粗蛋白测定方法.docx

粗蛋白测定方法.docx

《粗蛋白测定方法.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《粗蛋白测定方法.docx（11页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

粗蛋白测定方法

粗蛋白测定方法—凯式定氮法

粗蛋白crudeprotein；crudematter（DM）食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。

不仅包括蛋白质这一物质，它涵盖的范围更广，包括含氮的全部物质，及真蛋白质和含氮物（氮化物）。

换句话说，粗蛋白是食品、饲料中含氮化合物的总称，食物中以大豆的粗蛋白含量最高，肉类次之。

所以说，粗蛋白是一种既包括真蛋白又包括非蛋白的含氮化合物，后者又可能包括游离氨基酸、尿素、硝酸盐和氨等。

然而，不同蛋白质的氨基酸组成不同，其氮含量不同，总氮量换算成蛋白质的系数也不同。

总之，粗蛋白是食品、饲料中一种蛋白质含量的度量。

我们可以通过粗蛋白测定仪即凯氏定氮仪来测量粗蛋白的含量，测量步骤如：

蛋白质含氮量约为16%（这已通过多次试验得出），再用凯氏法测出总氮量，再乘以6.25就可求得粗蛋白的含量。

一、实验原理

蛋白质是由碳、氢、氧、氮及少量硫元素组成。

这些元素在蛋白质中含量都有一定比例关系，其中含碳50～55%、氢6～8%、氧20～23%、氮15～17%和硫0.3～2.5%。

此外在某些蛋白质中还含有微量的磷、铁、锌、铜和钼等元素。

由于氮元素是蛋白质区别于糖和脂肪的特征，而且绝大多数蛋白质的氮元素含量相当接近，一般恒定在15～17%，平均值为16%左右，因此在蛋白质的定量分析中，每测得1克氮就相当于6.25克蛋白质。

所以只要测定出生物样品中的含氮量，再乘以6.25，就可以计算出样品中的蛋白质含量。

含氮有机物与浓硫酸共热，被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，氮进一步与硫酸作用生成硫酸铵。

由大分子分解成小分子的过程通常称为”消化”。

为了加速消化，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高消化液的沸点（290℃→400℃），加入硫酸铜作为催化剂，过氧化氢作为氧化剂，以促进反应的进行。

反应

（1）

（2）在凯氏烧瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行，其特点是将蒸汽发生器、蒸馏器及冷凝器三个部分融为一体。

由于蒸汽发生器体积小，节省能源，本仪器使用方便，效果良好。

硫酸铵与浓碱作用可游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的H+浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来H+浓度为止，最后根据所用标准酸的量计算出待测物中总氮量。

二、仪器和试剂

1、仪器:

消化管或凯氏烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、电炉、100mL锥形瓶、100mL量筒、表面皿、酸式滴定管、小漏斗、玻璃珠等。

2、试剂:

（1）血清或卵清蛋白等其他含蛋白质样品；

（2）消化液：

30%过氧化氢、硫酸与水的比例为3∶2∶1，临用时配制；

（3）催化剂：

硫酸铜（CuSO4•5H2O）与硫酸钾（K2SO4）以1：

3配比研磨混合；

（4）50%氢氧化钠溶液；

（5）2%硼酸溶液;

（6）标准盐酸溶液（约0.01mol/L）;

（7）混合指示剂（田氏指示剂）混合指示剂由50mL0.1%甲烯蓝乙醇溶液与200mL0.1%甲基红乙醇溶液混合配成贮于棕色瓶中配用。

这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色，变色范围很窄且很灵敏。

三、实验步骤

（一）安装微量凯氏定氮仪

定氮仪由蒸汽发生器、反应室、冷凝管三部分组成。

蒸汽发生器包括一个电炉及一个3～5升容积的烧瓶。

反应室上边有两个小烧杯，一个供加样，一个盛放碱液。

样品和碱液由此可直接到反应室中。

反应室中心有一长玻璃管，其上端通到反应室外层，下端靠近反应室的底部。

反应室下端底部有一开口，上有橡皮管和管夹。

由此放出反应废液。

反应所产生的氮可通过反应室上端细管经冷凝管通入收集瓶中。

反应室与冷凝管之间由橡皮管相连。

安装仪器时，将蒸汽发生器垂直地固定在铁架台上，用橡皮管把蒸汽发生器、反应室、冷凝管连接起来。

橡皮管连接的部位应在同一水平位置。

冷凝管下端与实验台的距离以放得下收集瓶为准。

安装完毕后，不得轻易移动，以免仪器损坏。

要认真检查整个装置是否漏气，以保证所测结果的准确性。

（二）样品的处理

（1）固体样品:

随机取一定量研磨细的样品放入恒重的称量瓶中，置于105℃的烘箱中干燥4h，用坩埚钳将称量瓶取出放入干燥器内，待降至室温后称重，随后继续干燥样品，每干燥1h，称重一次，恒0重即可。

（2）血清样品:

取人血（或猪血）放入离心管中，与冰箱中放置过夜。

次日离心除去血凝块，上层透明清液，即为血清。

吸出1mL血清加到50mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，混匀备用。

溶液如果显混浊，加少量氯化钠再混匀。

（3）卵清蛋白:

取2g卵清蛋白溶于0.9%NaCl溶液并稀释至100mL。

如有不溶物，离心取上清液备用。

（三）消化

取5支消化管并编号，在1、2、3号管中各加入精确称取干燥样品（注意：

加样品时应直接送入管底，避免沾到管口和管颈上），加催化剂0.5g，混和消化液3mL，在4、5号管中各加相同量的催化剂和混合消化液（若样品是液体时，还要加与样品等体积的蒸馏水）作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。

摇匀后，将5支消化管放在通风厨内的远红外消煮炉上消化。

先用小火加热煮沸，不久看到消化管内物质变黑，并产生大量泡沫，此时要特别注意，不能让黑色物质上升到消化管的颈部，否则将严重地影响样品测定结果。

当混合物停止冒泡，蒸汽与二氧化碳也均匀地放出时，适当加强火力。

在消化时，应是全部样品都浸泡在消化液中，如在瓶颈上发现有黑色颗粒，应小心地将消化倾斜振摇，用消化液将它冲洗下来。

通常消化需要1～3h（对于那些赖氨酸含量较高的样品需要更长的时间）。

待消化液变成褐色后，为了加速消化完成，可将消化管取出，稍冷，加30%过氧化氢溶液1～2滴于管底消化液中，再继续加热0.5h。

消化完毕，取出消化管冷却至室温。

（四）蒸馏

（1）仪器的洗涤:

仪器应先经一般洗涤，再经水蒸气洗涤。

目的在于洗去冷凝管中可能残留的氨。

对于处于使用状态的仪器（正在测定中的仪器）加样前使蒸汽通过1～2min即可，对于较长时间未使用的仪器，必须用水蒸气洗涤到吸收蒸汽的硼酸—指示剂混合液中指示剂的颜色合格为止。

洗涤方法如下：

取2～3个100mL锥形瓶，加入10mL2%硼酸、2滴混合指示剂，用表面皿覆盖备用。

现煮沸蒸汽发生器，其中盛有2/3体积的用几滴硫酸酸化过的蒸馏水，样品杯中也加入2/3体积蒸馏水进行水封。

关闭夹子使蒸汽通过反应室中的插管进入反应室，再由冷凝管下端逸出。

在冷凝管下端放一空烧杯以承受凝集水滴。

这样用蒸汽洗涤5min左右，在冷凝管下口放一个准备好的盛有硼酸—指示剂的锥形瓶，位置倾斜，冷凝管下口应完全浸泡于液体内，继续用蒸汽洗涤1～2min，观察锥形瓶中的溶液是否基本上不变色，若不变色，则证明蒸馏器内部已洗涤干净。

下移锥形瓶，使硼酸液面离开冷凝管口约1cm，继续通蒸汽1min。

最后用蒸馏水冲洗冷凝管外口，排废开始。

用右手轻提样品杯中棒状玻塞，

使水流入反应室的同时，立即用左手关闭夹子，盖好玻塞。

由于反应室外层中蒸汽冷缩、压力降低，反应室内废液通过反应室中插管自动抽到反应室外壳中，再在样品杯中加入2/3体积蒸馏水，如此反复三次既可排尽废液及洗涤液。

打开夹子将反应室外壳中积存的废液排出，关闭夹子再使蒸汽通过全套蒸馏仪1~3min，可进行下一次蒸馏。

（2）样品及空白的蒸馏:

取5个100mL锥形瓶，分别加入2%硼酸10mL，混合指示剂2滴，溶液呈紫红色，用表面皿覆盖备用。

把消化管中的消化液全部转移到样品杯中，用约2mL蒸馏水冲洗消化管，重复3次，把洗涤液都倒入样品杯中，打开样品杯的棒状玻塞，将样品放入反应室，用少量蒸馏水冲洗样品杯后也使之流入反应室，盖上玻塞，并在样品杯中加约2/3体积的蒸馏水进行水封。

而后将装有硼酸—指示剂的锥形瓶放在冷凝管口下方，打开存放碱液杯下端的夹子，放10mL40%氢氧化钠溶液于反应室后，立即上提锥形瓶，使冷凝管下口浸没在锥形瓶的液面下。

反应液沸腾后，锥形瓶中的硼酸—指示剂混合液由紫红色变为绿色，自变色时开始计时，蒸馏3～5min。

移动锥形瓶，使硼酸液面离开约1cm，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管下口外面，继续蒸馏1min，用少量蒸馏水冲洗冷凝管下端尖嘴，将锥形瓶取出，用表面皿覆盖以待滴定。

排液和洗涤等操作与前面相同。

排废洗涤后，可进行下一个样品的蒸馏（每一个样品要同时做三份，以求得准确结果）。

待样品和空白消化液蒸馏完毕后，同时进行滴定。

（五）滴定

全部蒸馏完毕后，用0.001mol/L标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，直至硼酸—指示剂混合液由绿色变回淡葡萄紫色，即为滴定终点，记录所耗HCl溶液量。

五、计算

样品的总氮含量（%）=（A—B）×0.001×14.008×100/1000×C

若测定的样品含氮部分只是蛋白质（如血清），则：

样品中的蛋白质含量（%）=（A－B）×0.001×14×6.25×100/1000×C

A－滴定样品用去的盐酸体积（mL）；B－滴定空白用去的盐酸体积（mL）；C－称量样品的量（g）；0.001－盐酸的摩尔浓度（mol/L）；14－氮原子量；6.25－系数（1mL0.001mol/L盐酸相当于0.14mg氮）。

若样品中除有蛋白质外，尚有其它含氮物质，则样品蛋白质含量的测定要复杂一些。

首先，需向样品中加入三氯乙酸，使其最终浓度为5%，然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸后样品的上清液中的含氮量，得出非蛋白氮量，从而计算出蛋白氮，再进一步折算出蛋白质含量。

蛋白氮=总氮－非蛋白氮

粗蛋白质含量（%）=蛋白氮×6.25

粗纤维测定方法

粗纤维（CrudeFiber,缩写CF，是膳食纤维的旧称，现已不用。

）粗纤维是植物细胞壁的主要组成成分，包括纤维素、半纤维素、木质素及角质等成分。

吃些含粗纤维的食物可以帮助消化，加强肠胃功能，是有益处的，但是吃多了很明显会因无法消化而造成腹胀。

1、原理

用浓度准确的酸和碱，在特定条件下消煮样品，再用乙醇除去可溶物，经高温灼烧扣除矿物质的量，所余量为粗纤维。

它不是一个确切的化学实体，只是在公认强制规定的条件下测出的概略成分，其中以纤维素为主，还有少量半纤维素和木质素。

2、仪器和试剂

2.1试剂

本方法试剂使用分析纯，水为蒸馏水

（1）硫酸溶液（0.128±0.005）mol/L；

（2）氢氧化钠溶液（0.313±0.005）mol/L；（3）酸洗石棉，加5%氢氧化钠浸泡．在水浴上回流8h以上，再用热水充分洗涤．然后用20%盐酸干燥，在600--700℃下灼烧后．加水使成混悬物，储存于玻璃瓶中；（4）95%乙醇；（5）乙醚；（6）正辛醇（防泡剂）。

（丙酮、十氢奈）

2.2仪器设备

（1）实验室用样品粉碎机，分样筛，孔径1mm（18目）；

（2）分析天平，感量0.0001g；

（3）电力热器（电炉），可调节温度；

（4）电热恒温箱（烘箱），可控制温度在130℃，高温炉，可控制温度在500-600℃。

（5）消煮器；（6）抽滤装置；（7）干燥器。

（8）古氏坩埚[预先加入酸洗石棉悬浮液30ml（内含酸洗石棉0.2-0.3g）再抽干，以石棉厚度均匀，不透光为宜。

上下铺两层玻璃纤维有助于过滤〕。

3、操作步骤

称取1-2g试样，准确0.0002g。

用乙醚脱脂（含脂肪大于10%，必须脱脂；含脂肪不大于10%，可不脱脂）。

放入消煮器，加浓度准确且已沸腾的0.128mo1/硫酸溶液100mL和1滴正辛醇，立即加热，应使其在2min内沸腾，调整加热器，使溶液保持微沸，且连续微沸30min，注意保持硫酸浓度不变。

试样不应离开溶液沾到瓶壁上。

随后抽滤，残渣用沸蒸馏水洗至中性后抽干。

用浓度准确且已沸腾0.313mo1/L氢氧化钠溶液将残渣转移至原容器中并加至200mL，同样准确微沸30min。

立即在铺有石棉的古氏坩埚上过滤，先用25mL硫酸溶液洗涤，残渣无损失地转移到坩埚中，用沸蒸馏水洗至中性，再用15mL乙醇洗涤，抽干。

将坩埚放入烘箱，于（130士2）℃下烘干2h，取出后在干燥器中冷至室温，称重，再于（550士25）℃高温炉中灼烧30min，取出后于干燥器中冷却至室温后称重。

4、计算公式

中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维测定方法

中性洗涤纤维（neutraldetergentfibre）：

植物材料或含植物材料的饲料中不溶于中性洗涤剂的那部分物质，包括纤维素、半纤维素、木质素、二氧化硅、角质蛋白和蜡质等，实际上也是组成植物细胞壁的成分。

NDF是利用中性洗涤剂除去饲料中的蛋白质、淀粉、脂肪和糖类而得到纤维。

它代表着饲料容积,起到填充瘤胃的作用,决定着家畜的饱腹度,与家畜的自由采食量呈负相关,NDF越低,干物质采食量就越大。

酸性洗涤纤维（aciddetergentfibre）：

植物材料或含有植物材料的饲料中，不溶于酸性洗涤剂的碳水化合物，包括纯纤维素和酸性纤维素两部分。

ADF指NDF减去半纤维素的成分,只代表木质化的纤维素,与消化率呈负相关,饲草ADF增加,家畜的消化率下降。

一、采用范氏（VanSoest）的洗涤纤维分析法测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）原理

植物性饲料经中性洗涤剂煮沸处理，不溶解的残渣为中性洗涤纤维，主要为细胞壁成分，其中包括半纤维素、纤维素、木质素和硅酸盐。

植物性饲料经酸性洗涤剂处理，剩余的残渣为酸性洗涤纤维，其中包括纤维素、木质素和硅酸盐。

酸性洗涤纤维经72%硫酸处理后的残渣为木质素和硅酸盐，从酸性洗涤纤维值中减去72%硫酸处理后的残渣为饲料的纤维素含量。

将72%硫酸处理后的残渣灰化，在灰化过程中逸出的部分为酸性洗涤木质素（ADL）的含量。

基于VanSoest原理的纤维素含量分析系统，Fibertec纤维分析系统。

二、试剂的配制

1、中性洗涤剂（3%十二烷基硫酸钠）：

准确称取18.6g乙二胺四乙酸二钠（EDTA，C10H14O8Na2·2H2O，分析纯）和6.8g硼酸钠（Na2B4O7·10H2O，分析纯）放入烧杯中，加入少量蒸馏水，加热溶解后，再加入30g十二烷基硫酸钠（C12H25NaO4S，分析纯）和10ml乙二醇乙醚（C4H10O2，分析纯）；再称取4.56g无水磷酸氢二钠（Na2HPO4，分析纯）置于另一烧杯中，加入少量蒸馏水微微加热溶解后，倒入前一个烧杯中，在容量瓶中稀释至1000ml，其中pH值约为6.9~7.1（pH值一般勿需调整）；1N硫酸：

量取约27.87ml浓硫酸（分析纯，比重1.84，98%），徐徐加入已装有500ml蒸馏水的烧杯中，冷却后注入1000ml容量瓶定容，标定。

2、酸性洗涤剂（2%十六烷三甲基溴化铵）：

称取20g十六烷三甲基溴化铵（CTAB，分析纯）溶于1000ml1N硫酸，必要时过滤；

三、测定方法

1、中性洗涤纤维测定：

准确称取1.0000g样品（通过40目筛）置于直筒烧杯中，加入100ml中性洗涤剂和数滴十氢化萘及0.5g无水亚硫酸钠。

将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在5~10min内煮沸，并持续保持微沸60min。

煮沸完毕后，取下直筒烧杯，将烧杯中溶液倒入安装在抽滤瓶上的已知重量的玻璃坩埚中进行过滤，将烧杯中的残渣全部移入，并用沸水冲洗玻璃坩埚与残渣，直洗至滤液呈中性为止。

用20ml丙酮冲洗二次，抽滤。

将玻璃坩埚置于105℃烘箱中烘2h后，在干燥器中冷却30min称重，直称至恒重。

2、酸性洗涤纤维测定

准确称取1.0000g样品（通过40目筛）置于直筒烧杯中，加入100ml酸性洗涤剂和数滴十氢化萘及0.5g无水亚硫酸钠。

将烧杯套上冷凝装置于电炉上，在5~10min内煮沸，并持续保持微沸60min。

趁热用已知重量的玻璃坩埚抽滤，并用沸水反复冲洗玻璃坩埚及残渣至滤液呈中性为止。

用少量丙酮冲洗残渣至抽下的丙酮液呈无色为止，并抽净丙酮。

将玻璃坩埚置于105℃烘箱中烘2h后，在干燥器中冷却30min称重，直称至恒重。

酸性洗涤木质素和酸不溶灰分（AIA）测定将酸性洗涤纤维加入72%硫酸，在20℃消化3h后过滤，并冲洗至中性。

消化过程中溶解部分为纤维素，不溶解的残渣为酸性洗涤木质素和酸不溶灰分，将残渣烘干并灼烧灰化后即可得出酸性洗涤木质素和酸不溶灰分的含量。

四、结果计算

中性洗涤纤维含量的计算：

NDF（%）=（W1－W2）/W×100

式中：

W1—玻璃坩埚和NDF重（g）W2—玻璃坩埚重（g）W—试样重（g）

酸性洗涤纤维含量的计算：

ADF（%）=（G1－G2）/G×100

式中：

G1—玻璃坩埚和ADF重（g）G2—玻璃坩埚重（g）W—试样重（g）

半纤维素含量的计算：

半纤维素（%）=NDF（%）－ADF（%）

纤维素含量的计算：

纤维素=ADF（%）－经72%硫酸处理后的残渣（%）

酸性洗涤木质素（ADL）含量的计算：

ADL（%）=残渣（%）－灰分（硅酸盐,%）。

饲草的相对值计算方法

饲草相对值（RFV）:

RFV于1978年由美国饲草和草原理事会下属的干草市场特别工作组提出，是目前美国唯一广泛使用（销售、库存及根据草食家畜对饲草质量的要求投料）的饲草质量评定指数，其定义为:

相对一特定标准饲草（盛花期苜蓿）某种饲草可消化干物质的采食量。

RFV的基础是可消化干物质（DDM）的随意采食量，家畜的RFV是由草食家畜的干物质采食量（DryMatterIntake,DMI，%Bw）和饲草中的DDM含量（%DM）决定的。

由于通常DMI与DDM相关性不高，因此，RFV由对DMI和DDM的预测值计算得到。

其关系式如下:

RFV=DMI（%BW）×DDM（%DM）/1.29

其中:

DMI（drymatterintake，%BW）为饲草干物质的随意采食量，用占体重（BW）

的百分比表示;DDM（digestibleddrymatter，%DM）为可消化的干物质，用占干物质（DM）的百分比表示;BW（bodyweight）为体重。

它们的预测模型分别为:

DMI（g/BW0.75，）=74.4+0.877×（NDF，%DM）一0.017×（NDF，%DM）2（绵羊采食

量预测公式，Mertens，1973）,DDM（%DM）=88.9一0.779ADF（%DM）,DMI和DDM可经各自特定模型分别由NDF与ADF计算得到，1.29是基于大量动物试验数据所预期的盛花期苜蓿DDM的采食量，指的是占体重的百分比。

除以1.29，目的是使得盛花期的苜蓿RFV值为100。

RFV值大于100的饲草表明相对于基数100，整体上质量较好。

目前，美国饲草和草地协会根据干草市场需要，主要以CP、NDF、ADF、DDM、DMI和RFV作为评定指标，制定了豆科、豆科与禾本科混播饲草的6个等级（表3）。

表豆科、豆科与禾本科混合干草质量标准

Table.Qualitystandardsinhaymixedlegumeswithgrassandlegumes

质量标准

CP（%）

ADF（%）

NDF（%）

DDM（%）

DMI（%）

RFV（%）

特级

>19

<31

<40

>65

>3.0

>151

1级

17~19

31~35

40~46

62~65

3.0~2.6

151~125

2级

14~16

36~40

47~53

58~61

2.5~2.3

124~103

3级

11~13

41~42

54~60

56~57

2.2~2.0

102~87

4级

8~10

43~45

61~65

53~55

1.9~1.8

86~75

5级

<8

>45

>65

<53

<1.8

<75

注:

RFV为100%的标准干草含41%的ADF和53%的NDF。

RFV（相对饲喂价值）=DMI*DDM/1.29；DMI=120/NDF；DDM=88.9-0.779ADF；