溶液各种配制教学文案.docx
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溶液各种配制教学文案
溶液各种配制
附录：
常用试剂配制及应用
一、常用缓冲液、试剂的配制
碳酸盐缓冲液（Carbonate-BicarbonateBuffer）
由于碳酸盐pH值偏碱，因此，常用于pH>9的缓冲液配制（附表1）
附表1.0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.2〜10.7）
pH
0.2mol/LNqCO（ml）
0.2mol/LNaHCO（ml）
pH
0.2mol/L
NqCO（ml）
0.2mol/LNaHCO（ml）
9.2
4.0
46.0
10.0
27.5
22.5
9.3
7.5
42.5
10.1
30.0
20.0
9.4
9.5
40.5
10.2
33.0
17.0
9.5
13.0
37.0
10.3
35.5
14.5
9.6
16.0
34.0
10.4
38.5
11.5
9.7
19.5
30.5
10.5
40.5
9.5
9.8
22.0
28.0
10.6
42.5
7.5
9.9
25.0
25.0
10.7
45.0
5.0
磷酸缓冲液（PhosphateBuffers,PB）
磷酸盐是使用最广泛的一种缓冲剂，由于它们是二级解离，有二个pKa
值，所以用它们配制的缓冲液，pH范围最宽。
NaHPO4pKa仁2.12，pKa2=
7.21;Na2HPO4pKa1=7.21，pKa2=12.32。
另外，磷酸盐还有钾盐分子形式，一般来说，低温时钠盐难溶，钾盐易
溶，因此，配制细胞培养用试剂时常常添加钾盐试剂，但若配制十二烷基硫酸钠（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的缓冲液时，只能用钠盐而不能用钾盐，因为SDS会与磷酸钾生成难溶的十二烷基硫酸钾。
磷酸缓冲液的优点为：
①可配制成不同离子强度的缓冲液；②适用pH缓冲范围较宽；③受温度影响缓冲液pH值变化较小；④离子强度对缓冲液pH影响较小，如O.1mol/L缓冲液稀释10倍其pH变化小于0.1。
磷酸缓冲液的缺点是：
①磷酸盐易与钙离子（CaT）、镁离子（Mg+）及重金属离子结合生成不溶的沉淀物；②可能干扰某些生物化学反应过程，如对某些酶的催化活性具有一定程度的抑制作用。
NaHPQ的pH值偏酸性，可用作pH<4的缓冲液。
NqHPO的pH值偏碱性，可用作pH>10的缓冲液。
而pH=6〜8的中性缓冲液是更常用的缓冲液，需要NaHPQ与NaHPO两种磷酸盐混合配制（附表2）。
附表2.0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH5.7〜8.2）
pH
0.2mol/L
NaHPQ
（ml）
0.2mol/L
NaHPQ
（ml）
pH
0.2mol/L
NaHPQ
（ml）
0.2mol/L
NaHPQ
（ml）
5.7
93.5
6.5
7.0
39.0
61.0
5.8
92.0
8.0
7.1
33.0
67.0
5.9
90.0
10.0
7.2
28.0
72.0
6.0
87.7
12.3
7.3
23.0
77.0
6.1
85.0
15.0
7.4
19.0
81.0
6.2
81.5
18.5
7.5
16.0
84.0
6.3
77.5
22.5
7.6
13.0
87.0
6.4
73.5
26.5
7.7
10.5
89.5
6.5
68.5
31.5
7.8
8.5
91.5
6.6
62.5
37.5
7.9
7.0
93.0
6.7
56.5
43.5
8.0
5.3
94.7
6.8
51.0
49.0
8.1
4.2
95.8
6.9
45.0
55.0
8.2
3.0
97.0
磷酸盐缓冲溶液（Phosphate-bufferedsaline,PBS）
磷酸盐缓冲液是在磷酸缓冲液基础上添加NaCI以维持溶液的渗透压，因
此，PBS适用于做细胞缓冲液，常用PBS配制如下。
NaCl
8g
KCl
0.2g
NqHPQ
1.44g
KHPQ
0.24g
在800ml蒸馏水中溶解，用HCI调节溶液的pH值至7.2〜7.4加水定容至
1L,15psi（1.05kg/cm2）高压灭菌20min,室温保存备用。
Tris缓冲液（Tris-HClBuffer,TB）
Tris的pH值偏于碱性，因此，通过添加HCI调节pH至所需值，Tris-HCl
缓冲液的离子强度（mol/L）是专指Tris的浓度，如某一特定pH的0.05
mol/LTris缓冲液的配制是将50ml0.1mol/LTris碱溶液与附表3所示相应体积（ml）的0.1mol/LHCl混合，加水至将体积100ml，即为0.05mol/L
Tris缓冲液。
另外，按附表3制备的缓冲液，由于试剂来源的不同，缓冲液pH可能与所
需略有差异，此时可通过稍许减少或增加HCI用量，精细调节pH至所需值
附表4.0.05mol/LTris缓冲液
pH
需0.1mol/LHCl（ml）
pH
需0.1mol/LHCl（ml）
7.1
45.7
8.1
26.2
7.2
44.7
8.2
22.9
7.3
43.4
8.3
19.1
7.4
42.0
8.4
17.2
7.5
40.3
8.5
14.7
7.6
38.5
8.6
12.4
7.7
36.6
8.7
10.3
7.8
34.5
8.8
8.5
7.9
32.0
8.9
7.0
8.0
29.2
Tris盐缓冲液（TBS:
Tris盐缓冲液是在Tris缓冲液基础上添加NaCI以维持溶液的渗透压，因
此，TBS也适用于做细胞缓冲液，常用TBS配制如下。
8gNaCl、0.2gKCl以及3gTris溶解于800ml蒸馏水中，加入0.015g酚红并用HCI调pH至7.4用蒸馏水定容至1L，分装后在15psi（1.05kg/cm2）高压火菌20min，室温保存。
现在常用Tris盐缓冲液通常不加pH指示剂，而且该溶液如果不用于细胞培养，通常不加KCl及酚红。
Hank's液（Hank'sBalaneedSaltSolution）
Hank's液是一种平衡盐溶液，主要用于细胞培养取材时组织块的漂洗、细胞的漂洗等。
贮存液A液：
（I）NaCI80g
KCI4g
MgSO7H2O1g
MgC2-6H2O1g
用双蒸馏水定容至450ml。
（II）CaCl21.4g（或CaCb-2HO1.85g）
用双蒸馏水定容至50ml。
将I和II液混合，即成A液。
贮存液B液：
NaHPO・12I4O1.52g，
KHPQ
0.6g,
酚红
0.2g,
葡萄糖
10.0g,
酚红应先置研钵内磨细，然后按配方顺序一一溶解，用双蒸馏水定容至
500ml。
（3）应用液：
A、B储存液分别经112.6C湿热灭菌20min,取A和B液各
25ml，加无菌双蒸馏水至450ml，使用前用无菌的3.5%或5.6%NaHCO调至所需pH。
注意：
药品必须全部用A.R试剂，并按配方顺序加入，用适量双蒸水溶
解，待前一种药品完全溶解后再加入后一种药品，最后补足水到总量。
无CaT、M（g+Hank's液（Hank'sSolutionwithoutcalcium,magnesium
sulfate）
NaCI80g,
KCI4g,
NaHPO・12HO1.52g,
KHPQ0.6g,
葡萄糖log,
用双蒸馏水溶解后，加入0.4%酚红溶液50ml，再加入双蒸水至1000ml,
112.6C湿热灭菌20min,4C冰箱保存。
临用前将原液用无菌双蒸水作1:
10
倍稀释，用无菌的3.5%或5.6%NaHCQ调至所需pHo
pH7.2柠檬酸盐缓冲液（CitrateBuffer）
柠檬酸0.327g
柠檬酸钠2.63g
磷酸氢钠0.222
葡萄糖0.00255mg
蒸馏水加至100mlo
pH3.3枸橼酸-磷酸盐缓冲液（Citricacid-PhosphateBuffer）
0.131mol/Lcitrateacid,0.066mol/LNa2HPQ等量混合，调节pH至3.3o
0.5mol/LEDTA,pH8.0
EDTA2H2O186.1g
NaOH〜20g
将EDTA2HHO加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。
用NaOHM节pH至8.0，EDTAft到接近pH8.0才完全溶解，定容至1L。
分装后高压蒸汽灭菌。
0.4%酚红溶液
取酚红0.4g置于研钵中逐滴加入1mol/LNaOH溶液11.28ml，边研磨边使酚红转变为钠盐溶于水中，加双蒸水至100ml，过滤后，4°C冰箱保存。
醋酸钾（PotassiumAcetate）
在60ml5mol/L醋酸钾溶液中，加入11.5ml冰醋酸和28.5ml水。
该溶液用于碱性裂解。
3mol/L醋酸钠（SodiumAcetate），pH5.2和pH7.0
在800ml水中溶解408.1g三水醋酸钠，用冰乙酸调pH至5.2或用稀释乙酸调pH至7.0，加双蒸水至1L。
分装后高压灭菌。
柠檬酸钠缓冲液（SodiumCitrateBuffer）
柠檬酸钠1.8g
HCI（1mol）4ml
无水乙醇95ml
先用100ml去离子水溶解柠檬酸钠，然后加入HCI和无水乙醇，再补充去
离子水至总量200ml。
饱合硫酸铵溶液（SaturatedAmmoniumSulfateSolution）
取500ml双蒸馏水，加入约400克硫酸铵，水浴加热至70C，磁力搅拌器充分搅拌，直到加入的硫酸铵不再溶解，以氨水（也可用NaOH调PH7.2，室温保存。
二、酶免疫检测常用试剂配制
包被液（CoatingBuffer）（pH9.5碳酸盐缓冲液）
NaCQ・10HO8.58g
NaHCQ5.8g
溶于双蒸水至1000ml。
封闭液（Confiningliquid）（5%兑脂乳-PBS溶液，pH7.4）
脱脂乳50g
力卩0.02mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液（PBS至1000ml溶解。
洗液（washingliquid）
氯化钠
8.0g
磷酸二氢钾
0.2g
磷酸氢二钠（
12HQ2.9g
吐温-20
0.5ml
加去离子水至
1000ml溶解即可。
终止液（stopbuffer）
（2mol/LH2SQ）:
21.7mlH2SQ
加去离子水至200ml。
缓冲甘油（glycerinebuffer）
甘油
9
份
PB（pH8.0）
1
份
将9份甘油与1份PB合并，充分混匀。
0.5%H2Q-甲醇液（HydrogenPeroxide-MethanolSolution）（总体积120ml）
3%H2Q20ml
甲醇100ml
DAB-H2Q底物缓冲液（DAB-H2QSubstrateBuffer）
取6mg二氨基联苯胺（3,3'-DiaminobenzidineTetrahydrochlorideDAB）溶解于10ml0.05molTris-HClpH7.6。
使用前取0.3%HQ0.1ml加入到DAB
溶液中（EQ的终浓度为0.003%）。
如有沉淀生成，贝U用滤纸过滤。
5-溴4氯-3吲哚磷酸/四唑氮蓝底物显色液（BCIP/NBTSubstrateSolution）
贮存液配制：
NBT在10ml70%的乙醇中溶解0.5gNBT。
BCIP:
在10ml100%二甲基甲酰胺中溶解0.5gBCIP。
贮存液4C保存，可稳定一年。
底物显色液：
取66卩lNBT贮液与33卩lBCIP加入到10ml碱性磷酸酶缓冲液中，充分混匀，底物显色液应在用前1小时内配制。
三、细胞相关试剂配制
L-谷氨酰胺（L-G）溶液（L-glutaminSolution）（0.2mol/L）
称2.9gL-谷氨酰胺（分子量为146.15）用去离子水溶解至100ml，过滤除菌，分装小瓶，4〜5ml/瓶，-20C冻存。
100x青-链霉素（双抗）溶液（P/SPenicillin/StreptomycinSolution）
取青霉素G（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100ml去离子水中，分装小瓶，4〜5ml/瓶，-20°C冻存。
7.5%NaHCQ容液（NaHCQSolution）
称分析纯NaHCO7.5g，用去离子水溶解至l00ml，过滤除菌，分装小瓶，4〜5m1/瓶，盖紧瓶塞，4C保存。
HEPESS液（HEPESSolution）（1mol/L）
称23.83gHEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic
acid,N-2-羟乙基呱嗪-N'-2-乙基磺酸，分子量为238.3），用去离子水溶解
至100ml，过滤除菌，分装小瓶，4〜5m1/瓶，4C保存。
氨基喋呤（A）贮存液（AminopterinStockingSolution）（100X,4x10
mol/L）
称1.76mg氨基喋呤（Aminopterin,分子量440.4），溶于90m1去离子
水中，滴加lmol/LNaOH0.5m1，并不断搅动，待氨基喋呤完全溶解后，加1mol/L的HCI0.5m1中和，再补加去离子水至100m1。
过滤除菌，分装小瓶，2ml/瓶，-20C冻存。
次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷贮存液（HTStockingSolution）（100X,H:
10-2
3
mol/L;T:
1.6x10-mol/L）
称取136.lmg次黄嘌呤（Hypoxanthine，分子量136.1）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（Thymidine，分子量242.2），加去离子水至100ml，置45〜50C水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶，2m1/瓶，-20C冻存。
用前可置
37C加温助溶。
HAT培养液
培养液98ml，A贮存液1m1，HT贮存液Iml。
秋水仙素溶液（colchicineSolution）
称取10mg秋水仙素，溶于100m1生理盐水中（即为100卩g/ml），过滤除菌后，分装小瓶，—20C冻存备用。
Alsever's血细胞保存液（Alsever'sSolution）
葡萄糖2.05g,
柠橡酸钠0.8g,
NaCl0.42g，
蒸馏水100ml。
以上成分混匀后，微加温使其溶解后，用柠檬酸调节pH6.1，分装于三角
瓶中（30〜50ml/瓶）,113C湿热灭菌15min,4C保存备用。
细胞冻存液（FreezingMedium）
50%」、牛血清；40%f完全培养液；10%DMS0二甲基亚砜）。
0.025%胰蛋白酶—0.2%EDT细胞消化液（Trypsin-EDTASolution）
A:
2.5%胰蛋白酶：
胰蛋白酶2.5g
磷酸缓冲盐溶液100ml
过滤除菌保存。
B:
0.2%二乙胺四乙酸二钠（EDTA
EDTA0.2g
双蒸馏水100ml
咼压火菌保存。
取A液1份，加B液99份，混匀，分装-20C保存。
0.83%NH4CI溶液（AmmoniumChlorideSolution）
NHCI0.83g
KHCO0.1g
EDTA2Na0.0037g
蒸馏水加至100ml。
Tris-NH4CI溶液（Tris-AmmoniumChlorideSolution）
NH4CI3.735g/450ml双蒸水+Tris1.3g/50ml双蒸水（pH7.65）。
细胞裂解液（CellLysisSolution）
20mmol/LHEPES（pH7.5）
150mmol/LNaCl
1mmol/LEDTA
10g/mlleupeptin
1mmol/LPMSF
1%TritonX-100
0.5%deoxicholate（sodiumsalt）
0.1%SDS
组织匀浆缓冲液（HistolysisBuffer）
50mmol/LTris-HCI（pH7.5）
150mmol/LNaCl
1%NP40
1mmol/Lphenylmethylsulfonylfluoride
4g/mlleupeptin
1g/mlaprotinin
细胞核裂解液（NuclearLysisBuffer）
10mmol/LTris-HCl（pH8.0）
150mmol/LNaCl
10mmol/LEDTA
蛋白酶k100卩gml
0.4%SDS（最后加）
10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF
在异丙醇中溶解PMS至1.74mg/ml，即10mmol/L，分装后保存于-20C,
如果需要的话，可将储存液制备至17.4mg/ml，即100mmol/L的高浓度。
闪烁液（ScintillationSolution）
PPO（2,5-二苯基）5.0g、POPOP1,4-双—5—苯基）0.5g溶于1000ml二甲苯中。
也可将POPO加入二甲苯，在37C水浴上溶解后，再加PPO然后补足二甲苯。
3
H-TdR工作液（wokingSolution）
按1:
20的比例将浓度为1mCi/ml的3H—TdR用无血清的RPMI培养液稀释，终浓度为50Q/ml。
肝素溶液的配制：
含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓
度为50ug/ml。
因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为4C。
使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。
I型胶原酶：
0.1%I型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。
注意：
因为I型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。
分装入10ml小瓶-20°C保存。
用时提前一小时37C复温即可.0.1%的I型胶原酶的配置，100mg
的粉末状的I型胶原酶可以溶于100ml的DMEM/F12，0.22微米滤器过滤0.1%的I型胶原酶的配置，100mg的粉末状的I型胶原酶可以溶于100ml的DMEM/F12，0.22微米滤器过滤.
四、染色液配制（PreprationofStainingSolution）
苏木素液（HematoxylinSolution）:
苏木素2.5g，乙醇25.0ml，钾明矶2.5g，氧化汞1.25g，冰乙酸20.0ml，
蒸馏水500.0ml。
配制方法是先将苏木素溶于乙醇中（稍加热）。
将预先已溶
解明矶的蒸馏水加入苏木素乙醇液中，使溶液尽快沸腾后，将火焰熄灭，慢慢
加入氧化汞，防止溶液油溅出，再煮沸2min。
将烧瓶立即浸入冷水中，当染液
冷却后，加入醋酸，室温保存，用前过滤。
伊红Y染色液（EosinYSolution）
伊红Y0.5〜1.0g，蒸馏水75ml，95汇醇25ml，冰乙酸1〜2滴。
先取少
许蒸馏水加入伊红，用玻棒将伊红研碎，再加入全部蒸馏水，溶解后加入乙
醇。
甲基绿染色液（MethylGreeenSolution）
新购买的甲基绿需用氯仿处理去除甲基紫。
方法是将2刖基绿水溶液20ml
倾入洁净分液漏斗，移去慢慢下沉带紫红色的氯仿，再加入新的氯仿10ml，如
此反复更换氯仿，到无紫红色为止。
该液作为贮存液，4C保存。
染色液：
甲基绿贮存液5ml,5%R诺宁水溶液1ml，蒸馏水12ml,0.2mol/L乙酸钠（pH4.8）18ml（临用前配制，滤纸过滤）。
吖啶橙贮存液（AcridineOrangeStockingSolution）
10mg吖啶橙溶解于100mlPBS中，pH4.8〜6.0滤过，4°C避光保存。
吉姆萨贮存液（GiemsaSolution）
吉姆萨染色粉1g先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为止，再将全部（66ml）剩余甘油倒入，于56C温箱内保温2h。
然后再加入甲醇（66ml），搅匀后保存于棕色瓶中。
母液配制后放入冰箱可长期保存，一般刚配制的母液染色效果欠佳，保存时间越长越好。
临用时用pH7.4磷酸缓冲液稀释10倍，随配随用。
瑞氏染色液（Wright'sSolution）
瑞氏染色粉0.3g
甘油3ml
甲醇97ml
将瑞氏染色粉放干燥研钵内磨细，加入甘油继续研磨，不断滴加甲醇并继续研磨，将上层溶解的染料倒入棕色瓶中，直至染料全溶后加甲醇至所需量。
混匀后置棕色瓶中保存，用前过滤。
一般配制后置室温一周便可使用，保存时间愈入，则染色效果愈佳。
吉姆萨-瑞氏染色液（Giemsa-Wright'sStainingSolution）
瑞氏染色粉0.3g
吉姆萨染色粉0.03g
甲醇100ml
将二种粉末置于研钵中磨细，再逐滴加入甲醇混匀后倒入棕色瓶中，塞紧瓶口并充分振荡。
置室温溶解后使用。
噻唑兰（MTT
称取250mgMT，加50mlPBS（0.01mol/L，pH7.4）在磁力搅拌器上搅拌30min,用0.22m的微孔滤膜过滤除菌，分装，4C保存。
两周内有效。
台酚蓝染色液（TrypanBlueSolution）
A：
台酚蓝染料1g
蒸馏水100ml
将染料置于研钵中边研磨边加入蒸馏水溶解。
B:
NaCI1.7g
蒸馏水100ml
临用前A、B液1:
1混合，离心沉淀，取上清供染色用。
混合后的染液存放过久，易形成沉淀，故应新鲜配制。
染色时，取细胞悬液0.1ml加入新鲜配制的染色液一滴，室温下染5〜10分钟，取一滴悬液于载波片上，加盖玻片，高倍镜下检查。
死亡细胞膨大并染成浅蓝色，活细胞不着色，大小正常。
五、固定剂（Fixatives）
大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。
但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不同。
某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。
因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质
（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方
法）以及改进固定条件。
目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固
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