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第三篇

基因信息的传递

BiochemistryDepartment

DepartmentofBasicMedicalSciences

HangzhouNormalUniversity

Guyisheng

（flowofgeneinformation）

基因（gene）：

为生物活性产物（蛋白质或各种RNA）编码的DNA功能片段。

基因表达（geneexpression）：

基因转录与翻译的过程。

中心法则：

图示

基因的信息传递

第十章

《生物化学》

Biochemistry

DNA的生物合成（复制）

（DNABiosynthesis，Replication）

第一节复制的基本规律

（BasicRulesofDNAReplication）

复制的方式——半保留复制

（semi-conservativereplication）

复制的高保真性（highfidelity）

双向复制（bidirectionalreplication）

半不连续复制（semi-discontinuousreplication）

一、半保留复制

（semiconservativereplication）

（一）概念

（二）实验依据：

密度梯度实验

（三）生物学意义：

1.保证遗传信息传递的忠实性

2.遗传和变异的统一

DNA的生物合成（复制）

遗传信息从亲代DNA传递到子代DNA分子上，称为复制。

DNA复制的最主要特征半保留复制：

DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为模板（template）按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。

子代细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则完全从新合成。

两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。

这种复制方式称为半保留复制。

半保留复制

半保留复制的意义

DNA的半保留复制保证了DNA在代谢上的稳定性，经过许多代的复制，DNA多核苷酸链仍可保持完整，存在于后代而不被分解，这种稳定性体现了DNA遗传过程的相对保守性。

遗传的保守性是相对的，而不是绝对的。

自然界还存在着普遍的变异现象。

二、双向复制（bidirectionalreplication）

原核生物复制时，DNA从起始点（origin）向两个方向解链，形成两个延伸方向相反的复制叉，称为双向复制。

原核生物DNA的双向复制

A.环状双链DNA及复制起始点

B.复制中的两个复制叉

C.复制接近终止点（termination,ter）

真核生物DNA的双向复制

真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子的复制。

习惯上把两个相邻起始点之间的距离定为一个复制子（replicon）。

复制子是独立完成复制的功能单位。

真核生物的多复制子形式

三、半不连续复制

（semi-discontinuousreplication）

顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的，这股链称为领头链。

另一股链因为复制的方向与解链方向相反，不能顺着解链方向连续延长，这股不连续复制的链称为随从链。

复制中的不连续片段称为岡崎片段（okazakifragment）。

领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。

半不连续复制图解

领头链

（leadingstrand）

随从链

（laggingstrand）

图示

四、需要RNA引物（primer）

DNA聚合酶不能直接聚合游离的dNTP，必须由一段核酸片段提供3’OH末端。

由引物酶催化，由NTP为原料，合成RNA引物。

第二节DNA复制的酶学

（TheEnzymologyofDNAReplication）

复制是在酶催化下的核苷酸聚合过程，需要多种物质参与：

底物：

dNTP：

dATP、dGTP、dCTP、dTTP

聚合酶：

依赖DNA的DNA聚合酶

模板：

解开成单链的DNA母链

引物：

RNA，提供3’-OH末端，使dNTP可以依次聚合

其他酶和蛋白因子：

解螺旋酶、拓朴异构酶、引物酶、DNA连接酶、单链结合蛋白等

一、复制的化学反应（形成磷酸二酯键）

新链的延长只可沿5¢→3¢方向进行

（dNMP）n+dNTP→（dNMP）n+1+PPi

全称：

依赖DNA的DNA聚合酶

（DNA-dependentDNApolymerase）

（DNA-pol，DDDP）

催化活性：

5¢®3¢的聚合活性

核酸外切酶活性

二、DNA聚合酶

聚合酶I：

对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。

聚合酶II：

在无聚合酶I、III时起作用，功能未完全搞清楚。

参与DNA损伤的应急状态修复。

聚合酶III*：

复制延长时真正催化新链核苷酸聚合的酶。

（一）原核生物的DNA聚合酶

比较

酶图

聚合酶α*：

在复制过程中起重要作用。

具有引物酶活性。

聚合酶β：

参与低保真度复制（相当于原核生物DNA-polII）。

聚合酶γ：

存在于线粒体，参与线粒体DNA复制。

聚合酶δ*：

在复制中起主要作用，延长子链（相当于原核生物的DNA-polIII）。

有解螺旋酶活性。

聚合酶ε：

在复制中起校读、修复和填补缺口的作用（相当于原核生物DNA-polI）。

（二）真核生物的DNA聚合酶

比较

DNA聚合酶除了有催化5’→3’核苷酸聚合的作用外，还有核酸外切酶活性。

外切酶有方向性：

从5’-端或3’-端把核苷酸从核酸链上水解下来。

DNA聚合酶I有两种方向的外切酶活性。

DNA聚合酶I活性较强，在复制过程中能辨认错配的碱基并加以切除。

DNA聚合酶III只有3’→5’外切酶活性。

（三）核酸外切酶活性

图示

DNA复制的保真性主要依赖三种机制：

1、遵守严格的碱基配对规律

A＝T、C≡G

2、聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能

3、复制出错时有即时的校读功能

聚合酶III有3’→5’核酸外切酶活性

三、DNA复制的保真性

外切酶

教读

碱基

四、复制中的解链及DNA分子拓扑学变化

与DNA解旋和解链有关的酶和蛋白质：

解螺旋酶（helicase）等

DNA拓扑异构酶（DNAtopoisomerase）

单链DNA结合蛋白（singlestrandedDNAbindingprotein，SSB）

引物酶（primase）

解螺旋酶的作用是利用ATP供能来解开DNA双链。

DnaB蛋白--解螺旋酶

DnaA蛋白--识别复制起始点

DnaC蛋白--辅助解螺旋酶，使其（DnaB）在起始点上结合并打开双链

（一）DNA的解链

图示

DNA双螺旋链在复制过程中旋转速度很快，易造成DNA分子打结、缠绕、连环现象。

复制末期，母链DNA与新合成链也会相互缠绕，形成打结或连环。

拓扑异构酶分为I型和II型两种。

拓扑异构酶对DNA的作用是既能水解，又能连接磷酸二酯键。

使复制中的DNA能解结，达到适度盘绕。

（二）DNA拓扑异构酶

图示

作用机制：

拓扑异构酶Ⅰ

切断DNA双链中一股链，使DNA解链旋转不致打结；适当时候封闭切口，DNA变为松弛状态。

反应不需ATP。

拓扑异构酶Ⅱ

切断DNA分子两股链，断端通过切口旋转使超螺旋松弛。

利用ATP供能，连接断端，DNA分子进入负超螺旋状态。

SSB的作用是在复制中维持模板处于单链状态并保护单链的完整（免受核酸酶降解）。

SSB与DNA的结合具有协同效应

（三）单链DNA结合蛋白（SSB）

DNA聚合酶没有催化两个游离dNTP聚合的能力。

因此，复制是在RNA引物的基础上加进脱氧核苷酸的。

催化引物合成的是一种RNA聚合酶，它不同于转录过程的RNA聚合酶，所以称为引物酶（DnaG蛋白）。

复制起始时，DnaA、DnaB、DnaC蛋白，还有其他复制因子，一起形成复合体，结合引物酶，形成较大的聚合体，再结合到模板DNA上，这种复合物称为引发体。

（四）引物酶和引发体

DNA连接酶连接DNA链3’-OH末端和相邻DNA链的5’-P末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连成完整的链。

复制中模板链是连续的，新链分段合成，是不连续的，最后留有缺口，要靠连接酶接合。

连接酶的催化作用需要消耗ATP。

五、DNA连接酶

图示

连接酶的功能

DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。

在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。

也是基因工程的重要工具酶之一。

DNA聚合酶，拓扑酶和连接酶催化3¢,5¢-磷酸二酯键生成的比较

 䦋㌌㏒㧀낈ᖺ琰茞ᓀ㵂Ü

提供核糖3'-OH

提供5'-P

结果

DNA聚合酶

引物或延长中的新链

游离dNTP去PPi

（dNTP）n+1

连接酶

复制中不连续的两条单链

不连续→连续链

拓扑酶

切断、整理后的两链

改变拓扑状态

DNA合成从固定的起始点开始，同时向两个方向进行复制。

（双向复制）

真核生物的染色体庞大、复制，有多个复制起始点，同时形成许多复制的单位，两个起始点之间的DNA片段，称为一个复制子。

复制是连续的过程，为描述方便，把它分为起始、延长、终止三个阶段。

第三节DNA生物合成过程

TheProcessofDNAReplication

（一）复制的起始：

1、DNA解链——形成复制叉

DnaA、DnaB、DnaC蛋白、SSB等参与。

2、形成引发体，合成引物

引发体的蛋白质部分在DNA链上可以移动，并需要ATP供给能量。

引发体到达适当位置就可按照模板的配对序列，催化NTP的聚合，生成引物。

提供3¢-OH末端。

一、原核生物DNA的合成过程

DNA解链

E.coli复制起始点oriC

引发体和引物

含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA复制起始区域的复合结构称为引发体。

DnaA

DnaB、DnaC

DNA拓扑异构酶

引物酶

SSB

3¢

5¢

3¢

5¢

引物生成

引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

3¢

5¢

3¢

5¢

引物

引物酶

1、脱氧单核苷酸（dNTP）逐个加入而延长DNA新链，其化学反应本质是生成磷酸二酯键。

催化此反应的酶，在原核生物为DNA-polIII，真核生物为DNA-polα和δ。

新链延长的方向：

5’→3’

（二）复制的延长

2、复制的半不连续性和冈崎片段

DNA双链走向相反，而复制只能从5’→3’进行。

因此，顺着解链方向而生成的子链，复制是连续进行的，称为领头链；另一股链的复制方向与解链方向相反，复制不连续进行，称为随从链。

不连续复制的片段称为冈崎片段。

领头链的合成

领头链的子链沿着5¢→3¢方向可以连续地延长。

随从链的合成

全图

同一复制叉上领头链和随从链

由相同的DNA-pol催化延长

阶段一

阶段二

阶段三

阶段四

DNA复制过程简图

（三）复制的终止

原核生物是环状DNA。

双向复制的两子链在复制终止点处汇合。

切除引物、填补空缺、连接切口

复制中的不连续片段需连接成连续的子链

先由RNA酶水解引物。

引物留下的空隙由DNA聚合酶I催化dNTP逐一自5′向3′端聚合而填补。

最后，两不连续片段相邻的5′-P和3′-OH还有一个缺口，则由DNA连接酶加以连接。

随从链不连续性片段的连接图示

二、真核生物的DNA生物合成

特点：

DNA的复制只发生在S期

多复制子

真核生物每个染色体有多个起始点，是多复制子复制。

复制有时序性，即复制子以分组方式激活而不是同步起动

真核细胞含有5种DNA聚合酶

端粒复制

DNA合成期

细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。

G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。

蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。

哺乳动物的细胞周期

G1

G2

S

M

（一）复制的起始

复制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）参与。

还需拓扑酶和复制因子（replicationfactor,RF）。

增殖细胞核抗原

细胞周期蛋白（cyclin），细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）等。

与原核基本相似

增殖细胞核抗原

（proliferationcellnuclearantigen，PCNA）

在复制起始和延长中起关键作用。

PCNA为同源三聚体，具有与E.coliDNA聚合酶Ⅲ的β亚基相同的功能和相似的构象，即形成闭合环形的可滑动DNA夹子，在RFC的作用下PCNA结合于引物－模板链；并且PCNA使polδ获得持续合成能力。

PCNA水平也是检验细胞增殖的重要指标。

细胞能否分裂，决定于进入S期及M期这两个关键点。

G1→S及G2→M的调节，与蛋白激酶活性有关。

蛋白激酶通过磷酸化激活或抑制各种复制因子而实施调控作用。

相关的激酶都有调节亚基即细胞周期蛋白（cyclin），和催化亚基即细胞周期蛋白依赖激酶（cyclindependentkinase，CDK）。

CDK

相匹配的周期蛋白

作用点

CDK2

CyclinD1,D2,D3

G1期

CyclinE

G1→S期

CyclinA

S期

CDK3和CDK4

CyclinD1,D2,D3

G2期

CDK1（CDC2）

CyclinA,B

G2→M期

哺乳类动物的周期蛋白和CDK

哺乳类动物细胞内还发现天然抑制CDK的蛋白质，例如锚蛋白（ankynin）是CDK4的特异性抑制物，P21蛋白能抑制多种CDK。

锚蛋白和P21蛋白的抑制/活化可使细胞周期开放/关闭，因此被形容为细胞周期的检查点（checkpoint）蛋白。

（二）复制的延长

发生DNA聚合酶α/δ转换

DNA-polδ和polα分别兼有解螺旋酶和引物酶活性。

在复制叉及引物生成后，DNA-polδ通过PCNA的协同作用，逐步取代polα，在RNA引物的3¢-OH基础上连续合成领头链。

随从链引物也由polα催化合成。

然后由PCNA协同，polδ置换polα，继续合成DNA子链。

复制叉的延长图示

（三）复制的终止和端粒酶

染色体DNA呈线状，复制在末端停止。

复制中岡崎片段的连接，复制子之间的连接。

染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙。

染色体两端DNA子链上最后复制的RNA引物，去除后留下空隙：

切除引物的两种机制

端粒是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。

染色体DNA与它的结合蛋白紧密结合因而末端膨大成粒状。

末端DNA序列是多次重复的富含G、C碱基的短序列。

TTTTGGGGTTTTGGGG…

端粒在维持染色体的稳定性和DNA复制的完整性有重要作用。

真核生物的端粒和端粒酶

三种成分

端粒酶RNA（humantelomeraseRNA,hTR）

端粒酶协同蛋白（humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1）

端粒酶逆转录酶（humantelomerasereversetranscriptase,hTRT）

在端粒DNA复制上，端粒酶既有模板，又有逆转录酶这两方面的作用。

端粒酶的组成：

一种RNA-蛋白质复合物

端粒酶的催化延长作用

－－爬行模型

DNA聚合酶复制子链

进一步加工

一、逆转录现象和逆转录酶

逆转录是依赖RNA的DNA合成作用，即以RNA为模板由dNTP聚合成DNA分子。

催化此反应的酶称为逆转录酶。

第四节逆转录和其他复制方式

（ReverseTranscriptionandOtherDNAReplicationWays）

逆转录（reversetranscription）

逆转录酶（reversetranscriptase）

逆转录酶（reversetranscriptase）

催化逆转录过程的酶称逆转录酶，RNA

病毒中都含有此酶。

具有三种酶活性：

RNA指导的DNA聚合酶

RNA酶

DNA指导的DNA聚合酶

反应过程：

先以单链RNA为模板，催化合成一条单链DNA，形成DNA-RNA杂化双链

其中的RNA被RNA酶水解后

再以新合成的单链DNA为模板，催化合成第二链的DNA。

RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒（provirus）。

前病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖。

在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组（recombination），参加到细胞基因组内，并随宿主基因一起复制和表达。

这种重组方式称为整合（integration）。

前病毒独立繁殖或整合，都可成为致病原因。

分子生物学研究可应用逆转录酶，作为获取基因工程目的基因的重要方法之一，此法称为cDNA法。

以mRNA为模板，经逆转录合成的与mRNA碱基序列互补的DNA链。

试管内合成cDNA:

cDNA（complementaryDNA）

逆转录研究的意义

逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现。

逆转录现象说明：

至少在某些生物，RNA同样兼有遗传信息传代与表达功能。

对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒致癌理论。

逆转录酶－－基因工程中目的基因的获取

滚环

D环

突变是指一个或多个脱氧核糖核苷酸的构成、复制或表型功能的异常变化，即遗传物质结构改变引起遗传信息的改变。

从分子水平来看，突变就是DNA分子上碱基的改变

在复制过程中发生的DNA突变称为DNA损伤（DNAdamage）。

第五节DNA损伤（突变）与修复

DNADamage（Mutation）andRepair

一、突变在生物界普遍存在

突变是进化、分化的分子基础

突变导致基因型改变

突变导致死亡

突变是某些疾病的发病基础

二、引发突变的因素

物理因素：

紫外线、各种辐射

化学因素：

5-BU、羟胺类、亚硝酸盐、烷化剂

如；嘧啶二聚体－－TT

光修复

三、突变的类型

错配（mismatch）

又称点突变（pointmutation）

缺失（deletion）

插入（insertion）

重排（rearrangement）

（一）错配

转换：

发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。

颠换：

发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶或嘧啶变嘌呤。

DNA分子上的碱基错配又称点突变。

（pointmutation）

图示

（二）缺失（deletion）、插入（insertion）

缺失：

一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。

插入：

原来没有的一个碱基或一段核苷酸链插入到DNA大分子中间。

缺失或插入都可导致框移（frame-shift）突变。

框移突变是指缺失或插入（核苷酸）的突变，引起三联密码的阅读方式改变，造成蛋白质氨基酸排列顺序发生改变，其后果是翻译出一级结构完全不同的另一种蛋白质。

图示

（三）重组（recombination）

DNA分子内较大片段的交换，称为重组或重排。

移位的DNA可以在新位点上颠倒方向反置（倒位），也可以在染色体之间发生交换重组。

图示

DNA损伤（突变）可能造成两种结果：

其一是导致复制或转录障碍（如胸腺嘧啶二聚体，DNA骨架中产生切口或断裂）；

其二是导致复制后基因突变（如胞嘧啶自发脱氨基转变为尿嘧啶），使DNA序列发生永久性改变。

所以，必须通过进化使细胞拥有灵敏的机制，以识别和修复这些损伤，否则细胞无法维持正常代谢。

体内DNA的损伤修复机制主要有：

1、光修复

2、切除修复

3、重组修复

4、SOS修复

四、DNA损伤的修复

（一）直接修复

如：

光修复（lightrepairing）

可见光（最有效波长400nm）激活生物界广泛分布（高等哺乳动物除外）的光复活酶，该酶分解嘧啶二聚体。

是一种高度专一的修复形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚体。

图示

（二）切除修复（excisionrepairing）

是细胞内最重要和有效的修复机制，主要由DNA-polⅠ和连接酶完成。

通过切除损伤部位，剩下的空隙由DNA-polI催化dNTP聚合而填补，最后由DNA连接酶连接缺口。

切除损伤在原核生物需Uvr蛋白类，真核生物需XP蛋白类。

图示

核苷酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能拯救因转录模板链损伤而暂停转录的RNA聚合酶，即参与转录偶联修复（transcription-coupledrepair）。

转录偶联修复的意义在于，将修复酶集中于正在转录的DNA，使该区域的损伤尽快得以修复。

（三）重组修复（recombinationrepairing）

又称复制后修复（postreplicationrepair）

这种情况出现在DNA损伤面积较大，来不及修复就进行复制。

受损伤的DNA在进行复制时，跳过损伤部位，在子代DNA链与损伤相对应部位出现缺口。

通过分子间重组（链间的交换），从完整的母链上将相应的碱基顺序片段移至子链的缺口处，然后再通过DNA-polI、DNA连接酶进行修补上母链的空缺，此过程即重复修复。

并非完全校正。

这种修复的不足之处在于原损伤部位仍然存在，但随着多次复制，损伤链所占比例越来越少。

图示

SOS修复

又称倾错性修复（Error-ProneRepair）

当DNA损伤广泛难以继续复制时，由此而诱发出一系列复杂的反应。

在E.coli，各种与修复有关的基因，组成一个称为调节子（regulon）的网络式调控系统。

这种修复特异性低，对碱基的识别、选择能力差。

通过SOS修复，复制如能继续，细胞是可存活的。

然而DNA保留的错误较多，导致较广泛、长期的突变。

中心法则图

冈崎片段与半不连续复制

大肠杆菌DNA聚合酶I、II和III的性质比较

DNA-polⅠ

分子量：

109kD

功能：

对复制中的错误进行校读，对复制和修复中出现的空隙进行填补。

DNA-polⅠ

323个氨基酸

小片段

5¢®3¢核酸外切酶活性

大片段/Klenow片段

604个氨基酸

DNA聚合酶活性

3¢®5¢核酸外切酶活性

N端

C端

Klenow片段是实验室合成DNA，进行分子生物学研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ（120kD）

DNA-polII基因发生突变，细菌依然能存活。

DNA-polⅡ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。

。

因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。

DNA-polⅢ

分子量：

250kD

功能：

是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。

真核生物的DNA聚合酶

外切酶活性图解

3¢®5¢外切酶活性

5¢®3¢外切酶活性

?

能切除突变的DNA片段。

能辨认错配的碱基对，并将其水解。

（一）DNA-pol的核酸外切酶活性和及时校读

A：

DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用其聚合活性掺入正确配对的底物。

B：

碱基配对正确，DNA-pol不表现活性。

（二）复制的保真性和碱基选择

DNA聚合酶靠其大分子结构协调非共价（氢键）与共价（磷酸二酯键）键的有序形成。

嘌呤的化学结