抗PLA2G13多克隆和单克隆抗体的制备与鉴定.docx

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抗PLA2G13多克隆和单克隆抗体的制备与鉴定

抗PLA2G13多克隆和单克隆抗体的制备与鉴定

（作者:

___________单位:

___________邮编:

___________）

作者：

李淑珍,刘莹,陈苗,柳晓兰,唐小波,高建恩,朱大岭,孙启鸿【摘要】　　目的:

制备分泌型的磷脂酶A2G13（groupXIIIsecretedphospholipaseA2,PLA2G13）的多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）,并对抗体进行特性鉴定。

方法:

以人正常肝cDNA文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-PLA2G13（即PLA2G13-GST）和pET-32a-PLA2G13（即PLA2G13-His）。

PLA2G13-GST融合蛋白作为免疫原制备兔pAb和鼠mAb。

采用Westernblot鉴定兔抗人PLA2G13pAb的特异性。

采用Westernblot和Immunohistochemistry鉴定鼠抗人PLA2G13mAb的特异性。

结果:

PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白在均大肠杆菌中以包涵体形式大量表达。

Westernblot鉴定表明,兔抗人PLA2G13pAb可特异地识别HepG2细胞系中相对分子质量（Mr）约19700的蛋白,与文献报道中PLA2G13的实际Mr相符。

通过筛选共获得8株可稳定分泌抗PLA2G13的杂交瘤细胞株,Westernblot鉴定表明6株可识别重组人PLA2G13蛋白,免疫组织化学鉴定显示2株可特异性识别正常肝组织中的PLA2G13蛋白。

结论:

成功地制备了抗人PLA2G13兔pAb和鼠mAb,为进一步研究PLA2G13的功能提供了特异性检测工具。

【关键词】PLA2G13原核表达融合蛋白抗体制备　　分泌型的磷脂酶A2G13（groupXIIIsecretedphospholipaseA2,PLA2G13）是分泌型磷脂酶家族的成员之一,基因定位于10q22.1,包含195个氨基酸,相对分子质量（Mr）约21400,主要存在于细胞外基质,成熟型PLA2G13Mr约19700,其结构特征类似于磷脂酶家族另一个成员PLA2G12,但二者的组织分布呈现很大差别［1］。

RNAblots结果展示PLA2G13基因在成人肝脏,小肠中表达,而在肾脏中则呈现较低水平的表达。

生理条件下,分泌型磷脂酶家族参与炎症反应、宿主防御反应和动脉粥样硬化等生物学过程。

其家族成员多具有磷脂酶活性,而PLA2G13在其活性位点由亮氨酸突变为组氨酸,因此不具有磷脂酶活性。

近年来的基因水平研究和蛋白芯片研究结果均显示PLA2G13在肝癌和肝硬化发生时基因和蛋白水平上调［2］。

但是目前,PLA2G13基因在肝癌发生发展中的确切分子机制仍然不清楚。

我们主要从构建重组表达载体入手,获得其融合表达蛋白后,免疫新西兰雄性大耳白兔和BALB/c小鼠,制备抗PLA2G13的多克隆抗体（pAb）和单克隆抗体（mAb）,并对抗体进行特性鉴定,为进一步研究PLA2G13的功能及其在肝癌的发生,发展及治疗中的作用。

　　1材料和方法　　1.1材料成人肝cDNA文库购自Clonetech公司。

大肠杆菌BL21感受态菌株为本实验室自制。

pGEX-4T-1和pET-32a为Amersham公司产品。

限制性内切酶EcoRI和XhoI、ExTaq酶、T4连接酶等购自TaKaRa公司。

PCR回收试剂盒,质粒提取试剂盒购自OmegaBiotek公司。

BALB/c小鼠和新西兰雄性大耳白兔购自军事医学科学院动物中心。

小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0为军事医学科学院放射与辐射医学研究所免疫室制备。

Hbt小鼠mAb分型试剂盒购自HyCultbiotechnologyb.v.公司。

鼠抗GST标签mAb、HRP-羊抗鼠IgG、HRP-羊抗兔IgG、ECL显色系统均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

　　1.2方法　　1.2.1PLA2G13抗原的制备和纯化根据HumanProteinReferenceDatabase中提供的PLA2G13的氨基酸序列,并结合应用生物信息学软件DNAstar的表位分析,综合设计引物。

在其上游引物设计EcoRI酶切位点,下游引物设计XhoI酶切位点,片段全长297个碱基,以人正常肝cDNA文库为模板进行PCR反应。

回收扩增目的片段,并将目的片段及pGEX-4T-1和pET-32a载体分别经EcoRI和XhoI双酶切并连接,转化入大肠杆菌,阳性克隆经测序正确后抽提质粒,进行诱导表达。

PLA2G13在BL21细菌中以包涵体形式表达,收集蛋白并进行纯化。

　　1.2.2PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白的Westernblot分析将重组菌菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后,电转移至PVDF膜上。

经50g/L脱脂奶粉封闭液室温封闭1h后,分别加入1∶2000稀释的鼠抗GSTmAb和鼠抗HismAb,室温下孵育2h,TBST缓冲液洗膜后,加入HRP-羊抗鼠IgG抗体（1∶5000稀释）,室温下孵育1h,TBST缓冲液洗膜后,ECL法显色。

　　1.2.3兔抗人PLA2G13pAb的制备将纯化的PLA2G13融合蛋白和等体积弗氏完全佐剂充分混合后,每只家兔皮下多点免疫融合蛋白400μg;4周后第2次免疫,5周后耳缘静脉采血检测抗体效价。

7周后颈动脉采血,分离血清,分装后置-20℃保存。

　　1.2.4兔抗人PLA2G13pAb的特性鉴定

（1）ELISA检测抗血清效价:

ELISA检测板用PLA2G13-His融合蛋白以1mg/L的浓度包被。

按梯度稀释抗血清每孔加入100μL（阴性对照为正常兔血清,空白对照为TBST）,37℃孵育30min洗涤3次后,加入1∶6000稀释的HRP-羊抗兔IgG,37℃孵育30min洗涤3次后进行TMB显色。

（2）Westernblot检测兔抗人PLA2G13pAb:

重组菌菌体蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳后,将蛋白质转移至PVDF膜上。

封闭液封闭后,加入兔抗人PLA2G13pAb与膜上的蛋白进行抗原-抗体反应后,用HRP-羊抗兔IgG进行检测,ECL显色,至目的条带显色清晰时终止反应。

（3）兔抗人PLA2G13pAb在肝癌细胞中的鉴定:

抽提HepG2总蛋白,经SDS-PAGE凝胶电泳后,电转移至PVDF膜上。

经50g/L脱脂奶粉封闭液室温封闭1h后,加入按1∶5000稀释的兔抗人PLA2G13pAb,室温下孵育1h,TBST洗3次后,加入1∶10000稀释的HRP-羊抗兔IgG,室温下孵育45min,TBST洗3次后进行ECL显色。

阴性对照中设正常兔血清为一抗,空白对照中为TBST为一抗。

　　1.2.5鼠抗人PLA2G13mAb的制备实验动物为BALB/c小鼠,6～8周龄,质量17～21g。

第1次免疫时,将PLA2G13-GST融合蛋白与等体积弗氏完全佐剂混合,免疫3只小鼠,每只小鼠经皮下多点注射抗原80μg。

4周后进行第2次免疫,抗原与等体积弗氏不完全佐剂混合,每只小鼠经皮下多点注射抗原40μg。

第2次免疫后7d,经尾静脉采血,用ELISA法测定血清抗体的效价。

选择抗体效价高的小鼠,于融合前3d,在尾静脉注射PLA2G13-GST40μg进行加强免疫。

取免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞株Sp2/0细胞按常规方法融合。

用间接ELISA法筛选,有限稀释法克隆化,并按常规方法制备mAb腹水。

　　1.2.6鼠抗人PLA2G13mAb的特性鉴定Westernblot检测mAb:

PLA2G13-GST和PLA2G13-His重组蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳后,电转至PVDF膜上,用50g/L脱脂奶粉室温下封闭1h,然后加入杂交瘤细胞培养上清,4℃孵育过夜,TBST缓冲液洗膜后,加入羊抗鼠IgG-HRP抗体（1∶7500稀释）,室温下孵育1h,TBST缓冲液洗膜后,ECL法显色。

阴性对照中设正常鼠血清作为一抗,阳性对照中融合鼠血清为一抗。

（2）Immunohistochemistry鉴定鼠mAb在正常成人肝组织中的反应:

丙酮固定的冰冻成人肝组织切片用PBST浸洗5min后每个组织片滴加25mg/L的Avidin（屏蔽体内的生物素）50mL,室温孵育15min,滴加30mL/LH2O2－甲醇,室温孵育15min。

滴加正常羊血清室温下封闭30min,加入鼠抗人PLA2G13杂交瘤细胞培养上清,4℃孵育过夜。

PBS洗片后加入羊抗鼠IgG-HRP,37℃孵育30min,PBS洗片后进行DAB显色,苏木素复染,返蓝后封片。

　　2结果　　2.1PLA2G13融合蛋白的表达与鉴定经IPTG诱导后,PLA2G13-GST和PLA2G13-His在大肠杆菌BL21中大量表达,Mr分别为38000和32000,与预测的PLA2G13融合蛋白的Mr相一致,表达量约占菌体总蛋白的50%～60%,融合蛋白主要以包涵体的形式表达（图1）。

通过Westernblot检测,应用抗GST和抗His的抗体能够在相应位置分别检测到PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白（图2）。

　　图1PLA2G13融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳分析（略）　　1:

阴性对照（大肠杆菌BL21裂解蛋白）;2:

大肠杆菌BL21中表达的PLA2G13-His融合蛋白;3:

大肠杆菌BL21中表达的PLA2G13-GST融合蛋白.　　图2PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白的Westernblot分析（略）　　1:

阳性对照（GST标签蛋白）;2:

PLA2G13-GST融合蛋白;3:

阳性对照（His标签蛋白）;4:

PLA2G13-His融合蛋白.　　2.2兔抗人PLA2G13pAb的特性鉴定ELISA检测板用PLA2G13-His融合蛋白以1mg/L的浓度包被。

间接法检测抗体的效价为1∶512000。

用兔抗人PLA2G13pAb对融合蛋白进行Westernblot实验,证实在Mr约38000和32000处各有一特异性的条带,说明此pAb可以特异性识别重组PLA2G13蛋白。

Westernblot分析显示兔抗人PLA2G13pAb可以在HepG2细胞总蛋白中检测到Mr为19700蛋白,这与文献报道的PLA2G13的Mr一致,在Mr为62000~64000处也有一清晰条带,于其无活性形式蛋白Mr相符。

阴性对照（兔免疫前血清代替一抗）在相应位置无条带（图3）。

　　2.3杂交瘤细胞株的建立及抗体亚类的测定

（1）经细胞融合、筛选及克隆化,获得8株能稳定分泌抗PLA2G13mAb的杂交瘤细胞株（AE093、BA071、BG091、CE073、DB082、DE061、EC051和EG071）。

（2）抗体亚类的测定结果显示,mAb均为IgG类。

　　图3兔抗人PLA2G13pAb特异性的Westernblot鉴定（略）　　1:

阴性对照（大肠杆菌BL21裂解蛋白）;2:

PLA2G13-His融合蛋白;3:

PLA2G13-GST融合蛋白;4:

HepG2细胞总蛋白.　　2.4mAb的特异性鉴定

（1）Westernblot显示:

杂交瘤AE093、BA071、CE073、DB082、EC051和EG071的培养上清能同时检测到重组的PLA2G13-GST和PLA2G13-His蛋白（图4）,表明这6株mAb可特异性识别重组PLA2G13蛋白;

（2）Immunohistochemistry检测:

取正常成人肝组织冰冻切片进行免疫组化检测。

只有杂交瘤AE093、CE073、EC051的培养上清能识别切片中相应抗原。

抗原呈颗粒状分布,仅见于肝细胞,汇管区各结构均阴性（图5）。

　　图4抗PLA2G13mAb特异性的Westernblot鉴定（AE093）（略）　　1:

阴性对照（GST标签蛋白）;2:

PLA2G13-His融合蛋白;3:

PLA2G13-GST融合蛋白.　　图5PLA2G13蛋白在人正常肝脏组织中的免疫组织化学定位（×200）（略）　　A:

阴性对照（正常鼠血清）;B:

杂交瘤细胞株AE093培养上清.　　3讨论　　PLA2G13基因定位于人类染色体10q22.1,编码195个氨基酸的钙离子结合蛋白［3］,隶属于分泌型磷脂酶家族,成熟型PLA2G13Mr约19700,其结构特征与磷脂酶家族另一个成员PLA2G12相似,但二者的组织分布呈现很大差别。

Rouault等［4］的RNAblots研究结果展示PLA2G13基因在成人肝脏,小肠中均有表达,同时在肾脏中呈现较低水平的表达。

生理条件下,PLA2G13参与脂质转运、细胞与细胞间相互作用和细胞间信号转导等生物学过程［5,6］。

分泌型磷脂酶家族成员多具有磷脂酶活性［7］,而PLA2G13在其活性位点由亮氨酸突变为组氨酸,因此其磷脂酶活性丧失。

PLA2G13亦不能与分泌型磷脂酶家族的传统M型受体结合［8］,Rouault等［4］证明并鉴定了32种与PLA2G13表达相关的基因,其中包括TRA1、TLOC1和ANXA7。

这些基因的上调显示了在肿瘤细胞中蛋白质运输活力的增强,更为有趣的是他们发现7种与PLA2G13相关的基因,可分别编码过氧化物酶,解毒素酶和参与氧化应激反应的一些酶类,提示了PLA2G13可能参与这些生物进程。

近年来的基因水平研究和蛋白芯片研究结果均显示PLA2G13在肝癌和肝硬化发生时基因和蛋白水平上调,但PLA2G13在一些组织的肿瘤发生时表达减少,提示了在肿瘤发生时可能作为一个基因抑制物来发挥作用［5］。

Smith等［2］通过基因芯片的方法发现PLA2G13在60%~70%的肿瘤病例中均显示基因上调变化,且这种变化在肝癌和肝硬化病例中尤为显著,因此PLA2G13可能是一种潜在的肝癌的血清学的特异性标记物,有望成为临床治疗肝癌这一恶性肿瘤的新基因靶点。

但是目前,PLA2G13基因在肝癌发生发展中的确切分子机制仍然不清楚。

　　本研究中,我们利用原核表达系统,表达了PLA2G13-GST和PLA2G13-His融合蛋白,并以PLA2G13-GST为免疫原,用带有不同标签的PLA2G13-His为检测原,免疫动物成功制备了抗PLA2G13pAb和8株可稳定分泌抗PLA2G13的杂交瘤细胞株,其均为IgG类。

对制备的pAb和mAb进行了特异性分析,实验结果显示免疫兔血清中产生了抗PLA2G13和GST的抗体,可特异识别重组表达的PLA2G13蛋白,并可特异识别肝癌细胞系HepG2中的PLA2G13蛋白;8株可稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株中,mAbAE093、BA071、CE073、DB082、EC051、EG071在Westernblot检测中能特异性识别重组的PLA2G13蛋白,mAbAE093、CE073、EC051可用于免疫组织化学检测正常肝组织中表达的PLA2G13蛋白,其主要定位于细胞质中。

由于抗PLA2G13pAb和mAb对PLA2G13均具有很好的识别特性,因此为进一步研究PLA2G13在恶性肿瘤发生发展中的确切分子机制提供了必要的工具。

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