AOAC饲料中药物官方分析法.docx
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AOAC饲料中药物官方分析法
AOAC饲料中药物官方分析法（2000）
第5章40页
2000AOAC国际版5．3．02
杆菌肽预混剂AOAC官方分析方法
杯碟法
（本法应用于含≥10g杆菌肽/454g的预混剂）
A原理：
杆菌肽从已酸化有机溶剂系统中的饲料提取。
提取物离心，上清液用磷酸盐缓冲液稀释，然后用杯碟法用藤黄微球菌检定菌分析。
B试剂与装置
（a）微生物—藤黄微球菌ATCC号10240培养基（见5.3.01）
（b）提取溶剂—混合溶剂，27%乙腈（H3CN），27%甲醇，3%pH6.0的磷酸盐缓冲剂（见5.3.01）,41%水和2%磷酸（85%），加入0.5gEDTA/L（提取溶剂用EDTA饱和的）
（c）磷酸盐缓冲剂—5%，pH6.5，见957.23B（d）C（见5.3.01）
（d）稀释剂—甲醇—5%pH6.5磷酸盐缓冲剂（12+88）
（e）稀盐酸—小心加89ml盐酸至适量水中，并稀释到1L（1M）。
进一步稀释溶液1﹕100（0.01M）。
（f）钢管见957.23C（a）（见5.3.01）
（g）钢管分布器：
随机的见957.23（d）（见5.3.01）
C标准液
见957.24*（a）和（b）（见5.3.03）。
也即制备0.3和0.16u/ml溶液以平皿作成供试样品，用于监测定量用。
D杯碟准备
采用1个约15ml的琼脂抗生素培养基1，957.23A（a）（见5.3.01）。
通过实验皿最适的浓度（通常为0.02—0.05%）的藤黄微球菌ATCCNo1024，加到琼脂培养基上，使获得抑菌圈为15-17mm，用于0.2u/ml杆菌肽。
注入4个钢管内，标准曲线上的每点（即16个杯点），另外，4个杯为供试液。
标准曲线与杯碟两次（即32个钢圈），将作为检查样品0.3、0.16u/ml。
因此，总的将需要48个杯、两个曲线，对于每个预混剂样品加4个附加杯。
使琼脂培养基铺平，保持水平和一定硬度。
使用前转移到冰箱中，冷却≥1小时，所用碟当天配制。
E提取
准确称取含有约4600单位的杆菌肽饲料量装到300ml的容量瓶中，或相当的容量瓶，用100ml移液管加100ml的提取溶剂，用振荡器振摇，提取饲料≥5分钟，转移上清液到塑料离心管中，2000转/分离心10分钟，通过玻璃棉过滤上清液至刻度量器中，稀释到制取的终稀释度为0.2±0.05u/ml。
F铺碟
⑴采用16个接种杯碟用于第一曲线，采用0.20u/ml作为参照品。
在一个碟上，注入3个交替的不锈钢管作为参照碟，另3个钢管中一个为标准，以保证全部钢管注入恒定体积（即0.25ml）。
每样品用4个碟，包括0.3和0.16u/ml的检样品。
⑵用16个接种杯碟用于第二曲线，采用8个碟作为第2组碟子（0.3和0.16u/ml）的检样品。
培养碟子16-18小时，37±2℃。
读取抑菌圈最近似的毫米数，采用费歇尔-礼来抑菌圈读数器。
G测定
测定已校正过标准溶液的抑菌圈平均直径为（Z′），及样品抑菌圈平均直径为（Z）。
按957.23E（见5.3.01）,测定反映曲线直线回归的最小平方按下式计算:
Z′=mlogP′+b
其中P′=与Z′关连的标准溶液的效价（u/ml）
b=最小平方（作图斜率）截取的相应参数
用下式计算饲料中的效价:
杆菌肽g/453.6g=
其中D=总供试品稀释度
0．0108=453.6（g/453.6g）/42,000u/g杆菌肽
参照：
J.AOAC（杂志）65，1168（1982）
CAS（美国化学文摘登记号），1405-87-4）（杆菌肽）
修正版：
1997年3月
5.3.03菌肽饲料添加剂AOAC法定957.24微生物法
（应用于添加剂含有≥6g/453.6g）见42.227-42.231,第14版
5.3.04混合饲料中杆菌肽AOAC法定法965.48
（应用于含有≥20g杆菌肽/907kg的饲料
5.3.05复方饲料中杆菌肽-MD（BMD）的AOAC法定法表（993.29A）
应用于22-88g/907kg杆菌肽亚甲基双水杨酸盐猪和禽用复方饲料。
下表为实验室内研究的补充的认可的方法
微生物杯碟法实验室内研究结果用于测定猪和禽类饲料中杆菌肽-MD
表993.29A
添加杆菌肽g/907kg
测定的杆菌肽g/kg
RSDr′%
RSDR′%
平均
Sr
SR
猪饲料
22
22.97
2.02
4.18
8.78
18.22
44
47.62
4.18
9.79
8.78
20.57
88
92.81
9.43
17.20
10.16
18.53
禽饲料
22
22.98
2.13
3.94
9.27
17.15
44
43.95
6.34
7.01
14.42
15.94
88
89.76
7.73
14.08
8.08
15.69
A原理
在酸提取饲料样品中BMD抑制藤黄微球菌,形成的培养基抑菌圈，比较标准BMD杯碟结果，再计算标准剂量反映曲线。
B装置
杯与碟及分布器见5.2.01；957.23C（a）
（a）振摇器：
磁力适用
（b）搅拌器
（c）离心机：
为5200转/分（美国产）
（d）抑菌圈读数器：
（美国产）
（e）培养箱：
30-37℃±1℃
C试剂
（a）甲醇
（b）磷酸盐缓冲剂，5%，pH6.5见957.22B（5.3.01）
（c）HCl-甲醇液-0.24M,加20.4浓盐酸液至1L甲醇
（d）甲醇-磷酸盐缓冲剂-5%，混合150ml甲醇（a）和2850ml5%磷酸盐缓冲剂（pH6.5）。
用1.0MHCl调pH到6.5±0.1。
（e）试验菌。
藤黄微球菌ATCC10240。
（g）杯碟准备
溶解30.5g琼脂培养基A，957.23A（a）（见5.3.01）于1L水中，于15磅热后灭菌20分钟，冷至50℃用于培养试验菌。
注入约12ml/碟。
该碟贮于4-10℃，用前温至22-25℃。
表标准液制备
u/ml溶液容积
（ml）
稀释容积
（ml）
终浓度
（u/ml）
4
25
0.16
4
50
0.08
4
100
0.04
2
100
0.02
1
100
0.01
D标准液制备
准备称取杆菌肽锌（美国参考标准）用0.01MHCl溶解于50ml容量瓶中，使浓度为100u/ml，在4-10℃贮备液稳定约1周。
应用时当天立即配制10u/ml：
取5ml贮备液用磷酸盐缓冲剂稀释到50ml。
应用时当天，用10u/ml再配制1u/ml的溶液：
从10u/ml中取5ml，用磷酸盐缓冲剂补至50ml。
用此1u/ml的溶液配制下面的标准工作液。
所有稀释采用5%的甲醇-磷酸盐缓冲剂至容量瓶。
E供试品制备
⑴取过1mm筛颗粒，防止研磨细粉。
准确称取20-50g±0.1g，装进250ml离心瓶中。
⑵采用表中的容积（993.29C）（见下表），加盐酸-甲醇液（c），为供试部分，充分振摇，加甲醇-磷酸盐缓冲剂，将瓶放入振荡器中，密塞，充分振摇15分钟。
⑶于2100转离心10分钟。
轻轻倒出，收集上清液，作为“容积1”在密塞容器中。
⑷采用表中适当容积，加盐酸-甲醇液为供试液，充分振摇，加甲醇-磷酸盐缓冲剂中，将瓶放入振荡器中，密塞，充分振荡10分钟。
表993.29C猪与禽饲料中BMD
稀释模式与用微生物杯碟定量法测定
饲料规格
BMDg/907g
供试验部分
重量（g）
提取剂a
盐酸
甲醇b
甲醇pH6.5
缓冲剂c（ml）
总提取
容积（ml）
终稀释
20-25
26
1
45
45
130
5﹕25
2
25
25
40-50
25
1
50
50
150
3﹕25
2
25
25
80-100
21
1
45
45
130
3﹕50
2
20
20
a、1和2参照第1，E
（2），和第2，E（3）为供试样品提取物。
b、0.24MHCl甲醇液
c、5%甲醇（W/V）和5%磷酸钾（W/V）缓冲剂pH6.5。
⑸转移此“容积1”转回到提取瓶里，充分混合。
在2100转离心供试液5分钟。
⑹依据BMD稀释上清液部分至参比浓度（0.04±0.01u/ml），溶液终甲醇浓度标准变异应不大于10%。
⑺所有定量贮液于4-10℃贮存，若用时时间不超过1小时。
F铺碟
定量用溶液用前放至20-25℃，铺碟前充分振摇，接种碟于30-35℃培养，标准样与供试品样采用同一温度。
G计算
抑菌圈直径读最小到0.1mm，用标准计量反映曲线计算，手工或计算器计算。
测定供试品中BMD采用读取标准曲线中的浓度，计算饲料中效价，通过u/ml转换成××g/907kg。
用下式：
杆菌肽g/907kg=（u/ml×总稀释度/供试品重量）×21.19
参考：
J.OACInt.77,1072（1994）；
修正：
2000年6月。
第二亚章抗菌素用化学方法
5.2.01AOAC法定法982.44
杆菌肽预混剂液相层析法
1982年首次生效
A原理用酸性有机溶剂从饲料中提取，提取物离心，上清液用（逆相）层析在254nm光检出。
B试剂与装置
（a）液相层析仪—Hewlett-pactord型1084.A配有紫外分光检测器。
操作条件：
流速2.0ml/分钟，检测波长254nm，20ul循环（闭合注射阀）（美国××公司产）或相应设备，室温。
（b）柱析柱—15cm×4.6mm，含5ulSupelcosilLC-8反向包装物，所用的柱仅用于杆菌肽分析。
（c）磷酸盐-EDTA缓冲剂—pH4.5，溶解13.6g磷酸二氢钾和2.5gEDTA于1L水中。
（d）磷酸盐缓冲剂—pH6.0，溶解1.5g磷酸二氢钾和8.5g磷酸二氢钾于1L水中。
（e）溶剂系统—（见书982.44）所用溶媒见表,采用100ml容量瓶,用水稀释至刻度。
（f）流动相—59%（V/V）B溶剂（见982.44）与41%（V/V）A溶剂混合。
并用NaOH调节pH6.8，微调至B溶剂的百分容积可获得所需的期望的分离。
C标准样品制备
（a）标准样品干燥（注意：
杆菌肽易吸湿，用前当天干燥标准样品，并贮于干燥器中过夜）。
准确称量130—140mg的杆菌肽参照标准（Alpharm公司）物和皮重（=A）50ml容量瓶中。
干燥标准物与60℃减压下（＜5mmHg压力）干燥3小时。
取出放于干燥器中至冷再称量（=B）。
杆菌肽标准物的量=B-A。
（b）标准溶液的制备—注：
如在配制3小时之内不用于分析时，在冰箱中贮存
标准物最好。
在分析前配制标准时应在冰箱中贮存大于30分钟，分析前恰好从冰箱中取出。
标准溶液1—取杆菌肽标准样品，放入50ml量瓶中，用20ml提取溶剂（见表982.44）溶解，并稀释至刻度。
由此溶液在行配制下面的稀释液。
标准溶液2—移取20ml标准溶液1入25ml容量瓶中，并用提取溶媒稀释至容积。
标准溶液3—移取15ml标准溶液1入25ml容量瓶中，并用提取溶剂稀至容积。
D提取
准确称量含有约6000单位杆菌肽活性的饲料检品，入120ml量瓶中，用容量移液管添加50ml提取溶剂，强力振摇大于5分钟进行提取。
离心10分钟提取部分2～3分钟（2000-3000转/分钟），上清液用于定量（注：
如在3小时内不进行分析时，将提取液贮于冰箱中最好。
配制的检品液，在分析前贮存于冰箱中大于30分钟，于分析前从冰箱中取出。
）
表982.44溶剂混合物
溶剂
A溶剂（%）
B溶剂（容积%）
提取溶剂
乙腈
0
40
28
甲醇
0
12
28
磷酸盐-EDTA缓冲剂
20
20
0
磷酸盐缓冲剂@
0
0
3
浓盐酸@
0
0
1.0
@采用容量移液管
E测定
将从已离心的饲料中和标准溶液中所得的澄清上清液，注入层析仪中，从标准溶液开始，然后为2个检品溶液，再然后为另一个标准溶液，直至所有检测液和标准样品均被注入完。
测量用于检测液和标准溶液（pH）总峰和3个有效成分峰的高度（见图982.44）。
按下式采用作图直线的最小平方，计算标准样品的反应线：
pH′=m（p′）+b
式中：
pH′=标准溶液1、2和3的峰高；
p′=标准溶液1、2和3标准溶液的效价（单位/50ml）；
m,b=测定斜率和截距的最小平方。
测定饲料中杆菌肽的含量按下式进行：
杆菌肽/磅，g=
其中：
0.01080=453.6（g/磅）/42000（u/g杆菌肽）
杆菌肽/公斤=
参考文献：
JAOAC65卷，1178页（1982）CAS.1405-87-4（杆菌肽）
5.3.01饲料中抗菌素AOAC法定方法
微生物法
1957年生效
A培养基（无盐水可用于配制培养基）
（a）琼脂培养基A—（抗菌素培养基1）
溶解6.0g的胰消化的明胶，4.0g的胰消化消化酪蛋白，3.0g酵母浸膏，1.5g牛肉浸膏，1.0g的无水葡萄糖和15g琼脂等于水中（无盐水），并稀释至1升。
用1MNaOH或HCl（1+9）调pH使其灭菌后pH为6.5-6.6。
（b）琼脂培养基B—（抗菌素培养基4）
溶解6.0g胰消化明胶，3.0g酵母浸膏，1.5g牛肉浸膏，1.0g的无水葡萄糖和15g琼脂等于水中，并稀释至1升。
用1MNaOH或HCl（1+9）调pH使其灭菌后pH为6.5-6.6。
（c）琼脂培养基C—（抗菌素培养基2）
溶解6.0g胰消化明胶，3.0g酵母浸膏，1.5g牛肉浸膏和15g琼脂等于水中，并稀释至1升。
用1MNaOH或HCl（1+9）调pH使其灭菌后pH为6.5-6.6。
（d）琼脂培养基D—（抗菌素培养基8）
采用琼脂培养基C，用1MNaOH或HCl（1+9）调节终pH为5.7-5.9。
（e）琼脂培养基E—（抗菌素培养基5）
采用琼脂培养基C，用1MNaOH调节终pH为7.8-8.0。
（f）琼脂培养基F—用3.5MNaOH（2.8-3.8ml/L）调节,使灭后pH为8.9-9.1。
（g）琼脂培养基G—（抗菌素培养基32）
采用琼脂培养基A，向其中加300mgMnSO4H2O或0.4ml1%MnCl2溶液（W/V）/L。
（h）琼脂培养基H—稀释1L琼脂培养基A到1.2L并调节pHG至8.1.
（i）琼脂培养基I—溶解9.4g胰消化明胶，4.7g酵母浸膏，2.4g牛肉浸膏，10.0gNaCl,10.0g的无水葡萄糖，13.0g无水磷酸二氢钾，1g磷酸氢二钠•7H2O和23.5g明胶于水中，并稀释至1L。
灭后pH为5.3-5.5。
（j）琼脂培养基J—（抗菌素培养基11）
采用琼脂培养基A，用1MNaOH调终pH为7.9-8.0。
（k）琼脂培养基K—向每升琼脂热后及注入碟前向培养基J中加12.5ml2MCaCl溶液。
（l）琼脂培养基L—溶解0.69Gk2HPO4、0.45gkH2PO4、2.5g酵母浸膏，10.0g无水葡萄糖和15.0g琼脂于水中，并稀释至1升，用前用HCl调pH6.0。
（m）琼脂培养基M—溶解2.5g酵母浸膏，10.0g葡萄糖，0.69gk2HPO4、、0.45gkH2PO4及20.0g琼脂于水中，并稀释至1升。
接种前调节液化培养基pH为6.0（用1MHCl约2ml/L）。
（n）肉汤培养基A—（抗菌素培养基3）
溶解5.0g胰消化明胶，1.5g酵母浸膏，1.5g牛肉浸膏，3.5gNaCl,1.0g的无水葡萄糖，3.68g无水磷酸氢二钾及1.32g无水磷酸二氢钾于水中，并稀释至1L。
用1MNaOHL或HCl（1+9）调节,使灭后pH为6.95-7.05。
（o）肉汤培养基B—溶解5.0g胰消化酪蛋白（酪朊），5.0g胰消化动物组织和20g无水葡萄糖于水中，并稀释至1L。
用1MNaOH或HCl（1+9）调节,使灭后pH为5.6-5.7。
B试剂
（a）磷酸盐—碳酸氢盐缓冲剂—pH8
溶解16.73g无水K2HPO4,0.523g无水KH2PO4及20gNaHCO3于水中,稀释至1L。
（b）磷酸盐缓冲剂—pH8.0,0.1M
溶解16.73g无水K2HPO4及0.523g无水KH2PO4于水中,稀释至1L。
（c）磷酸盐缓冲剂—pH7.0,0.1M
溶解13.6g无水K2HPO4及4.0g无水KH2PO4于水中,稀释至1L。
（D）5%磷酸盐缓冲剂—PH6.5
溶解22.15g无水K2HPO4及20g无水KH2PO4于水中,稀释至1L。
（e）10%磷酸盐缓冲剂—PH6.0
溶解80g无水K2HPO4及20g无水KH2PO4于水中,稀释至1L。
（f）1%磷酸盐缓冲剂—PH6
溶解8.0g无水K2HPO4及2.0g无水KH2PO4于水中,稀释至1L。
（g）磷酸盐缓冲剂—pH4.5,0.1M
溶解13.6g无水K2HPO4于水中,稀释至1L。
（h）酸—丙酮—混合1容积4MHCl，13容丙酮和6容水。
（i）酸—甲醇—混合1容HCl和50容甲醇。
（j）醋酸乙酯—99%非变性标准。
（k）缓冲剂—丙酮提取剂混合等容积的PH6缓冲剂及（f）及丙酮。
（l）Tris缓冲剂（缓血酸胺缓冲剂）—Ph8.0,0.05M
溶解6.05g三（羟甲基）氨基甲烷（THAM）,于900mlH2O中,调pH至8.0（用HCl）,稀释至1L。
（m）氯化钙溶液—2M，溶解294.04gCaCl2•2H2O中,并稀释至1L。
（h）氯化钠—氯化钙溶液—溶解200gNaCl于水中，加10ml2MCaCl2，并稀释至1L。
（o）次氯酸钠溶液—5.25%
采用新开瓶的工业溶液.暗处贮于2-10℃。
（p）灭菌等渗盐液—溶解9.0gNaCl于水中,并稀释至1L,121℃热后灭菌20分钟.
（q）醋酸铅溶液—溶解303mg醋酸铅•3H2O于水中，用水稀释至1L。
C装置
高速搅拌装置，用前必须除去所有残留抗生素。
所有装置接触样品和溶液必须充分清净无污尘。
（a）钢圈—为不锈钢开口柱，8±0.1mm，6±0.1mm，高10±0.1mm。
放于琼脂培养基中用于定量。
（b）碟—玻璃或塑料，100mm宽×20mm深。
（c）圆柱分布器—（美国产）
D贮备培养基及试验菌悬液制备
一些适当的微生物标记如下，接种指示温度恒定于±0.5℃贮于暗处（2-10℃），如大于2周就不适用了。
试验菌悬液配制如下：
藤黄微球菌—ATCC.No.10240号。
接种贮备培养物（斜面）在32-35℃进行。
从贮备培养（斜面）上用约3ml肉汤培养基A洗生长物（菌体），转移此液体至300ml琼脂培养基A表面（在Roux瓶中）。
灭菌玻璃珠将混液打散，接到斜面上，于32-35℃培养过夜。
用25ml灭菌等渗盐溶液从琼脂表面上洗涤生长物，于2-10℃贮备菌悬液，用于杆菌肽定量用。
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