DNA提取与PCR等.docx

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DNA提取与PCR等

目录

DNA的提取纯化1

基因组DNA的提取8

从动物组织提取基因组DNA10

细菌基因组DNA的制备11

基因组DNA的检测12

组织DNA的提取和纯化12

石蜡包埋组织的DNA提取及其应用13

外周血DNA提取技术21

真核细胞DNA的制备24

植物组织中DNA的提取25

细菌DNA的提取方法28

真菌DNA提取总结的两种方法29

组织mRNA提取操作步骤30

RNA酶活性的控制31

用异硫氰酸胍和有机溶剂提取RNA33

mRNA的分离编辑本段回目录33

哺乳动物细胞总RNA的分离35

植物总RNA的分离38

植物mRNA的分离39

PCR常见问题分析41

琼脂糖凝胶DNA回收常见问题分析43

RNA提取常见问题分析44

DNA电泳常见问题分析45

质粒提取常见问题分析46

凝胶电泳操作注意事项48

实验：

DNA片段的回收及纯化48

实验：

RNA的提取及其纯度检测50

DNA的提取纯化

一、细菌培养物的生长

从琼脂平板上挑取一个单菌落，接种到培养物中（有含有行当抗生素的液体培养基中生长），然后从中纯化质粒，质粒的提纯几乎总是如此。

现在使用的许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高的拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。

此时，不必造反性地扩增质粒DNA。

然而，较长一代的载体（如pBR322）由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长的细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时，以便对质粒进行性扩增。

氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复制，然而，松弛型质粒仍可继续复制，在若干小时内，其拷贝数持续递增。

这样，像pBR322－类的质粒，从经氯霉素处理和未经处理的培养物中提取质粒的产量迥然不同，前者大为增高。

多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成的氯霉素（μg/ml）已成为标准的操作、用该方法提取的质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到的工作任务。

二、细菌的收获和裂解

细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。

选择哪一种方法取决于３个因素：

质粒的大小、大肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。

尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

1、大质粒（大于15kb） 容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。

将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。

这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。

2、可用更剧烈的方法来分离小质粒。

在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。

这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。

当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

3、一些大肠杆菌菌株（如HB101的一些变种衍生株）用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。

糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。

因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。

故从诸如HB101和TG1等大肠杆菌菌株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。

4、当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株（endA+株，如HB101）中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。

因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。

但如果通过一个附加步骤（用酚：

氯仿进行抽提）可以避免此问题。

5、目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。

然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。

大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。

有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。

三、质粒DNA的纯化

　　常使用的所有纯化方法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质。

例如，用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。

溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。

由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。

最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。

但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和（每２个碱基对大约结合１个溴化乙锭分子）（Ｃantor和Ｓchimmel,1980）。

由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。

多年来，氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA的首选方法。

然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。

其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。

尽管这些方法大多数均被束之高阁，但其中最好的方法，也应是聚乙二醇分级沉淀法，最近已得到改进（R.Treisman,个人通讯）并达到较高境界，使用该方法可得到极高纯度的质粒。

聚乙二醇分级沉淀法与氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法有一点不同，那就是不能有效地把带切口的环状分子同闭环质粒DNA分开，因此，纯化容易带上切口的极大质粒（大于15kb）及用于生物物理学测定的闭环质粒时、平衡离心仍是首选的方法。

然而，两种纯化方法都可得到足可胜任分子克隆中各种复杂工作的质粒DNA，包括用于哺乳动物细胞的转染以及利用外切核酸酶产生成套的缺失突变体。

　　可幸，对于更常规的操作，则可全然免却进一步提纯的问题。

目前所用的质粒大多数复制量大，小量制备质粒即可得到足量的DNA完成以下种种工作；限制酶图的绘制、细菌转化、特定DNA片段的分离、常规亚克隆及放射性标记探针的制备。

四、质粒DNA的小量制备

一）细菌的收获和裂解

１、收获

１）将2ml含相应抗生素的ＬＢ加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。

2）将1.5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4℃以12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。

3）吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。

当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁的液滴。

2、煮沸裂解

该法根据Ｈolmex和Quigley（1985）的方法改进而成。

1）将细菌沉淀[收获细菌和步骤３）所得]重悬于350μlSTET中。

STET

0.1mol/LNaC

10mmol/LTris.Cl（pH8.0）

1mmol/LEDTA（pH8.0）

5%TritonX-100

2）加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,用10mmol/LTris.Cl（pH8.0）配制]，振荡３秒钟以混匀之。

如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。

3）将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。

4）用微量离心机于室温以12000g离心10分种。

5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。

6）在上清中加入40μl5mol/L乙酸钠（pH5.2）和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置５分钟。

7）用微量离心机于4℃以12000g离心５分种，回收核酸沉淀。

8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。

再将附于管壁的液滴除尽。

除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。

当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。

9）加1ml７０％乙醇，于4℃以12000g离心２分钟。

10）按步骤８）所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体（２－５）分钟。

11）用50μl含无DNA酶的胰RNA酶（20μg/ml）的TE（pH8.0）溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。

i．当从表达内切核酸酶Ａ的大肠杆菌株（endA+株，如HB101）中小量制粒ＤＮＡ时，建议舍弃煮沸法。

因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶Ａ，以后在Ｍg2+存在下温育（Ｖ中用限制酶时）质粒ＤＮＡ可被降解。

在上述方案的步骤９）之间增加一步，即用酚：

氯仿进行抽提，可以避免这一问题。

ii．此法制备的高考贝数质粒（如Ｘf3哉pＵＣ），其产量一般约为：

每毫升原细菌增减物３－５μg。

iii．如果要通过限酶切割反应来分析ＤＮＡ，可取１μlＤＮＡ溶液加到另一个含８μl水的微量离心管内，加１μl10x限制酶缓冲液和１单位所需限制酶，在适宜温度温育１－２小时。

将剩余的ＤＮＡ贮存于－20℃。

通过凝胶电泳分析经限制酸消化的ＤＮＡ片段。

如果小量制备的ＤＮＡ不被限制酶切开，很有可能在收获细菌的步骤３）或上述步骤８）未能很好地去除所有液体。

这种情况下，可用酚：

氯仿抽提ＤＮＡ终产物，然后用乙醇重新沉淀ＤＮＡ，通常，用5－10倍过量的酶（特别是并不昂贵的酶）在100-200μl体积中进行消化，可以克服限制酶切割反应遇到切割反应遇到的困难。

消化后，加0.1体积3mol/L乙酸钠（pH5.2）和２倍体积乙醇沉淀ＤＮＡ。

（二）质粒ＤＮＡ小量制备的问题与对策

裂解和煮佛法都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有会么麻烦。

多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：

1）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒ＤＮＡ不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。

大多数情况下，用酚：

氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。

如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化ＤＮＡ。

2）在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒ＤＮＡ的现象。

这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。

五、质粒DNA的纯化

（一）聚乙二醇沉淀法质粒ＤＮＡ

这里介绍的方法（R.Tresman,个人通讯）已卓有成效地用于纯化碱裂解法制备的质粒ＤＮＡ。

1）将核酸溶液[上页步骤９）所得]转入15mlＣorex管中，再加3ml用冰预冷的5mol/LLiCl溶液，充分混匀，用ＳorvallSS34转头（或与其相当的转头）于4℃下以10000转/分离心10分钟。

LiCl可沉淀高分子ＲＮＡ。

2）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于室温以10000转/分离心10分钏，回收沉淀的核酸。

3）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。

于室温用70％乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。

4）用500μl含无ＤＮＡ酶的胰ＲＮＡ酶（20μg/ml）的ＴＥ（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。

5）加500μl含13％（w/v）聚乙二醇（PEG8000）的1.6mol/LNaCl,充分混合，用微量离心机于４℃以12000g离心５分钟，以回收质粒ＤＮＡ。

6）吸出上清，用400μlTE（pH8.0）溶解质粒ＤＮＡ沉淀。

用酚、酚：

氯仿、氯仿各抽１次。

7）将水相转到另一微量离心管中，加100μl10mol/L乙醇铵，充分混匀，加２倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于４℃以12000g离心５分钟，以回收沉淀的质粒ＤＮＡ。

8）吸去上清，加200μl处于４℃以12000g离心２分钟。

9）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。

10）用500μlＴＥ（pH8.0）溶解沉淀1:

100稀释[用ＴＥ（pH8.0）]后测量ＯＤ260，计算质粒ＤＮＡ的浓度（１ＯＤ260＝50μg质粒ＤＮＡ/ml），然后将ＤＮＡ贮于－20℃。

（二）氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环ＤＮＡ

1、连续梯度

1）测量ＤＮＡ溶液的体积，按lg/ml的用量精确地加入固体CsCl,将溶液加温至30℃助溶。

温和地混匀溶液直到盐溶解。

2）每10mlＤＮＡ溶液加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水）；立即将溴化乙锭溶液（漂浮在表成）与ＤＮＡ－氯化铯溶液混匀，溶液的终密度应为1.55g/ml（溶液的折射率为1.3860）溴化乙锭浓度应为大约７４０μg/ml。

溴化乙锭贮存液应贮存于避光容器内（如用锡箔完全包裹的瓶子）。

于室温保存。

3）于室温用SorvallSS34头（或与其相当的转头）以8000转/分离心５分钟，浮在溶液上面的水垢状浮渣是溴化乙锭和细菌蛋白所形成的复合物。

4）用巴斯德吸管或带大号针头的一次性注射器将浮渣下的清亮红色溶液转移到适用于BeckmanTi65重直转头或Ｔi50、Ti65或Ti70角转头（或与它们相当的转头）的离心管（BeckmanQuick-seal或与之相当的离心管）中。

用轻石蜡油加满管的其余部分并封口。

5）于20℃对所得的密度梯度以45000转/分离心16小时（VTi65转头）、以45000转/分离心48小时（Ti50转头）、以60000转/分离心24小时（Ti65转头）或者以60000转/分离心24小时（Ti70.1转头）。

在普通光照下，在梯中心可见两条ＤＮＡ区带，上部区带材料通常较少，由线状的细菌（染色体）ＤＮＡ和带切口的环状质粒ＤＮＡ组成：

下部区带则由闭环质粒ＤＮＡ组成。

管底部深红色的沉淀是溴化乙锭ＲＮＡ复合物，位于ＣsCl溶液和石蜡油之间的是蛋白质。

BeckmanQuick-Seal离心管中的CsCl－溴化乙锭梯度可容纳4mg闭环质粒ＤＮＡ而不至超负荷。

如有更大量的质粒存在，将扩展为一条宽带，并与染色体ＤＮＡ相重叠。

这种问题只有在质粒复制达到极高水平时才会出现，只要将该质粒提取物分为２个梯度即可解决。

如出现负荷，可收集整个ＤＮＡ区高水平时才会出现，只要产将该质粒提取物分为２个梯度即可解决。

如出现超负荷，可收集整个ＤＮＡ区带，用CsCl溶液（ρ＝1.58g/ml）将体积调到15ml，在两个离心管中再度离心，使ＤＮＡ达到平衡。

6）收集ＤＮＡ带。

将21号皮下注射针头插入管的顶端以使空气进入，为尽量减少污染的机会，首先用１８号皮下注射针头按下述方法收集上部的区带（杂色体ＤＮＡ）：

用乙醇小心擦拭管外壁以除去任何油脂，然后用一块Soctch胶带贴于管外壁。

穿过Soctch胶带将１８号皮下注身针头（其斜面向上）斤插入管中，以便使针头的斜面开口恰好位于染色体ＤＮＡ区带之下并与该区带相平行。

将粘稠状ＤＮＡ收集到一次性使用的管内，用造型粘土块封信皮下注射针头的未端并将第２根针头留于原处。

穿过Soctch胶带插入第３根皮下注射针头（18号），将下部的质粒ＤＮＡ区带收集到玻璃或塑料管中。

2、不连续梯度

该方法是将含不同浓度CsCl的溶液分层加到离心管中，这样可以加速CsCl梯度的形成，使离心时间减少到６小时。

1）将125gCsCl加到167ml（pH8.0）中，制成CsCl溶液（ρ＝1.47g/ml）。

2）将8ml氯化铯溶液加到BeckmanQuick-Seal离心管（或与其相当的管）中，搁置一旁等步聚８）使用。

3）如有必要，可酌情用TE（pH8.0）将质粒ＤＮＡ溶液的体积精确地调到3ml。

4）在质粒ＤＮＡ溶液中加入8.4gCsCl,将溶液加温至30℃以促进盐溶解，小心地混匀溶液直至盐溶解。

5）称量溶液重量并加入TE（pH8.0）直到溶液重量恰好达13.2g，用天平称量时应注意去除管的重量。

6）加入0.8ml溴化乙锭溶液（10mg/ml溶于水），快速混匀溶液直至染料均匀地分散，此时溶液瓣体积应大约为7.5ml。

溴化乙锭贮存液应于室温贮存在避光容器中（如完全用锡箔包裹的瓶子）。

小心：

溴化乙锭是一咱强诱变剂，并在中度毒性。

接触含有该染料的溶液应戴手套。

7）于室温用SorvallSS34转头（或与之相当的转法）以8000转/分离心５分钟，浮在液面上的水垢状浮渣是溴化乙２锭和细菌蛋白所形成的复合物。

8）将－22.86cm的巴期德吸管放入装有步骤２）制备的CsCl的离心管中，吸头应接触管底。

用吸管小心地将步骤７）所制备的清亮红色溶液（来自浮渣之下）加入管内，使样本层位CsCl溶液（1.47g/ml）之下。

如有必要，可酌情步骤１）中制备的CsCl溶液（ρ=1.47g/ml）添满离心管，封口。

9）将封口的管，（与相应的平衡管一起）放入BeckmanTi70.1或Sorvall65.13转头（或与之相当的转头中），于20℃以60000转/分将密度梯度离心６小时。

10）回收闭环质粒ＤＮＡ区带

（三）从经过纯化的质粒ＤＮＡ中去除溴化乙锭

下面方法对于从经过氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心纯化的ＤＮＡ中去除溴化乙锭都同样奏效。

方法：

有机溶剂抽提

小心：

溴化乙锭是一种强诱变剂，并有中度毒性。

接触含有该染料的溶液应戴手套。

用后这些溶液应用后述的方法进行净化处理。

1）将ＤＮＡ溶液放入玻璃或塑料管中，加等体积的水饱和１－丁醇或异戊醇。

2）振荡混合两相。

3）用台式离心机于室温以1500转/分离心３分钟。

4）用巴期德吸管将下层水相移至一干净的玻璃或塑料管内。

5）反复抽提[步骤１）－４）]４－６次直到粉红色从水相和有机相中均消失。

6）用以下任意一种方法从ＤＮＡ溶液中除CsCl：

通过微量浓缩器（Amicon）进行旋转透析，对TE（pH8.0）透析24-48小时，并换液数次或者用３倍体积水进行稀释并于４℃用２倍体积乙醇（即终体积相当于原未稀释体积的６倍）沉淀Ｄ15分钟，再于４℃以10000g离心15分钏，将沉淀的ＤＮＡ溶于约1mlTE（pH8.0）中。

如将ＤＮＡ的乙醇溶液置于-20℃，CsCl会沉淀。

7）测定ＤＮＡ终溶液的ＯＤ260值，计算ＤＮＡ的浓度，将ＤＮＡ分成小份贮存于-20℃。

如果终制备的ＤＮＡ含有显著量的溴化乙锭（依颜色判断），可用酚、酚：

氯仿各抽提１次，然后用乙醇沉淀ＤＮＡ。

（四）溴化乙锭溶液的净化处理

小心：

溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些溶液经使用应按下面介绍的方法进行净化处理。

1、溴化乙锭浓溶液（即浓度>0.5gm/ml的溴化乙锭沉溶液）的净化处理

方法：

用少门氏菌－微粒体测定表明，本方法（Lunn和Sanaone,1987）可使溴化乙锭的诱变活性降低至原来的1/200左右。

1）加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5mg/ml以下。

2）加入0.2体积新配制的５％次磷酸和0.12体各新配制的0.5mol/L亚硝酸钠，混匀。

切记：

检测该溶液的pH值应小于3.0。

市售次磷酸一般为50％溶液，具有腐蚀性，应小心操作，必须现用现稀释。

亚硝酸钠溶液（0.5mol/L）应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml，现用现配。

3）于室温温育24小时后，加入大大过量的1ml/L碳酸氢钠。

至些，该溶液可予丢弃。

返回切记：

检测该溶液的pH值应小于3.0。

市售次磷酸一般为50％溶液，具有腐蚀性，应小心操作，必须现用现稀释。

亚硝酸钠溶液（0.5mol/L）应用水溶解34.5g亚硝酸钠并定容至终体积500ml，现用现配。

3）于室温温育24小时后，加入大大过量的1ml/L碳酸氢钠。

至些，该溶液可予丢弃。

（五）从质粒ＤＮＡ制品中去除ＲＮＡ

对于某些用途（例如用ＢＡＬ31进生活化或用Ｔ４噬菌体多核苷酸激酥标记质粒ＤＮＡ的限制切片段的５'端），必须获得无ＲＮＡ污染的ＤＮＡ制品。

尽管在通过氯化铯－化乙锭梯度平衡离心所制备的质粒ＤＮＡ中，这样的ＲＮＡ污染物的重量微不卟道，但对说来，其中的ＲＮＡ分子数却可能相当可观，并可在限制酶消化反应的全部５'端中占据砂容忽视的比例。

通过下述方法，可以从质粒制品中去除ＲＮA。

1、通过Bio-GelA-150m或SepharoseCL-4B进行层析

1）制备质粒ＤＮＡ。

2）有等体积的经TE（pH8.0）平衡后的酚抽提１次。

3）将至多1ml的水相铺在经TE（pH8.0）和0.1％ＳＤＳ平衡的Bio-GelA-150m或SepharaseCL-4B（1x10cm）柱上。

4）将ＤＮＡ装入层柱并在柱的上部连接上含0.1％ＳＤＳ的TE（pH8.0）的贮液瓶，立即开始以0.5ml流出液为１流进行收集。

5）当收集到15份时，关闭柱底部，为明确质粒ＤＮＡ的分布情况，可心众每份收集物中取10μg样品，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳或溴化乙锭荧光（见附录Ｅ）进行分析。

6）将含质粒ＤＮＡ的组成合并在一起，加２倍体积的乙醇于４℃沉淀10分钟，然后于４℃以大于10000g离心15分钟，以回收ＤＮＡ。

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基因组DNA的提取

　　基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等。

利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。

加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中,可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部,从而达到提取的目的。

在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓,以保证得到较长的DNA。

一般来说,构建基因组文库,初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。

而进行RFLP和PCR分析,DNA长度可短至50kb,在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段（20kb以下）,并可保证包含PCR所扩增的片段（一般2kb以下）。

　　不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同;不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。

在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法,以获得可用的DNA大分子。

尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时,应考虑除去多糖和酚类物质。

　　制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，通常要求得到的片段的长度不小于100-200kb。

在DNA提取过程中应尽量避免使DNA断裂和降解的各种因素，以保证DNA的完整性，为后续的实验打下基础。

主要是CTAB方法，其他的方法还有1物理方式:

玻璃珠法超声波法研磨法冻融法。

2化学方式：

异硫氰酸胍法碱裂解法3生物方式:

酶法。

根据核酸分离纯化方式的不同有:

硅质材料、阴离子交换树脂等

试验步骤：

1、贴壁细胞用胰酶消化，离心收集。

2、细胞重悬于冰冷的PBS漂洗一次，离心收集。

试验步骤2再重新作一边。

3、加入5mlDNA提取缓冲液，（10mmol/LTris-cl0.1m