin）、钙网织蛋白（calreticulin），具有极强的Ca2+结合能力，对于维持ER内Ca2+平衡极为重要。

ER与线粒体之间通过特殊结构存在局部联系，Ca2+可从ER转入线粒体中，调控心肌细胞线粒体能量代谢功能。

在病理状态下，ERS激活，ER内Ca2+释放，进而大量Ca2+进入细胞质，细胞内出现Ca2+超载，引起线粒体内ATP能量合成减少，ER内Ca2+浓度降低抑制分子伴侣功能，ER初始蛋白质折叠与合成能力受损；与此同时，细胞内Ca2+超载激活ROS，诱导凋亡，后除极和折返增加，促进心律失常的发生[27]。

  心房肌细胞内Ca2+超载是AF电重构的主要机制。

Liu等[28]发现PERK/钙调蛋白磷酸酶（calcineurin，CN）信号途径是调控细胞内Ca2+水平的一条新通路，与糖尿病心肌病相关心律失常发生有关，在糖尿病心肌病大鼠模型中，GRP78水平明显增高，PERK磷酸化水平及其下游CN活性增高，可能通过促使RyR受体开放而导致细胞内Ca2+超载，导致心律失常事件发生率明显增加，应用ERS抑制剂4－PBA或通过药物及RNA干扰抑制PERK活性后，细胞内Ca2+超载减轻，GRP78水平均及心律失常事件显著下降。

另有研究[29]发现，快速起搏HL－1心房肌细胞，激活ERS及自噬，Ca2+电流振幅降低，应用ERS抑制剂4PBA、过表达ER分子伴侣蛋白热休克蛋白A5、过表达eIF2α磷酸化阻滞的突变体均可抑制ERS及其下游激活的自噬，同时Ca2+瞬变减弱也被显著抑制；在犬心房快速起搏模型中，4PBA显著恢复心房肌细胞内Ca2+稳态，抑制ERS和自噬，改善心房肌结构重构和电重构，抑制AF进展。

此外，在大鼠心房快速起搏模型中，GRP78、PERK、IRE－1、ATF6以及另外一种ERS蛋白sestrin2水平均升高，磷酸化RyR2蛋白水平及Ca2+渗漏增加，其机制可能涉及Sestrin2直接结合RyR2上调磷酸化RyR2水平，提示Sestrin2通过调节RyR2参与ER应激介导的AF[30]。

  （四）内质网应激、氧化应激与心房颤动

  ER正常的生理功能与氧化还原状态密切相关，ER内的高氧化状态为新生肽链的正确折叠提供氧化动力。

氧化应激也是触发ERS的主要因素，ROS可以直接攻击维持蛋白折叠酶活性所必须的游离巯基，使得ER腔内蛋白质被氧化修饰，进而诱导ER折叠酶或分子伴侣的功能异常，引起未折叠蛋白的积累，从而激活UPR及其下游凋亡通路。

氧化还原状态的改变以及ROS的存在也影响ER上的通道功能和伴侣蛋白的缓冲进而出现Ca2+超载。

细胞内Ca2+超载不仅会激活下游信号通路激活凋亡、诱导心律失常，又可进入线粒体而增强其代谢，产生更多ROS。

另一方面，ER腔内蛋白质折叠过程中，蛋白质二硫键异构酶接受从多肽底物半胱氨酸残基的2个电子进一步传递给氧形成H2O2，成为ER内ROS的主要来源。

  研究发现，氧化应激及ERS在心房肌细胞的重构过程中发挥重要作用。

在AF的细胞模型中，快速起搏HL－1心房肌细胞，ROS水平、EOS水平显著增加，细胞存活率降低，而过表达ATF4可引起凋亡相关的细胞应激基因的表达，提示ROS和ERS引起心房肌细胞凋亡与诱导ATF4的产生有关上调有关[31]。

在小鼠主动脉弓缩窄模型中，心房结构重构和电重构改变明显，氧化应激、炎症和心房组织PERK、IRE1α、eIF2α、XBP1蛋白表达水平增高，可溶性环氧化物水解酶抑制剂TPPU可明显抑制氧化应激和ERS水平[31]。

Wang等[26]研究发现，伊布利特治疗AF的可能机制之一是通过抑制心肌细胞ERS而降低氧化应激水平。

三、总结

  ERS是细胞应对外界刺激的主要应激反应之一，适度的ERS可通过UPR处理未折叠及错误折叠蛋白恢复ER稳态，维持细胞结构和功能，是一种保护性机制。

然而持久或严重的ERS则可造成蛋白合成失衡、Ca2+稳态失衡、氧化还原失衡，引起细胞凋亡，进而导致组织的损伤。

目前ERS在AF的发病机制中研究尚不深入，但综上证据表明，ERS不足或过度激活可通过多种途径介导AF的发生以及心房肌细胞的重构。

随着对ERS研究的不断深入，必将对AF的基础及临床研究产生深远影响。