食品中沙门氏菌检验操作规范已完.docx

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食品中沙门氏菌检验操作规范已完

食品中沙门氏菌检验操作规范（已完）

食品中沙门氏菌检验操作规范

1检验依据

本方法参照GB4789.4-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验》。

2设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1冰箱：

2℃～5℃。

2.2恒温培养箱：

36℃±1℃，42℃±1℃。

2.3均质器。

2.4振荡器。

2.5电子天平：

感量0.1g。

2.6无菌锥形瓶:

容量500mL，250mL。

2.7无菌吸管：

1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。

2.8无菌培养皿：

直径90mm。

2.9无菌试管：

3mm×50mm、10mm×75mm。

2.10无菌毛细管。

2.11pH计或pH比色管或精密pH试纸。

2.12全自动微生物生化鉴定系统。

3培养基和试剂（按说明书配置或灭菌）

3.1缓冲蛋白胨水（BPW）；

3.2四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液；

3.3亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液；

3.4亚硫酸铋（BS）琼脂；

3.5HE琼脂；

3.6木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂；

3.7沙门氏菌属显色培养基；

3.8三糖铁（TSI）琼脂；

3.9蛋白胨水、靛基质试剂；

3.10尿素琼脂（pH7.2）；

3.11氰化钾（KCN）培养基；

3.12赖氨酸脱羧酶试验培养基；

3.13糖发酵管；

3.14邻硝基酚β-D半乳糖苷（ONPG）培养基；

3.15半固体琼脂；

3.16丙二酸钠培养基；

3.17沙门氏菌O和H诊断血清；

3.18生化鉴定试剂盒。

4检验程序

沙门氏菌检验程序见图1。

图1沙门氏菌检验程序

5操作步骤

5.1前增菌

称取25g（mL）样品放入盛有225mLBPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mLBPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。

若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。

如需测定pH值，用1mol/mL无菌NaOH或HCl调pH至6.8±0.2。

无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养8h～18h。

如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃～5℃不超过18h解冻。

5.2增菌

轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1mL，转种于10mLTTB内，于42℃±1℃培养18h～24h。

同时，另取1mL，转种于10mLSC内，于36℃±1℃培养18h～24h。

5.3分离

分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。

于36℃±1℃分别培养18h～24h（XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板）或40h～48h（BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。

表1沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征

5.4生化试验

5.4.1自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h。

在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。

表2沙门氏菌属在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内的反应结果

5.4.2接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾（KCN）培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。

于36℃±1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。

将已挑菌落的平板储存于2℃～5℃或室温至少保留24h，以备必要时复查。

表3沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

5.4.2.1反应序号A1：

典型反应判定为沙门氏菌属。

如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。

如有2项异常为非沙门氏菌。

表4沙门氏菌属生化反应初步鉴别表

5.4.2.2反应序号A2：

补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。

5.4.2.3反应序号A3：

补做ONPG。

ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。

5.4.2.4必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。

表5沙门氏菌属各生化群的鉴别

5.4.3如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.4.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。

5.5血清学鉴定

5.5.1抗原的准备

一般采用1.2％～1.5％琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。

O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的（如2％～3％）培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。

H抗原发育不良时，将菌株接种在0.55％～0.65％半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3％～0.4％半固体琼脂的小玻管1次～2次，自远端取菌培养后再检查。

5.5.2多价菌体抗原（O）鉴定

在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。

再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。

将玻片倾斜摇动混合1min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

5.5.3多价鞭毛抗原（H）鉴定

同5.5.2。

6结果与报告

综合以上生化试验和血清学鉴定的结果，报告25g（mL）样品中检出或未检出沙门氏菌。