养殖101班刘东521091112.docx

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养殖101班刘东521091112

本科毕业设计（论文）

三种弧菌多联卵黄抗体疫苗制备及免疫效果研究

Thestudyofthepreparationandimmuneeffectsofyolkantibodyvaccineagainstthreekindsofvibrio

学院：

海洋学院

专业班级：

水产养殖学养殖101班

学生姓名：

刘东

学号：

521091112

指导教师：

张晓君（教授）

2014年6月

毕业设计（论文）中文摘要

三种弧菌多联卵黄抗体疫苗制备及免疫效果研究

摘要：

细菌病严重影响了我国海水养殖业的发展，每年给养殖生产造成巨大的损失。

卵黄免疫球蛋白（Eggyolkimmunoglobulin，IgY）可治疗由病毒、细菌等引起的人类及动物疾病，具有很高的安全性、不产生抗药性、服用简便等优点，切能提供营养，在水生动物疾病的治疗方面具有广阔的应用前景。

本研究针对严重危害海水养殖生产的病原哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）、鳗弧菌（V.anguillurm）、副溶血弧菌（V.heamolyticus），进行了多联卵黄抗体的研制及免疫效果研究，为海水养殖动物弧菌病的治疗开辟了一条通过被动免疫的有效途径。

制备哈维氏弧菌、鳗弧菌及副溶血弧菌三联抗原，研制出油乳剂灭活疫苗，免疫产蛋鸡，获得高免卵黄。

通过试管沉淀法及Elisa分别测定卵黄抗体的效价，结果表明在蛋鸡免疫4周后，卵黄中抗体的数量不断增加，抗体效价最高可达220。

将研制的卵黄抗体添加到半滑舌鳎配合饲料中投喂，投喂3,8,12,24h后取鱼的血液、脾脏、肾脏、肝脏、肠粘膜，用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测卵黄抗体的代谢吸收情况，结果表明，IgY经口服后很快到达直肠，继而血淋巴中也出现抗体，并可持续12h，肝胰、肾脏、脾脏也可出现抗体，但浓度稍低。

取蚤状幼体、糠虾幼体、仔虾分别投喂卵黄，对照组喂虾片，投喂2h后分别接种2ml的鳗弧菌、副溶血弧菌、哈维氏弧菌，结果表明，投喂卵黄试验组成活率明显高于投喂虾片的对照组，鳗弧菌感染的试验组，投喂卵黄抗体的蚤状幼体的死亡率降低41.4%，糠虾幼体降低42.6%，仔虾降低37.3%；哈维氏弧菌感染的试验组，蚤状幼体的死亡率降低27.3%，糠虾幼体降低31.3%，仔虾降低29.4%。

关键词：

弧菌；卵黄抗体；效价测定；免疫效果

毕业设计（论文）外文摘要

Thestudyofthepreparationandimmuneeffectsofyolkantibodyvaccineagainstthreekindsofvibrio

Abstract:

Bacterialdiseasehasseriouslyaffectedthedevelopmentoftheaquacultureindustry,resultinginthehugelossesoftheaquacultureproductioneveryyear.Yolkimmunoglobulin（Eggyolkimmunoglobulin,IgY）cantreathuman,animaldiseaseswhichisinducedbyviruses,bacteriaandothercauses.Yolkimmunoglobulinisofhighsecurityasexual,noresistance,simplicityinusing,toprovidenutrition.So,inprevention,treatmentaquaticdiseasesaspect,ithasaverybroadapplicationprospects.Inthisstudy,pathogenicV.harveyi,V.anguillarum,V.parahaemolyticus,whichareseriousharmtomarineaquacultureproduction,wereexperimentedthemanufactureandimmunologicaleffectsofmulti-jointyolkantibody.Itopensupaneffectivewayofpassiveimmunizationforaquacultureanimalsvibriosistreatment.BypreparationharveyiV.parahaemolyticusandV.anguillarumtripleantigen,weinactivatedoilemulsionvaccine,developedimmunehens,collectedyolk.ByTubeprecipitationsandElisa,respectivelymeasuringthetiterresultsofeggyolkantibody,theresultsshowthatthenumberoftheeggyolkantibodiescanbeincreasingafterfourweeksofimmunizationinlayinghens,whichcanwillbecontinuinguntilthefirstsixweeks,withthetitersoftheantibodyupto220.AddingtheeggyolkantibodytothefeedingoftheGünthertofeed,fishfeedingaftert3,8,12,24,hakestheblood,spleen,kidney,liver,intestine.Detectingthemetabolicabsorptionofyolkantibodiesbyenzyme-linkedimmunosorbentassay（ELISA）,theresultsshowthatIgYquicklyarrivestherectumafteroraladministration,andthenthereexsitshemolymphantibodiesanditwillbesustainablefor12h.Liverandpancreas,kidneys,spleenmayalsooccurantibodies,butthedensityislower.Zoeamysidshrimplarvae,larvaetakedwererespectivelycastedintoyolk,andatthesametimethecontrolgroupfedprawncrackers,wereinoculatedwith2ml,10mleelV.parahaemolyticus,V.harveyi.Theresultsshowedthattheexperimentalgroupfedeggyolkwassignificantlyisobviouslyhigherthanthecontrolgroupfedprawncrackersinthesurvivalrate.IneelVibrioinfectiontestgroup,themortalityrateofzoeareducedby41.4%,themortalityrateofmysidshrimplarvaereducedby42.6%,andthemortalityrateoflarvaereducedby37.3%byfeedingwitheggyolkantibody;intheV.harveyiinfectionexperimentalgroup,themortalityrateofzoeareducedby27.3%,themortalityrateofMysisreducedby31.3%,andthemortalityrateoflarvaereducedby29.4%.

Keywords:

vibrio;Eggyolkantibody;Titerdetermination;immuneeffect

目录

1前言．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．.．．．．．．．．．．．．．6

1.1　水生动物病原弧菌的研究．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．.．．6

1.2　细菌疫苗研制及产业化开发国内外发展趋势与现状．．．．．．．．．．．．．．．．..7

1.3　卵黄抗体特性及其应用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8

1.4　研究目的及意义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．8

2　仪器与试剂．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10

2.1　仪器设备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10

2.2　试剂与培养基．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10

3　试验方法．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．.．11

3.1　供试菌株．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11

3.2　免疫原的制备　．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11

3.3　油乳剂灭活疫苗的研制．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11

3.4　油乳剂灭活疫苗免疫产蛋鸡．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11

3.5　卵黄抗体的检测．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11

3.6　卵黄抗体的效价测定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．11

3.7　卵黄抗体饲料的制备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12

3.8　卵黄抗体吸收代谢试验．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13

3.9　三种病原菌高免卵黄抗体免疫保护力．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13

4　分析与结果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13

4.1　卵黄抗体试管凝集效价．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13

4.2　卵黄抗体吸收试验．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15

4.3　三联卵黄抗体的免疫保护效果．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．15

5　结论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17

5.1　三种弧菌多联卵黄抗体的制备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17

5.2　卵黄抗体的吸收及代谢．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．17

5.3　卵黄抗体对人工感染弧菌病的保护作用．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18

参考文献．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18

致谢．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．18

1　前言

鱼类病害的原因包括营养缺乏如缺乏维生素等，机械损伤如体表受伤等，感染病原体如病原微生物的入侵等。

细菌病的研究一直是科研人员研究的重点。

大约有40种海洋鱼类病原菌已报道，主要病原菌有弧菌（Vibro）、爱德华氏菌（Edwardsiella）、巴斯德氏菌（Pasturella）、屈桡杆菌（Flxibacrer）、气单胞菌（Aeromonads）、假单胞菌（Psuedomonas）、肾杆菌（Renibacrerium）、链球菌（Strptococcus）、分枝杆菌（Mycobacterium）、诺卡氏菌（Nocardia）等（Austin和Austin,1987；Fryer和Rohovec,1993）[1]。

1.1　水生动物病原弧菌研究

弧菌能够引起海水养殖鱼类较高的死亡率，由弧菌感染引起的水生动物疾病具有一般细菌感染的特点：

高死亡率，高爆发率，持续时间长，涉及面积广。

对水产养殖危害较大。

已经记载了有30多种弧菌属细菌,在这些弧菌之中,很多种是能够引起鱼类疾病的致病菌[2]。

据报道在海水鱼类发现的弧菌病原有鳗弧菌（Vibrioanguillarum）、副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）、哈维氏弧菌（V.harveyi）、溶藻弧菌（V.alginolyticus）、灿烂弧菌（V.splendidus）、创伤弧菌（V.vulnificus）、杀鲑弧菌（V.salmonicida）、海利斯顿氏菌（V.pelagius）、美人鱼弧菌（V.damsela）、鲨鱼弧菌（V.carchariae）以及拟态弧菌（V.mimicus）、病海鱼弧菌（V.ordalii）、海产弧菌（V.marinus）、黏液弧菌（V.visosus）、竹荚弧菌（V.trachuri）和鱼肠道弧菌（V.ichthyobnteri）等多种弧菌可以引起鱼类病害（Austin和Austin,1987；Fryer和Rohovec,1993;Lunder等，1995；Ishimaru等，1996）[3]。

1.1.1　鳗弧菌

鳗弧菌属于革兰氏阴性菌，有运动能力，当水体温高，营养物质丰富时，鳗弧菌繁殖速度急剧增加，数量增多，可引起很多水产经济动物特别是养殖鱼类的流行性疾病。

鳗弧菌流行可在世界范围引起，可感染，虹鳟鱼，鳗鱼，鲈鱼，鳕鱼，鲽鱼，黄鱼[4]。

鳗弧菌是条件致病菌，当水产养殖动物在不良的环境条件下，遭遇不利刺激或是受伤时，会诱发疾病的产生。

[5]研究人员报道，一些受感染的鳗弧菌鱼体首先出现在体表褪色，鳍条充血，肛门红肿，体表发黑，鳍部出现溃烂；解剖检验时有明显的黄色粘稠腹水，肠粘膜组织腐烂脱落[6]。

1.1.2　哈维氏弧菌

哈维氏弧菌主要存在盐碱环境中，其主要特性为革兰氏阴性，呈杆状或短杆状，具极生鞭毛，哈维氏弧菌是鱼、虾、贝等水产经济动物的主要致病菌之一，已经被证实是大黄鱼弧菌病的主要致病菌，也容易感染大菱鲆、鲈鱼等。

因为哈维氏弧菌广泛存在于天然水和海水养殖区，往往造成大量的水生经济动物死亡，感染病鱼的主要症状为皮下出血,肛门发红,头颅两侧、尾鳍末端以及体侧出现红斑,并逐渐发生溃烂;解剖发现病鱼肝肾肿大,肠壁充血并有黄绿色粘液从肛门溢出。

一般从体表出现出血症状后,1～6d便死亡,为急性感染;流行时间以夏季高温期为主。

[7]

1.1.3　副溶血弧菌

副溶血弧菌是一种嗜盐性细菌[8]，因此在无盐培养基上不能生长，存在于近海岸的海水、海底沉积物及鱼类和贝类等海产品中。

食用了被副溶血弧菌感染的的海鲜能引起食物中毒，是我国沿海地区食物中毒中最常见的一种病原菌。

病人的主要临床症状有腹泻和腹部痉挛性疼痛；严重者可引起败血症；其它组织偶尔会产生病变。

目前研究认为，副溶血弧菌的致病力包括细菌产生的毒素（溶血素、尿素酶）和侵袭力。

1.2　细菌疫苗研制及产业化开发国内外发展趋势与现状

20世纪70年代末，由荷兰英特威公司率先在世界上推出了首例防治鲑鱼弧菌病（Vibriosis）和肠红嘴病（EntericRedmouthDisease）的福尔马林细菌性灭活疫苗，通过浸泡给药，有效抑制了弧菌病的爆发和蔓延，在北美鲑鱼养殖生产中取得了巨大的商业成功，开启了世界鱼类疫苗的商业化进程。

1975年，美国疫苗有限公司获准生产商业性渔用疫苗。

1988年，挪威法玛克公司首先在欧洲开发出抗冷水弧菌病的细菌灭活疫苗，并因此拯救了挪威的三文鱼产业。

随后，面对欧洲鲑鱼养殖业的另一重大病害疖点病（Furunculosis）的困扰，1991年法玛克公司开发的世界首例疖点病细菌灭活鱼疫苗获得欧洲商业许可。

在随后的十年中，以这两家公司为代表，相继商业开发出弧菌病、疖点病、传染性胰腺坏死病等的三联、四联、五联和六联疫苗。

而瑞典诺华动物保健公司则在病毒性疫苗的商业开发上占据优势，相继开发出世界上首例传染性鲑鱼贫血病（InfectiousSalmonAnaemia，ISA）病毒疫苗和传染性造血坏死（InfectiousHaematopoieticNecrosis，IHN）病毒病疫苗。

这些疫苗的陆续上市和广泛应用，使得欧洲的鲑鱼养殖业病害得到有效控制，并显著降低了抗生素在水产养殖业中的使用量，使挪威乃至整个欧洲的鲑鳟养殖业摆脱了对抗生素的依赖。

在1990年代前，各种商业化的鱼疫苗开发主要由各水产养殖国的本土小型公司承担。

其后通过各种国际兼并购的跨国资本运作，逐渐形成了以荷兰英特威（Intervet）国际公司（2008年被美国先灵葆雅动物保健公司收购）、瑞典诺华（Novartis）动物保健公司、挪威法玛克（Pharmaq）动物保健公司和德国拜耳（Bayer）动物保健公司为代表的几家跨国公司垄断的市场运作局面。

他们的疫苗产品目前主要针对北欧、智利、加拿大和美国的鲑鱼及鳟鱼养殖市场。

进入21世纪后，随着基因工程技术的日渐成熟和安全性认知的深入，以基因工程疫苗为主要特征的鱼疫苗陆续被商业许可。

2001年，世界上首例由荷兰英特威公司开发的鲶鱼肠败血病减毒活菌疫苗获得美国农业部商业许可，用于预防美国鲶鱼养殖业中的爱德华氏菌病。

2005年，该公司又在美国上市了鲶鱼柱形病（Columnaris）减毒活疫苗，每年可挽回病害损失至少8000万美元。

另一方面，针对鳕鱼、欧洲鲈鱼、鲷类等新兴养殖品种的出现，疫苗商业开发的重点逐渐转移到新鱼种上。

2003年，英特威公司的大西洋鳕鱼弧菌病疫苗在挪威上市，2005年，黄鰤鱼弧菌病疫苗进入日本市场。

法玛克公司紧随其后推出鳕鱼弧菌病三联疫苗。

2004年，德国拜耳公司则在智利市场成功上市了立克次氏体败血症灭活疫苗。

同时，联苗的更新换代以及在智利、英国、爱尔兰、加拿大等鲑鱼养殖主产国的商业许可拓展成为各疫苗公司的主要开发内容。

挪威法玛克公司和荷兰英特威公司相继于2001至2010年间先后在智利、加拿大、英国、冰岛、芬兰、丹麦、爱尔兰、希腊登国获得弧菌病、疖点病、IPN病毒病、PD病毒病、立克次氏体败血症等单联和多联疫苗的市场准入。

亚洲地区已成为水产疫苗跨国公司竞相争夺的最后一片市场。

[9]

1.3　卵黄抗体特性及其应用

卵黄免疫球蛋白（eggyolkimmunoglobulin）简称IgY，是一种存在于卵黄中的IgG，因此又称之为卵黄抗体。

[10]目前研究较多的是鸡卵黄抗体，Williams等（1962）研究发现，用某种抗原免疫产蛋母鸡后，鸡血清中可产生相应的抗体，产蛋母鸡又能以产蛋的方式将血清中IgG有效地转移至卵黄中。

[11]不同的抗原刺激产蛋鸡会产生不同的特异性抗体。

1.3.1　卵黄抗体的特性

①鸡蛋的生产成本低，卵黄抗体提纯技术成熟，无需采血，无损伤。

②由于禽类与哺乳动物系统发育的差距，两者的亲缘关系较疏远，哺乳动物的蛋白质抗原在禽体内更易产生特异性高的抗体，易于提纯。

IgY产量高。

③服用IgY安全可靠，对肠道正常菌群无副作用，不存在药性和药物残留问题，且能够提供营养。

[12]

1.3.2　卵黄抗体的应用

卵黄抗体作为一种具有生物活性的免疫球蛋白，具有较好的稳定性，耐酸、耐碱、耐热特性。

胃液对干粉抗体效价影响不大，卵黄抗体制成喷雾干燥粉，正常喷出的干粉抗体滴度与卵黄液一致；卵黄抗体较易保存，卵黄抗体作为一种安全、高效的预防与治疗性生物制剂被广泛应用于生产实践，实现利用外源抗体口服免疫疗法为海水养殖动物提供被动免疫。

[13]

1.4　研究目的及意义

1.4.1　海水养殖动物弧菌病的频发、暴发、并发、多发已成为养殖生产的瓶颈

弧菌病是在世界各地海水养殖业中普遍流行且表现危害最大的细菌性疾病，给水产养殖业造成了严重的经济损失。

尤其是鳗弧菌、哈氏弧菌、解藻朊酸弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌、副溶血弧菌等病原弧菌是我国海水养殖业中危害鱼的种类最多、流行地区最广、危害养殖水域类别最多、造成的损失最大的一类传染性疾病。

因此系统调查研究海水养殖生产中主要病原弧菌种类，分布流行规律，为海水养殖生产中的病原弧菌检测、早期诊断以及防治奠定基础。

[14]

1.4.2　渔药残留直接威胁人类的生命和健康，水产养殖动物群发病的高效免疫预防迫在眉睫

在水产养殖动物细菌性疾病防控方面，目前在生产中大多使用化学合成药物或抗生素类药物控制这些细菌性疾病的发生与流行，但长期的药物使用存在用药盲目性、有效面窄、预防作用弱、药物在动物体中残留、耐药性微生物大量出现等很多不足。

此外，长期在药物“保护作用”下使大量本应被淘汰的抗病力弱的个体存活下来且在种群中所占比例逐渐增大而导致整个群体的抗病能力下降，严重影响了养殖业的发展。

另外还有一些不法者为谋取经济利益而违法使用国家明文规定的禁止药物，导致水产品中存留有害成分。

我国的海产品安全形势严峻、问题突出，因渔药残留和其它有毒有害物质超标等直接威胁人类的生命和健康。

[6]因此，在当今的水产动物养殖领域，对水产养殖动物主要病害尤其是群发病的高效防控，并已构成了高效益、无公害养殖的关键所在和发展趋势。

1.4.3　被动免疫（直接使用抗体），对控制水产动物弧菌病的发生更具优越性

免疫学的研究已经表明，人及动物经特异疫苗免疫接种后，所诱导的体液免疫产生的抗体在人及哺乳类动物可以通过初乳向其子代传递，但禽则是通过卵黄向其子代传递，从而使子代在出生后的一定时间内获得相应特异免疫保护，抗御被相应病原微生物的感染。

虾、蟹类对感染或抗原的反应通常是吞噬作用，科学界尚未确定虾、蟹类有无特异性免疫，因此借助于预防兽医学研究的技术和手段，研制一种全新的抗生素的代替品——多价卵黄抗体疫苗，集营养、特异抗病于一体，在水产动物疾病防控方面开辟一条通过被动免疫的有效途径。

该卵黄抗体生物制剂将在预防与治疗鱼类及甲壳动物疾病方面具有良好的应用前景，尤其是对