用光学二次谐波成像技术观察皮肤内不同种类的胶原.docx
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用光学二次谐波成像技术观察皮肤内不同种类的胶原
第14卷第4期2005年8月
激光生物学报
AC7rAL蟠ERBIOLoGYSINICA
v01.14No.4Aug.2005
・激光生物与光子中医学・
用光学二次谐波成像技术观察皮肤内
不同种类的胶原j
王毅1,鲍进1,盛巡2,李萍2,马辉¨
（1.清华大学物理系,中国北京100084;2.北京中医医院药物研究所,中国北京100010
摘要:
目的:
用光学二次谐波成像的方法比较成熟皮肤与新生皮肤内不同种类胶原的含量,以及正常皮肤与创伤皮肤内胶原种类的变化。
方法:
用前向及背向二次谐波观察正常及创伤皮肤内的胶原,并与传统的天狼猩红染色法相对照。
结果:
与传统方法相比,二次谐波可以更快速,更灵敏地检测组织中的胶原。
背向二次谐波信号强度随着切片厚度的增加而增强。
结论:
光学二次谐波成像技术是一种灵敏、简单、快速检测皮肤组织内胶原的新方法,具有很好的应用前景,可应用于活体检测。
关键词:
二次谐波;光学成像;皮肤;胶原
中图分类号:
0437;口334
文献标识码:
A
文章编号:
10Cr7.7146（20Q5悼027年05
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Keywoms:
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二次谐波成像是新近发展起来的激光扫描非线性光学显微术。
它利用超快激光脉冲与介质相互作用产生的倍频相干辐射作为图像信号来源,具有高分辨、高对比度的三维成像能力。
胶原、肌肉等生物组织能够产生很强的二次谐波信号【1剖。
二次谐波可采用近红外光源激发,对生物样品的杀伤作用小,在高散射体中的穿透能力强,有利于提高探测深度。
基金项目:
北京市自然科学基金项目（项目编号:
7043cr70收稿日期:
2005-0每15二次谐波反映样品本身的非线性光学性质,可以不需要染料标记,避免由此带来的光毒性。
该成像方法适合对活体进行动态测量,在生物医学研究领域具有广阔的应用前景。
正常人皮肤中80%为工型胶原,其余大部分为Ⅲ型胶原,I型胶原排列有序,纵横交错,构成网状结构的真皮层;Ⅲ型胶原包裹着胶原纤维束,分布在
第4期王毅等:
用光学二次谐波成像技术观察皮肤内不同种类的胶原275
边界结构处。
在创伤恢复过程中,胶原的排列逐渐从无序到有序,Ⅲ型胶原在创伤愈合的开始占主导地位,在愈合的末期,Ⅲ型胶原又被工型胶原所代替。
因此工型胶原与Ⅲ型胶原的比率是衡量创伤的愈后程度的重要指标。
对于创口内,衡量I、Ⅲ型胶原比率的方法目前常采用组织特染和免疫组化两种方法。
但特染仅能表达胶原总体的变化,不能同时区分I、Ⅲ型胶原的类型,且易褪色,不易长久保存和回顾性研究。
免疫组化法,尽管特异性强,但操作程序繁琐,其染色效果受很多因素影响,如抗体效价,实验者经验等,结果不易稳定。
且抗体较昂贵,不易保存,同时也不能在同一切片中反映两种胶原类型（I/Ⅲ型的变化。
近来出现的天狼星红偏振光法H1虽然操作简单（同胍染色相近,但不能活体动态观察样品,是组化观察法的缺点。
最近,特别是近一年,二次谐波成像在对活生物样品进行无损测量或者长时间动态观察方面显示出独特的应用潜力,得到方法学研究与生命科学研究领域的重视睁副,其图象质量高、杀伤小、不需要染色等特点也为长时间观察创伤愈合的动态过程提供了一种新的实验方法。
在本试验研究中,我们将系统比较天狼星红偏振法与二次谐波成像法的成像质量的不同,及背向二次谐波强度与探测深度的关系,为二次谐波在动物活体上的应用奠定基础。
1材料与方法
1.1实验装置
本工作在实验室已有的激光扫描双光子荧光显微镜基础上,通过改装信号探测外通道,从背向上收集信号,实现了背向二次谐波成像。
背向二次谐波成像和双光子荧光成像都是从背向上进行探测,都不受样品厚度的影响,从技术上来讲可以说是完全兼容的。
在这套成像系统中,可以同时进行双通道复合测量。
激发光源是掺钛蓝宝石飞秒超快激光器（TsullaIl】i,SpectraPhysics,UsA,波长入选为81lr髓,脉冲宽度120fs,重复频率80nl比。
激光输出的功率可达1W,经光路衰减后在样品处仍有200HlW左右,加上衰减片组之后可在0~200mW之间调节。
激发光由物镜聚焦到样品上,产生的背向传播的二次谐波信号由同一个物镜收集,经过窄带滤波片（中心波长405.6mn,半高全宽8衄,由光电倍增管转化为电信号送计算机处理,得到背向二次谐波图像。
如果样品有自荧光或者经过荧光染料染色,将同时外一个信号通道,送到计算机中成像。
双光子荧光波长略大于激发波长的一半,光谱比较宽,一般为几十到几百纳米;而二次谐波的波长正好是激发波长的一半,光谱很窄,半高全宽大约只有10m。
因此,在双光子荧光通道使用带通或高通滤波片,很容易避开二次谐波的峰值波长;在二次谐波通道使用半高全宽只有8咖的窄带滤波片,可以很好地挑选出二次谐波信号,荧光信号的贡献可以忽略。
前向发生的二次谐波信号先经一块带通滤波片,再经过窄带滤波片（同背向,由光电倍增管转化为电信号送计算机处理,得到前向二次谐波图像。
利用这套实验装置,我们对创伤皮肤切片样本进行了观察。
1.2样品制备
1.2.1组织切片取人正常及溃疡组织（由北京市中医医院药物研究所提供后用生理盐水冲洗,组织放人20%福尔马林固定液中,固定3d后,元水乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋后切片（4脚;进行背向二次谐波强度比较实验时,切片厚度为5脚,10胛,20肿,30耻,40脚后进行天狼星红染色或直接进行前向及背向二次谐波观察。
1.2.2天狼星红染色取石腊切片,二甲苯脱蜡、水化,天青石蓝（selestineB1ueB,si舯a公司染色10IIlin,蒸馏水洗三次,放人天狼星红（siriusRoSeBB,nuca公司一苦味酸溶液中染色25IIlin,直接进梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片。
1.3实验方法
1.3.1利用二次谐波成像技术结合偏振光成像及免疫组化法对比观察新生胶原和成熟胶原的区别观察不同皮肤（正常,创伤中,I,Ⅲ型胶原的种类及分布变化取人正常及溃疡皮肤切片,按2.1及2.2方法准备天狼星红染色切片,用二次谐波成像观察,结合光镜、偏光显微镜图像,观察工,Ⅲ型胶原的种类及分布变化。
1.3.2观察不同厚度切片背向二次谐波强度变化取人正常皮肤,按2.1方法制成不同厚度切片（5舢,10耻,20耻,30舯,40胛,观察背向二次谐波随样品厚度的变化规律。
2结果
2.1利用二次谐波成像技术结合偏振光成像及免疫组化法对比观察新生胶原和成熟胶原的区别如图1所示,天狼星红染色的切片在偏光显微镜下,I型胶原为黄红色,Ⅲ型胶原为绿色（图1B,
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齐,二次谐波信号强,而Ⅲ型胶原信号很弱（图lc。
由图1中上图可见,正常皮肤中,工型胶原占大多数,Ⅲ型胶原较少,二次谐波信号强,且I型胶原粗大,排列有序（上图A,B,C。
下图为创伤病人皮肤切片,创口处于修复初期,工型胶原较少。
偏光图象下,切片内几乎观察不到胶原,而在前向二次谐波成像图中可以看到有类似于Ⅲ型胶原强度的信号分布（下图A,B,C。
图1用二次谐波成像方法观察皮肤天狼猩红染色切片
上图:
正常人皮肤;下图:
人创伤皮肤
A.光学显微镜下天狼星红染色图（20×;B.偏光显微镜下天狼星红染色图（20×;c.前向二次谐波图像（20×
Fig.1SHGim缚ngofskinslicesstainedbySiriusred
卜}o瑚alh砌肌skin（abo、他;1瞩bundhunmskin（below
A.optical111icIosc叩yiⅡmges（20×;B.Pol撕z撕0nIllicIoscopyiIllages（20×;C.Fo刑ardSHGimages（20×
2.2观察不同厚度切片背向二次谐波强度变化为了探讨背向二次谐波应用于活体标本检测的可能性,我们验证了背向二次谐波强度随不同厚度切片变化的情况。
图2为同一位置不同厚度的未染色切片背向二次谐波图像,切片厚度分别为5脚,10肿,20脚,30脚,40pM（图2A,B,C,D,E,由图中可以看出,背向二次谐波强度随切片厚度的增加信号逐渐变强,厚度为40州的切片背向二次谐波信号最强。
3讨论
二次谐波是现代生物学领域一项新的成像技术,作为一种非线性成像方法越来越引起人们的重视,适用于观察标记后的膜结构‘7。
83及未染色的,排列紧密,整齐有序的非中心对称的蛋白质如胶原、肌肉、微管等叫,它所具备的优点使其在多个方面得到应用,如心外科,眼科,及组织工程等n¨2|。
但做为一个新技术,很多性质还有待研究,尚处于探索阶段。
表1不同厚度切片背向二次谐波强度的变化1址.1Backwa【rdSHGinte璐毋varies衍tlldi艉rerltslicedeptIl
样品厚度（肼
510203040Deplllof呲
二次谐波强度’
1920202225SHGinte璐itr
*二次谐波强度为一幅512×512像素图扣除背景后的平均灰度值
*SHG峨Ilsityis‰av哪gevalueofa512×512陋li脚gede-
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第4期王毅等:
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胶原纤维的分子又叫原胶原（‰pocouagen,各种类型的胶原分子都是由三条肽链组成。
I型胶原分子由两条a1（I链和一条a2（工链组成[a1（工]:
a2（I,Ⅱ型胶原分子为[a1（Ⅱ]。
Ⅲ型胶原分子为[d1（Ⅲ],。
三条肽链相互缠绕,形成了胶原蛋白分子特有的三螺旋杆状结构,胶原分子的分子量约为300kD,长达300砌,直径为1.5m。
每条肽链由约1000氨基酸残基组成左手螺旋,螺距为
图2不同厚度皮肤切片背向二次谐波强度的变化A.5弘M;B.10弘M;C.20弘M;D.30弘M;E.40肛MFig.2BackwardSHGirmgesofskinslicesindif.ferentdeptllA.5脚讧;B.10pM;C.20弘M;D.30pM;E.40pM
由实验2.1可以看出,与创伤部位的皮肤相比,正常人的皮肤中I型胶原含量较高,排列整齐有序,而创伤部位的工型胶原含量很少。
用传统偏光显微镜观察创伤部位胶原再生需要皮肤取样切片染色,无法做活体观察;而二次谐波成像既可以分辨I型和Ⅲ型胶原分布,并且由于近红外激光在组织中较高的穿透性,可以作用到深达500肿处的真皮层,实现活体成像。
为了适应于活体观察,我们检测了背向二次谐波的强度与皮肤厚度的关系,对同一部位的标本切了不同厚度的切片。
由于皮肤组织二次谐波发生背向散射相干叠加,背向二次谐波强度随样品厚度增0.87・Ⅱn。
三条肽链又相互缠绕形成一个大螺旋,为右手螺旋,螺距为9.6mn。
就是这种高度的非中心对称的分子构型,使得胶原分子,尤其是工型胶原分子可产生很强的二次谐波。
如实验2.1所示,在二次谐波成像图中,I型胶原粗大,排列紧密,而Ⅲ型胶原细小,二次谐波信号较弱,在图中可明显区分出来（图1。
加而增强,充分显示了背向二次谐波应用于厚组织以及活体的优势。
综上所述,做为一个新的检测技术,二次谐波成像在观察皮肤创伤愈合过程中显示了其它检测手段所不具备的优势,使活体动态观察创伤的愈合过程成为可能,基于以上的实验基础,我们将进一步拓展其在创伤进程的判断、药物药效观察等领域的应用。
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作者简介
王
毅:
女,1971年11月出生,博士,吉林长春人。
清华大学物理系博士后,主要从事光学成像在生
物体系中的应用研究。
Biography
WANI;Yi:
Fe麟de,hI
in
N西ernber,1971
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Jilin印谢nce.She
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№
用光学二次谐波成像技术观察皮肤内不同种类的胶原作者：
作者单位：
刊名：
英文刊名：
年，卷（期：
被引用次数：
王毅，鲍进，盛巡，李萍，马辉，WANGYi，BAOJin，SHENGXun，LIPing，MAHui王毅,鲍进,马辉,WANGYi,BAOJin,MAHui（清华大学物理系,中国,北京,100084，盛巡,李萍,SHENGXun,LIPing（北京中医医院药物研究所,中国,北京,100010激光生物学报ACTALASERBIOLOGYSINICA2005,14（43次参考文献（12条1.林幸笋;潘琳;胡金云生物活组织的背向二次谐波成像[期刊论文]-生物化学与生物物理进展2004（012.GuoY;HOPP;SAVAGEHSecond-harmonictomograpbyoftissues[外文期刊]19973.CampagnolaPJ;ANDREWCM;MARKTThree-dimensionalhigh-resolutionsecond-harmonicgenerationimagingofendogenousstructuralproteinsinbiologicaltissues[外文期刊]2002（14.ZINFEIGWR;WILLIAMSRM;GHRISTIERLivetissueintrinsicemissionmicroscopyusingmultiphotonexcitednativefluorescenceandsecondharmonicgeneration[外文期刊]2003（125.MoreauxL;SANDREO;BLANCHARD-DESCEMMembraneimagingbysimultaneoussecond-harmonicgenerationandtwo-photonmicroscopy[外文期刊]2000（056.YasuiT;TOHNOY;ARAKITDeterminationofcollagenfiberorientationinhumantissuebyuseofpolarizationmeasurementofmolecularsecond-harmonic-generationlight[外文期刊]2004（147.HanM;ZICKLERL;GIESEGSecond-harmonicimagingofcorneaafterintrastromalfemtosecondlaserablation[外文期刊]2004（048.ZOUMIA;LUX;KASSABGSImagingcoronaryarterymicrostructureusingsecond-harmonicandtwophotonfluorescencemicroscopy[外文期刊]2004（049.CampagnolaPJ;DEWAIM;LEWISAHighresolutionnonlinearopticalimagingoflivecellsbysecondharmonicgeneration[外文期刊]1999（610.WagenerFA;VAN-BEURDENHE;VONDENHOFFJWTheheme-hemeoxygenasesystem:
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