第六章生物合成技术.docx
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第六章生物合成技术
生物合成技术
生物技术，又称生物工程或生物工程技术，是生物科学与工程技术相结合而形成的新学科。
生物技术主要包括基因工程、蛋白质工程、细胞工程、酶工程和发酵工程。
基因工程又称为重组DNA技术，是通过人工操作，在分子水平上进行基因重组、改造和转移，以获得具有新的遗传特性的细胞，合成人们所需物质的技术过程。
酶工程是酶的生产与应用的技术过程。
即是通过人工操作，获得人们所需的酶，并通过各种方法使酶发挥其催化功能的技术过程。
细胞工程是在细胞水平上改变细胞的遗传特性或通过大规模细胞培养以获得人们所需物质的技术过程。
发酵工程又称为微生物工程，是在人工控制的条件下，通过微生物的生命活动而获得人们所需物质的技术过程。
发酵方式主要分为固体发酵和液体发酵两大类。
生物技术可以定向改造生物、加工生物材料，有目的地利用生命过程，广泛应用于医药、农林牧渔、生态、轻工食品、化工、能源、材料、海洋开发及环境保护等领域，涉及面广，促进传统产业的改造和新型产业的形成。
实验1大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
一、实验目的
1.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2.学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。
二、实验原理
转化是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。
转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。
受体细胞经过一些特殊方法处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过感受态细胞。
在一定条件下，将外源DNA分子与感受态细胞混合保温，使外源DNA分子进入受体细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养即可筛选出转化体。
本实验以E.coliDH5α菌株为受体细胞，用氯化钙处理受体菌使其处于感受态，然后在一定条件下与pBR322质粒携带有抗氨苄青霉素和抗四环素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌也具有抗氨苄青霉素和抗四环素的特性，常用Ampr，Tetr符号表示。
将经过转化后的全部受体细胞经过适当稀释后，在含有氨苄青霉素抗四环素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素和四环素的能力都被杀死，所有带有抗药基因的质粒DNA能使受体菌从对抗菌素敏感（Amps，Tets）转变为具有抗药性（Ampr，Tetr），即表明了该质粒具有生物活性。
这种转化活性是检查质粒DNA生物活性的重要指标。
转化体经过进一步纯化扩增后，再将转入的质粒DNA分离提取出来，可进行重复转化、电泳、电镜观察及做限制性内切酶酶解图谱、分子杂交、DNA测序等实验鉴定。
为提高转化率，实验中要注意以下几个重要因素：
（1）细胞生长状态和密度：
不要用已经过多次转接及贮存在4℃或室温的培养菌液；细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为最佳（可通过测定培养液A600nm控制），密度不足或过高均会使转化率下降。
（2）转化的质粒DNA的质量和浓度：
用于转化的质粒DNA应主要是共价闭环DNA（即cccDNA，又称超螺旋DNA），转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时则会使转化率下降。
（3）试剂的质量：
所用的试剂，如氯化钙等，应是高质量的，且最好分装保存于干燥的暗处。
（4）防止杂菌和其它外源DNA的污染：
所有器皿，如离心管、分装用的Eppendorf管等，一定要干净，最好是新的。
整个实验过程中要注意无菌操作。
氯化钙转化法由Cohen等首创。
其转化率一般能达到每1μg超螺质粒DNA产生5×106~2×107个转化体，足以满足常规基因克隆试验的需要。
该法具有简单、快速、稳定、重复性好、菌株适用范围广等优点而被广泛采用。
三、仪器、材料与试剂
材料：
E.coliDH5α受体菌（Amps，Tets），pBR322质粒
试剂：
含抗菌素的LB平板培养基：
将配好的LB固体培养基高温灭菌20min后，冷却至60℃左右，加入氨苄青霉素和四环素贮存液，使终浓度分别为50μg/mL和μg/mL，摇匀后铺板。
LB液体培养基：
胰蛋白胨10g/L，酵母浸膏5g/L，氯化钠10g/L，用氢氧化钠调节至pH。
120℃高温灭菌20min。
氨苄青霉素和四环素贮存液：
用50%乙醇配制。
mol/L氯化钙溶液：
每100mL溶液中含无水氯化钙g，用无菌重蒸水配制，灭菌处理。
仪器：
恒温摇床、电热恒温培养箱、无菌操作超净台、电热恒温水浴箱、分光光度计、台式离心机、带盖离心管、吸量管或自动加样器、Eppendorf管等。
四、实验内容
1.感受态细胞的制备
（1）从新活化的E.coliDH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3mLLB液体培养基中，37℃振荡培养12h左右至对数生长期。
将该菌悬浮液以1：
100接种量转接于100mLLB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20~30min测一次A600nm，至A600nm≤停止培养。
（2）培养液转入离心管中，在冰上冷却片刻后，于0~4℃，4000r/min离心10min。
倒出上清培养液，并将离心管倒置在滤纸片上1min，使残留的培养液流尽。
用10mL冰冷的mol/L氯化钙溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15~30min。
于0~4℃，4000r/min离心10min。
弃去上清液，加入2mL冰冷的mol/L氯化钙溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后即制成了感受态细胞悬液。
（3）以上制备好的感受态细胞悬液可在冰上放置，24h后直接用于转化实验，也可加入等体积30%灭菌甘油，混匀后，分装于mLEppendorf管中，每管含100~200μL感受态细胞悬液，置于-70℃条件下保存半年至一年。
2.转化
（1）取100μL摇匀后的感受态细胞悬液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面操作），加入pBR322质粒DNA溶液2μL（含量不超过50ng，体积不超过10μL），此管为转化实验组。
同时做两个对照管。
受体菌对照组：
100μL感受态细胞悬液+2μL无菌重蒸水。
质粒DNA对照组：
100μLmol/L氯化钙溶液+2μLpBR322质粒溶液。
（2）将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42℃水浴中保温min，然后迅速在冰上冷却3~5min。
（3）上述各管中分别加入100μLLB液体培养基，则总体积为mL，该溶液称为转化反应原液。
混匀，于37℃水浴中温浴45min（欲获得更高的转化率，此步也可恒温摇动培养），使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体产生抗药性（Ampr，Tetr）。
3.稀释和平板培养
（1）将上述经培养的转化反应原液摇匀后，进行梯度稀释，方法见表1.
表1转化反应原液梯度稀释表
试管号
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
转化反应原液/mL
原液
稀释液1
稀释液2
稀释液3
稀释液4
稀释液5
稀释液6
稀释液7
稀释液8
稀释液9
稀释液（LB液体培养基）/mL
稀释浓度
10-1
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
10-10
稀释倍数
101
102
103
104
105
106
107
108
109
1010
（2）分别取适当稀释度的各样品培养液mL，接种于两种（含抗菌素和不含抗菌素）LB平板培养基上，涂匀。
以上各步操作均需在无菌超净台上进行。
（3）待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养24h，待菌落生长良好而又未相互重叠时停止培养，每组平行做两份。
4.检出转化体和计算转化率
统计每个培养皿中的菌落数，各实验组平皿内菌落生长情况应如表2所示。
表2各实验组在培养皿内生长情况及结论
不含抗菌素培养基
含抗菌素培养基
结果说明
受体菌对照组
有大量菌落长出
无菌落长出
本实验中未产生抗药性突变株
质粒DNA对照组
无菌落长出
无菌落长出
pBR322质粒DNA溶液不含杂菌
转化实验组
有大量菌落长出
有菌落长出
pBR322质粒进入受体细胞使其产生抗药性
所以，转化实验组在含抗菌素培养基平皿中长出的菌落即为转化体，根据此皿中菌落数则可计算出转化体总数和转化率，计算公式如下：
再根据受体菌对照组不含抗菌素平皿中检出的菌落数，则可求出转化反应液内受体菌总数，进一步可计算出本实验条件下，由多少个受体菌可获得一个转化体。
五、注意事项
（1）本实验涉及溶液的移取、分装等需敞开实验器皿的操作，均应在无菌超净台中进行，以防污染。
（2）衡量受体菌生长情况的A600nm和细胞数之间的关系随菌株的不同而不同，因此，不同菌株的合适A600nm是不同的。
（3）转化菌不宜培养时间过长，使其菌落过多而重叠，妨碍计数和单菌落的挑选。
六、思考题
1.如果一次实验的转化率偏低，应从哪些方面去分析原因
2.制备感受态细胞的基本原理是什么
3.如果在对照组不该长出菌落的平皿中长出了一些菌落，你该怎样分析你的实验结果，并进行下面的实验
实验2PCR扩增基因特异片段
一、实验目的
1.学习PCR体外扩增的原理及其引物设计原则；
2.了解扩增过程中各因素对扩增结果的影响；
3.掌握PCR的基本操作
二、实验原理
PCR（polymerasechainreaction）是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。
在分子生物学研究中，广泛地应用于研究基因突变，获取加上酶切位点的目的基因和DNA序列测定等方面，是分子生物学中一项极为常用的技术。
PCR的原理是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。
两个引物分别位于靶序列的两端，同两条模板的3＇端互补，由此限定扩增片段。
PCR反应由一系列的变性—退火—延伸反复循环构成，即在高温下模板双链DNA变性解链，然后在较低的温度下同过量的引物退火，再在适中的温度下由DNA聚合酶催化进行延伸。
由于每一循环的产物都可作为下一循环反应的模板，因此扩增产物的量以指数级方式增加。
理论上，经过N次循环可使特定片段扩增到2n-1，考虑到扩增效率不可能达到100％，实际上要少些，通常经25～30次循环可扩增106倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。
（一）PCR引物设计
1.Tm值Tm值是PCR引物设计中的一个重要参数，是指引物与模板之间精确互补并且在模板过量的情况下有50％的引物与模板配对，而另外50％的引物处于解离状态时的温度，Tm值一般高于55℃。
合适的引物选择应需考虑到以下因素，如Taq酶的最适温度（TE）和Tm值等。
最常用的Taq酶的最适温度（TE）范围为70～74℃，根据TE可以先确定一个合适的退火温度范围（Ta）。
这个温度范围应不高于酶的最适反应温度，也不能比TE－25℃更低。
这是因为如果退火温度低于酶的最适反应温度时，酶的合成反应会非常缓慢，但片面考虑提高温度又会造成引物脱落而不能进行PCR扩增。
所以Ta的选择应满足TE-25℃2.引物的长度引物长度一般在15～30个核苷酸之间比较合适。
引物过短时造成Tm值过低，不能与模板很好地配对或是配对专一性很低。
引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶的最适反应温度，还使合成引物的费用大大增加。
当然若要在引物的5＇末端加上特定的酶切位点等碱基则可稍长。
3.引物的GC％含量引物的GC比最好设计在40％～60％的范围内。
GC比过高与过低都会直接造成Tm值的过高与过低。
如上所述，Tm值的估计可简单地根据经验式Tm＝4×GC+2×AT+℃获得。
4.引物3′端起始碱基Taq酶在3′末端错配时延伸效率是不一样的，延伸效率为T>G＝C>A。
即当引物3′末端为A时，即使有错配碱基也最不易延伸，所以引物设计时可将3′末端设计为A，以提高复制精确性。
另一种理论是3′末端应设计为G或C，因为G和C的氢键多于A与T，能更好地与模板结合开始DNA合成，当然对错配延伸效率方面就不能苛求了。
总而言之，引物的3′末端不要考虑使用T。
5.引物无发卡结构引物自身应无发卡结构。
6.二引物自身之间不能配对二引物自身不能配对是指同一对引物之间不能有配对的多个碱基，特别是在引物的3′末端。
二引物间不能配对的道理与二引物本身不能配对相同，若发生这种情况会形成引物二聚体，造成扩增失败。
一般引物自身配对形成茎环结构，茎的碱基对数不大于3，两条引物间配对碱基数小于5个。
7.二引物的Tm值引物设计时应注意使二引物的Tm值相近，否则二个引物必然不能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR扩增效果。
能同时达到最佳退火温度，将会影响PCR扩增效果。
由于影响引物设计的因素比较多，所以常利用计算机来辅助设计，通常可用primer软件或其它PCR引物设计程序来帮助设计。
（二）PCR反应条件
1.PCR缓冲液常用的1×PCR缓冲液为10mmol/LTris-HCl（常温），50mmol/LKCl，LMgCl2。
由试剂公司与Taq酶一起提供。
（1）Mg2+离子浓度：
Mg2+离子浓度对PCR反应影响很大，因为[Mg2+]与引物-模板及产物的解链温度、产物的特异性、引物二聚体的生成、产物的忠实性、酶活力、产物的产量等诸多因素有关。
Mg2+一般使用浓度为～L，必要时可以L梯度间隔做Mg2+最适浓度试验。
（2）dNTP：
常用dNTP浓度为20μmol/L（可用范围为20～200μmol/L）。
dNTP的用量与PCR产量及产物忠实性有关，dNTP量过少时合成的产物减少。
可以被Taq酶接受的经过修饰的dNTP有以下几类：
dig-11dUTP、5—bromo-dUTP、biotin-11—dUTP、biotin-16—dUTP、7—deaza-dGTP和次黄嘌呤。
但不是所有的聚合酶都能接受经过修饰的dNTP。
（3）K+离子浓度：
PCR反应中K+离子的作用是促进Taq酶活力与促进引物退火，一般使用浓度是50mmol/L，但当K+离子浓度高于50mmol/L时会抑制Taq酶活力。
（4）pH值：
PCR反应中用的是Tris-HCL缓冲系统。
Tris-HCL缓冲系统的特点是具有很高的温度系数℃），20℃时pH为的缓冲液在72℃延伸反应时，实际pH值降低至。
而Tricine的温度系数较高，在扩增长片段时用Tricine系统。
（5）保护剂：
由于PCR反应体系中蛋白的含量极低，所以加人的酶非常容易变性，通常需加入一定量的保护剂。
如5mmol/L的二硫苏糖醇（DTT），100μg/ml的小牛血清白蛋白（BSA）或％的明胶。
加入保护剂对PCR循环数较多的扩增反应效果尤其明显。
2．模板PCR模板可以是DNA或RNA，RNA需反转录后再扩增。
模板可以是基因组DNA或纯化的质粒DNA，当然两者的DNA量在PCR起始模板中相差很大。
每个PCR反应中加入的模板数量可在102～105分子之间，必要时可低至50个分子，模板的量少时应酌情增加循环次数。
小于100ng的哺乳动物细胞基因组DNA（相当于约104个细胞），经30个循环，10％的反应物应能够在溴化乙锭染色的凝胶上看到一条主要产物带。
使用较大量的模板时，循环数可减少；如果模板量很少，可能需要增加至45个循环反应。
3．引物浓度常用引物浓度为～μmol/L。
随着引物浓度的降低，PCR反应的特异性提高但产物得率降低；随着引物浓度的升高，情况正好相反。
4．PCR反应中的酶Taq酶最早是从水生嗜热菌（thermusaquaticus）中分离得到的，该酶的最适温度是72℃，在94℃时相当稳定，半衰期长达38min。
由于这种酶使用最早最广泛，文献中所列各项最适反应条件都是针对此酶优化的，使用其它的聚合酶时按试剂盒使用说明书操作。
三、仪器、材料与试剂
1.仪器：
PCR仪，微型水平电泳槽，电泳仪等
2.试剂：
50×TAE电泳缓冲液、10×PCR缓冲液、4种dNTP混和液、PfuDNA聚合酶、引物（20μM）、10×溴酚蓝上样缓冲液等
四、实验内容
1.在PCR仪上设置好程序。
2.在两个灭菌的离心管中，按下列顺序加样，建立20μl反应体系。
总体积为20μl，对照水（空白对照）。
ddH20
15μl
10×PCRBuffer
2μl
dNTP（10mMeach）
μl
Primerl（20μM）
μl
Primer2（20μM）
μl
模板DNA（50ng）D16
PfuDNA聚合酶（）
1μl
μl
3.混匀，短暂离心。
4.放在PCR仪上进行PCR反应。
94℃变性3min，94℃45秒，64℃1分钟，72℃3分钟，20个循环。
（用旧式的PCR仪进行基因扩增时还要求覆盖约50μl（一滴）液体石蜡油，改进后的PCR仪已经不用液体石蜡油覆盖。
）
5.取5μlPCR反应液及1μl上样缓冲液混合，进行琼脂糖电泳（5V/cm），选择适当大小的DNA分子量标准（DL2000），检查扩增产物。
紫外观察，必要时拍照。
五、注意事项
1.PCR是建立在一定量的模板和与之专一性互补配对的一对引物之上的，因此，在进行PCR前，模板的纯化和引物设计尤为重要。
2.Mg2+对TaqDNA聚合酶的活性影响很大，有时按照试剂商提供的说明扩增不出目的基因时，不妨适当增加Mg2+的浓。
六、思考题
1.PCR的原理是什么
2.PCR中引物和TaqDNA聚合酶各有什么作用
3.PCR中怎样预防出现假阳性结果
4.什么是Tm值有何用途如何计算
5.引物设计应遵循什么原则
6.你会使用哪种引物设计软件
实验3烟草原生质体分离和体细胞杂交
一、实验目的
学习植物原生质体分离和体细胞杂交的一般方法；
二、实验原理
原生质体是消除细胞壁的细胞部分。
利用纤维素酶和果胶酶消化植物细胞壁，能获得大量的原生质体。
聚乙二醇（PEG）高钙pH融合诱导方法是体细胞杂交的主要方法之一。
PEG带微弱极性的负电荷，能与水、蛋白质和碳水化合物等具有正电荷基团的分子形成氢键。
当PEG分子链足够大时，在邻近原生质体表面之间起着分子桥的作用，引起原生质体紧紧粘连成团。
Ca2+在蛋白质和磷脂负电荷基团和PEG之间形成桥梁，加强原生质体之间的粘连作用，10mmol/LCaCl2·2H2O能完全消除烟草原生质体表面的电荷。
在洗涤过程中，直接或间接与质膜结合的PEG分子从原生质体表面洗脱，并随着pH的降低，导致膜电荷的不平衡和发生重新分布。
质膜紧密接触区域的电荷重新分布使原生质体的某些正电荷基团与另一原生质体的负电荷基团联结，反之亦然，最后导致原生质体发生融合。
融合细胞在培养过程中再生细胞壁、分裂生长形成愈伤组织和再生植株，产生体细胞杂交植株。
根据双亲遗传物质在体细胞杂交中的遗传，体细胞杂种又分为核对称杂种、核不对称杂种和细胞质杂种。
本实验用于诱导核对称杂种。
三、仪器、材料与试剂
仪器：
超净工作台、光照培养箱、低速离心机、高压灭菌锅、倒置光学显微镜等
材料：
烟草试管苗叶片和愈伤组织、萘乙酸、苄基氨基嘌呤、2,4-二氯苯氧乙酸等
试剂：
（1）D2原生质体培养基：
A.大量元素（mg/L）：
NH4NO3270,KNO31480，CaCl2·2H2O900，MgSO4·7H2O900，KH2PO4170
B.碳素营养：
葡萄糖mol/L，蔗糖mol/L
C.生长调节剂：
NAA~mol/L，BA~mol/L
D.D2原生质体培养基的其它成分：
甘氨酸mg/L，烟酸mg/L，盐酸吡哆醇mg/L，盐酸硫胺素mg/L，肌醇100mg/L
（2）MS分化培养基：
MS基本培养基+mg/LBA+mg/LNAA+3%蔗糖+%琼脂
MS基本培养基（mg/L）：
NH4NO31650,KNO31900，CaCl2·2H2O440，MgSO4·7H2O370，KH2PO4170，KI，H3BO3，MnSO4·4H2O，ZnSO4·7H2O，Na2MoO4·2H2O，CoCl2，CuSO4·5H2O，FeSO4·7H2O，甘氨酸mg/L，烟酸mg/L，盐酸吡哆醇mg/L，盐酸硫胺素mg/L，肌醇100mg/L
（3）原生质体分离的酶液组成
A.CPW培养基（mg/L），pH：
KH2PO4，KNO3101，CaCl2·2H2O1480，MgSO4·7H2O246，KI，CuSO4·5H2O
B.2%纤维素酶OnozukaR-10，%离析酶R-10
C.mol/L甘露醇
（4）PEG融合液：
A.20%PEG600，mol/LCaCl2，mol/L甘露醇
B.1mol/L甘氨酸-NaOH，pH
C.二甲基亚砜（DMSO）
D.使用前将A，B和C溶液按8：
1：
1比例混合
（5）W5稀释液（pH）：
125mmol/LCaCl2，155mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，5mmol/L葡萄糖
四、实验内容
1.原生质体分离
（1）用μm孔径硝酸纤维素膜的细菌过滤器过滤酶液和液体D2原生质体培养基。
（2）分别取试管苗幼叶和2~3周龄的愈伤组织，用解剖刀切成小块，按材料：
酶液=1：
10加入无菌酶液，在25℃黑暗条件下消化细胞壁4~6h，间歇轻轻摇动。
2.原生质体的纯化
（1）在超净工作台上用300目孔径娥尼龙网筛过滤原生质体到10mL有盖离心管内。
（2）800~1000r/min离心3~5min，用无菌吸管吸弃酶液。
沿离心管管壁缓缓加入无酶类的原生质体分离液，轻轻吸打原生质体沉淀，重新悬浮原生质体，800~1000r/min离心3~5min。
重复2次。
（3）原生质体重新悬浮在少量的CPW培养基中。
用血球计数板在显微镜下计数和统计原生质体密度，用同样的CPW培养基调整原生质体密度到1×106个/mL。
3.原生质体融合
（1）将叶肉原生质体和愈伤组织原生质体等体积混合，取mL原生质体混合悬浮液到另一支无菌离心管中。
（2）将PEG融合液按8：
1：
1混合后，沿离心管管壁缓慢加入mL新混合的PEG融合液，静置10min。
（3）在5min内慢慢地加入5mLW5稀释液，静置1h。
（4）800~1000r/min离心3~5min，原生质体重新悬浮在稀释液中，静置30min。
（5）用原生质体培养液离心纯化2次，最后调整原生质体密度到105/mL。
4.融合细胞的观测
取一滴融合处理后的原生质体悬浮液于载玻片上或培养皿中，在倒置显微镜下观察。
叶肉原生质体密布叶绿素，愈伤组织原生质体的细胞质透明，融合的原生质体中存在部分叶绿体。
5.原生质体培养
（1）1mL原生质体悬浮液植板于直径为cm的培养皿中，用parafilm封口，置于25℃、300lx条件下培养。
（2）培养2d后，原生质体为椭圆形，表明细胞壁再生。
培养3~5d后，再生细胞发生一次分裂。
培养条件将光照提高到1500lx。
（3）培养2周后，加入mL糖
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