人类基因组计划doc.docx

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人类基因组计划doc

　　【篇一】人类基因组计划随着人类基因组计划的完成

　　随着人类基因组计划的完成，人类对自身遗传信息的了解和掌握有了前所未有的进步。

与此同时，分子水平的基因检测技术平台不断发展和完善，使得基因检测技术得到了迅猛发展，基因检测效率不断提高。

从最初第一代以Sanger测序为代表的直接检测技术和以连锁分析为代表的间接测序技术，到2005年，以Illumina公司的Solexa技术和ABI公司的SOLiD技术为标志的新一代测序（next-generationsequencing，NGS）的相继出现，测序效率明显提升，时间明显缩短，费用明显降低，基因检测手段有了革命性的变化。

其技术正向着大规模、工业化的方向发展，极大地提高了基因检测的检出率，并扩展了疾病在基因水平的研究范围。

2009年3月，约翰霍普金斯大学的研究人员在《Science》杂志上发表了通过NGS外显子测序技术，发现了一个新的遗传性胰腺癌的致病基因PALB2，标志着NGS测序技术成功应用于致病基因的鉴定研究。

同年，《Nature》发表了采用NGS技术发现罕见弗里曼谢尔登综合征MYH3致病基因突变和《NatGenet》发表了遗传疾病米勒综合征致病基因。

此后，通过NGS技术，与遗传相关的致病基因不断被发现，NGS技术已成为里程碑式的进步。

2010年，《Science》杂志将这一技术评选为当年“十大科学进展”。

近两年，基因检测成为临床诊断和科学研究的热点，得到了突飞猛进和日新月异的发展，越来越多的临床和科研成果不断涌现出来。

同时，基因检测已经从单一的遗传疾病专业范畴扩展到复杂疾病和个体化应用更加广阔的领域，其临床检测范围包括高危疾病的新生儿筛查、遗传疾病的诊断和基因携带的检测以及基因药物检测用于指导个体化用药剂量、选择和药物反应等诸多方面的研究。

目前，基因检测在临床诊断和医学研究的应用正越来越受到医生的普遍重视和引起研究人员的极大的兴趣。

　　本文介绍了几种DNA水平基因检测常见的方法，比较其优缺点和在临床诊断和科学研究中的应用，对指导研究生和临床医生课外学习，推进临床科研工作和提升科研教学水平有着指导意义。

　　1、第一代测序

　　1Sanger测序采用的是直接测序法。

1977年，FrederickSanger等发明了双脱氧链末端终止法，这一技术随后成为最为常用的基因测序技术。

2001年，AllanMaxam和WalterGibert发明了Sanger测序法，并在此后的10年里成为基因检测的金标准。

其基本原理即双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）缺乏PCR延伸所需的3'-OH，因此每当DNA链加入分子ddNTP，延伸便终止。

每一次DNA测序是由4个独立的反应组成，将模板、引物和4种含有不同的放射性同位素标记的核苷酸的ddNTP分别与DNA聚合酶混合形成长短不一的片段，大量起始点相同、终止点不同的DNA片段存在于反应体系中，具有单个碱基差别的DNA序列可以被聚丙烯酰胺变性凝胶电泳分离出来，得到放射性同位素自显影条带。

依据电泳条带读取DNA双链的碱基序列。

　　人类基因组的测序正是基于该技术完成的。

Sanger测序这种直接测序方法具有高度的准确性和简单、快捷等特点。

目前，依然对于一些临床上小样本遗传疾病基因的鉴定具有很高的实用价值。

例如，临床上采用Sanger直接测序FGFR2基因证实单基因Apert综合征和直接测序TCOF1基因可以检出多达90%的与TreacherCollins综合征相关的突变。

　　值得注意的是，Sanger测序是针对已知致病基因的突变位点设计引物，进行PCR直接扩增测序。

单个突变点的扩增包括该位点在内的外显子片段即可，不必将该点所在基因的全部外显子都扩增。

　　因此，应明确定位要扩增的位点所在的基因外显子和该点的具体位置，设计包括该点在内的上下游150~200bp的外显子片段引物。

此外，尽管有NGS的出现，但Sanger测序对于有致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传疾病的致病基因的检测是非常经济和高效的。

到目前为止，Sanger测序仍然是作为基因检测的金标准，也是NGS基因检测后进行家系内和正常对照组验证的主要手段。

　　值得注意的是，Sanger测序目的是寻找与疾病有关的特定的基因突变。

对于没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查是难以完成的，此类测序研究还要依靠具有高通量测序能力的NGS。

虽然Sanger测序具有高度的分析准确性，但其准确性还取决于测序仪器以及测序条件的设定。

另外，Sanger测序不能检测出大片段缺失或拷贝数变异等基因突变的类型，因此对于一些与此相关的遗传性疾病还不能做出基因学诊断。

　　2连锁分析采用的是间接测序法。

在NGS出现之前，国际通用的疾病基因定位克隆策略是建立在大规模全基因扫描和连锁分析基础上的位置候选基因克隆。

人类的染色体成对出现，一条来自父亲，一条来自母亲，每一对染色体在同样的位置上拥有相同的基因，但是其序列并不完全相同，被称为父系和母系等位基因。

遗传标记是指在人群中表现出多态现象的DNA序列，可追踪染色体、染色体某一节段或某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。

它存在于每一个人，但大小和序列有差别，具有可遗传性和可识别性。

目前采用第二代遗传标记，即重复序列多态性，特别是短串联重复序列，又称微卫星标记。

连锁分析是以连锁这种遗传现象为基础，研究致病基因与遗传性标记之间关系的方法。

如果控制某一表型性状的基因附近存在遗传标记，那么利用某个遗传标记与某个拟定位的基因之间是否存在连锁关系，以及连锁的紧密程度就能将该基因定位到染色体某一位置上。

1986年Morton等提出优势对数记分法（logoddsscoremethod，LOD），主要检测两基因以某一重组率连锁时的似然性。

LOD值为正，支持连锁;LOD值为负，则否定连锁。

通过计算家系中的微卫星标记与致病位点之间的LOD值，可以初步估算二者间的遗传距离及连锁程度，从而确定该基因在染色体上的粗略位置。

然后利用该区域的染色体基因图谱，分析定位区域内所有基因的功能与表达，选择合适的候选基因进行突变检测，最终将致病基因定位或克隆。

　　然而，采用连锁分析进行基因检测存在很大的局限性。

不但所需遗传样本量较大，一般要求提供三代及以上遗传家系患者血样，而且数据量大、处理复杂、产出速度较慢、定位不够精确（一般只能定位在染色体某一区间），这就使得研究工作繁重和定位基因的时间周期特别长。

目前，连锁分析采用的单核苷酸多肽性和短串联重复序列还在使用，但经典的间接测序方法，如单链构象多肽性、变性梯度凝胶电泳和异源双链分析在美国已被淘汰，而在发展中国家作为研究手段还在有限使用。

　　2、新一代测序（NGS）

　　主要包括全基因组重测序（whole-genomesequencing，WGS）、全外显子组测序（whole-exomesequencing，WES）和目标区域测序（Targetedregionssequencing，TRS），它们同属于新一代测序技术。

总体而言，NGS技术具有通量大、时间短、精确度高和信息量丰富等优点，使得遗传学者可以在短时间内对感兴趣的基因进行精确定位。

但这些不同的测序技术在测序范围、数据分析量以及测序费用和时间等方面又有很大差别，如果选择适合的方法，对于临床诊断和科学研究将起到事半功倍的作用。

　　1目标区域测序目前常用的是基因芯片技术。

其测序原理是基于DNA杂交原理，利用目标基因组区域定制的探针与基因组DNA进行芯片杂交或溶液杂交，将目标基因区域DNA富集，再通过NGS技术进行测序。

其测序过程是通过把数以万计的cDNA或寡聚核苷酸置于芯片上制成列阵，将芯片上固定好的已知序列的核苷酸探针与溶液中含有荧光标记的相应核酸序列进行互补配对，根据测序仪所显示强荧光的位置和强度，获取每组点阵列信息，再利用生物信息学算法确定目的靶核苷酸的序列组成。

测序所选定的目标区域可以是连续的DNA序列，也可以是分布在同一个染色体不同区域或不同染色体上的片段。

目标区域测序技术，对于以往通过连锁分析将基因突变锁定在染色体某一片段区域内，但无法找出突变是一个非常好的进一步检测手段。

2010年，Nicholas等使用基因分型芯片联合连锁分析技术，成功发现头小畸形的新基因WDR62，文章发表在《NatGenet》杂志。

类似的研究在家族性胰腺癌中确定8个候选变异位点和在家族性渗出性玻璃体视网膜病变发现易感基因TSPAN12。

　　基因芯片测序技术可以将经过连锁分析锁定了目标范围或经过全基因组筛选的特定基因或区域进行更深一层的研究，是解决连锁分析无法发现致病基因的有效手段。

基因芯片技术对于已知基因突变的筛查具有明显优势，可以快速、全面地检测出目标基因突变。

同时，由于目标区域受到了限制，测序范围大幅度减少，测序时间和费用相应降低。

但基因芯片检测所需要的DNA的量要大，由于已提取的DNA存在降解的风险，用于基因芯片研究的血标本最好是冰冻的全血，这样可以使用于检测DNA的量有充分保证。

　　2全外显子组测序（WES）外显子组是单个个体的基因组DNA上所有蛋白质编码序列的总合。

人类外显子组序列约占人类全部基因组序列的1%，但大约包含85%的致病突变。

WES是利用序列捕获技术将全外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因分析方法。

采用的技术平台主要是罗氏公司的SeqCapEZ全外显子捕获系统，Illumina公司的Solexa技术和Agilent公司的SureSelect外显子靶向序列富集系统。

其捕获的目标区在34~62M之间，不仅包括编码区同时也加入了部分非编码区。

NGS的测序过程主要包括DNA测序文库的制备、锚定桥接、PCR扩增、单碱基延伸测序和数据分析。

研究者根据测序仪捕获到在测序过程中掺入有不同荧光标记碱基片段，经计算机将荧光信号转化成不同颜色的测序峰图和碱基序列。

基因测序结果与NCBI的SNP数据库、千人基因组数据库等国际权威数据库比对，最终确定是否为突变基因。

　　自NGS技术问世以来，利用WES在临床疾病致病基因的鉴定研究中取得前所未有的成果。

这些成果不仅集中在单基因遗传疾病，还在多基因影响的复杂疾病中获得大量相关基因

　　的发现。

在单基因遗传性疾病中，如视网膜色素变性、终端骨发育不良等发现新基因或已知基因新突变。

在一些罕见的疾病中，如Kabuki综合征、家族性混合型低脂血症和脊髓小脑共济失调症等疾病中发现新的致病基因。

同时，在小细胞肺癌、慢性淋巴细胞性白血病等肿瘤研究和诸如肥胖症、脑皮质发育不良等复杂疾病的研究中也取得丰硕成果。

　　WES技术在筛查范围和检出率等方面较其他测序技术具有明显的优势。

例如，对于采用Sanger测序和基因芯片测序不能筛查出基因的样本，可以采用WES来进一步基因筛查鉴定。

应用WES技术能够获得较传统Sanger等方法对编码区测序更深的覆盖度和更准确的数据。

由于信息量的大幅度增加，WES可以获得更多个体的编码区信息，因此成为检测致病基因和易感基因位点的有效手段。

与连锁分析定位方法比较，WES对家系的要求并不十分严格，在单基因遗传病同一家系中有2~3个患者和1个正常人即可进行致病基因的鉴定研究，而不需要连续三代的遗传家系。

由于不需要严格的三代以上的遗传家系，WES使以前不能进行研究的家系成为可能。

不仅对于单基因遗传病是一个很好的研究手段，对于许多常见病，如肿瘤、糖尿病等疾病也可进行大规模比较研究。

　　3全基因组重测序（WGS）WGS是对已知基因组序列的物种进行不同个体的全基因组的测序，经过数据分析后对序列进行拼接、组装并获得基因组图谱，或是对不同组织进行测序并分析体细胞突变的一种研究方法。

尽管WES可以快速全面地找出个体基因组上的所有突变，从而找到个体间的差异，但对于外显子以外的区域则不能有效地进行基因检测。

对于此种情况，目前还要借助WGS进行全基因组检测。

但由于人类基因组过于庞大，一次单端全基因组测序很难达到所需要的测序深度。

因此，需要重复测序或双端测序，由此带来测序成本的大幅度提高和由于不能达到足够的测序深度所导致的结果准确性的降低。

而对于临床疾病诊断和普通科研工作，其高昂的检测费用也是难以承受的。

尽管如此，对于部分临床研究和WES不能解决的科研课题还需要借助WGS进行更加全面的基因检测。

　　3、展望

　　NGS的出现为新兴的基因组技术增添了无限的活力和想象空间。

特别是基因芯片的问世和已在临床上应用于大样本的疾病筛查和基因诊断中所展现出的活力，以及其商业化发展的模式都令人鼓舞。

在眼科是单基因病最常见的学科，利用芯片技术进行Laber病的筛查已使很多病因不清楚的视神经萎缩得到明确诊断。

而原发性开角型青光眼是眼科最具隐蔽性和危险性的致盲性眼病，其致病基因或突变的鉴定研究对疾病筛查将有着非常重要的临床价值和巨大的商业价值。

在新生儿糖尿病的筛查中采用基因芯片技术可以更加快速、全面经济，避免第一代测序过于繁琐和漏检。

　　基因芯片技术在产前诊断中更加具有发展前景。

只要对孕妇进行DNA血液检查即可进行遗传疾病的筛查，避免以往通过羊膜穿刺抽取羊水进行有创检查的局限性和危险性。

目前，基因检测技术水平的提升和检测费用的不断降低，发展大规模个体化基因检测在不久的将来成为可能。

同时，药物易感性基因和疾病发生的易感基因的检测的深入开展，个体化医疗将在基因检测的基础上得以实现。

有理由相信，随着人们生活水平的不断提高和健康意识不断增强，基因检测在未来医学发展中应用前景将十分可观。

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　　【篇二】人类基因组计划人类基因组计划原理和基本步骤

　　人类基因组计划原理和基本步骤

　　人类基因组计划（humangenomeproject,HGP）是由美国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。

美国、英国、法国、德国、日本和我国科学家共同参与了这一预算达30亿美元的人类基因组计划。

　　序列图的绘制主要采用两大策略:

即逐个克隆法（ClonebyClone）和全基因组鸟枪法（WholeGenomeShot-gun）。

　　逐个克隆法的原理

　　逐个克隆法的原理是Sanger双末端终止法。

人类基因组框架图全部采用基于Sanger双脱氧原理的自动化毛细管测序。

在1977年，英国人FrederickSanger创建了双脱氧链末端合成终止法（chainterminationmethod），简称Sanger法、双脱氧法或酶法。

他发现如果在DNA复制过程中掺入ddNTP，就会产生一系列末端终止的DNA链，并能通过电泳按长度分辨。

不同末端终止DNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTP决定的。

　　Sanger双末端终止法的基本原理是利用DNA聚合酶，以待测单链DNA为模板，以dNTP为底物，设立四种相互独立的测序反应体系，在每个反应体系中加入不同的双脱氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate，ddNTP）作为链延伸终止剂。

具体实验是通过PCR来完成的，但与普通PCR不同，它只需要一个引物而不是一对。

在4个相同的反应体系中分别加入普通的dNTP以及4种不同的ddNTP（比如体系1里面缺少dATP，而有ddATP,以此类推）。

假设四个体系中分别加入的是ddATP,ddGTP,ddCTP和ddGTP我们就分别把这个叫做A，G，C，T体系，然后每个体系中，会在遇到相应碱基的时候停止反应，这样就产生了一系列长度不一并且分别在以A,G,C,T时终止的DNA片段，比如A体系中的DNA片段，都是以A结尾的DNA。

通过高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测后，从凝胶底部到顶部按5′→3′方向读出新合成链序列，由此推知待测模板链的序列。

　　逐个克隆法基本步骤

　　逐个克隆法的基本步骤是物理图谱的构建→BAC克隆的筛选→“工作框架图”的构建→序列的全组装与“完成图”构建。

　　物理图谱的构建的基本步骤如下确定各STS序列及其在基因组中的位置→大插入片段基因组文库的构建（BAC文库）→以特定STS为标记筛选并定位克隆→含有STS的克隆在基因组中排序。

　　BAC克隆的筛选的基本步骤如下用NotI、SacI等处理基因组，通过脉冲场凝胶电泳得200Kb左右的大片段DNA→纯化后与载体连接，得到插有外源DNA片段的BAC载体→通过电转化将连接产物导入大肠杆菌感受态细胞，在含有抗生素的筛选培养基中筛选带有相同外源DNA片段的单克隆菌落→“STS-PCR反应池”方案筛选种子克隆→相互间具有重叠片段的BAC克隆根据STS信息组装成contig，并定位于基因组上。

　　值得注意的是，STS的密度尚未达到绘制高精度物理图谱的要求，且在基因组中的分布不均匀，造成很多区域没有阳性克隆覆盖,形成空洞。

因此需用指纹图谱（FPC法）或末端序列（WalkingbyEndSequence）步移等手段对种子克隆进行延伸，形成连续克隆群。

利用延伸方法筛选得到的克隆称为延伸克隆。

　　“工作框架图”的构建根据序列与STSdatabase进行blastn比较结果，将克隆定位末端序的比较，判定延伸在contig外的一端序列。

并可及时进行walking，筛选新的克隆。

　　鸟枪法

　　鸟枪法或霰弹法是一个高度计算机化的方法，它是先把基因组随机分成已知长度（2000个碱基对、1万个碱基对、5万个碱基对）的片段，然后用数学算法将这些片段组装成毗邻的

　　大段并确定它们在基因组上的正确位置。

人类基因组计划中塞莱拉公司的科学家先用霰弹法测序DNA，并将整个基因组覆盖8

　　次，

　　然后用两个数学公式将人类基因组序列多次组装起来，确定出了基因中的转录单元，预测出60%的已识别基因的分子功能。

最后研究人员将人类基因组信息与此前已完成的果蝇和线虫的基因组序列进行比较，从而找出了三者共有的核心功能。

　　鸟枪法的工作流程图

　　两种方法对比表

　　【篇三】人类基因组计划人类基因组计划的历史背景

　　人类基因组计划的历史背景

　　问题的提出

　　尽管生物机体的尺寸有限,但并未能为研究工作带来任何容易之处。

人们经过了不懈的努力,渴望解开生命之谜这个多年的愿望并未向前推进多少,谜仍是个谜!

以往研究的艰履或失败教训使人们头脑开始清醒地认识到,任何仅依靠单一学科如细胞学、发青学、肿瘤学、人