食品理化分析技术W37024微教材.docx

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食品理化分析技术W37024微教材

《农产品/食品理化分析技术》课程-微教材

微课编号

W3702

微课名称

维生素的测定方法

所属模块

农产品/食品中营养成分测定

子模块

维生素测定

关键词

维生素A；维生素D；维生素B1；维生素C；测定

是否通用

√通用农产品食品

是否重点建设

是√否

微课类型

讲授型

微课形式

录播教室实录式

教学设计模式

讲授法

教学目标

1．了解各类食品中维生素的特点。

2．掌握各类维生素的测定方法。

教学内容

知识点

技能点

1.维生素A的测定原理；

2.维生素D的测定原理；

3.维生素B1的测定原理；

4.维生素C的测定原理；

1.维生素A的测定技术；

2.维生素D的测定技术；

3.维生素B1的测定技术；

4.维生素C的测定技术；

三、脂溶性维生素的测定

1、VA的测定－三氯化锑比色法：

（1）原理。

在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在620nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。

（2）试剂。

①无水硫酸钠（不吸附VA）；

②乙酸酐；

③无水乙醚（不含过氧化物）；

④无水乙醇（不得含有醛类物质）；

⑤三氯甲烷（不含分解物）；

⑥20％～25％三氯化锑－三氯甲烷溶液；

⑦50％氢氧化钾溶液；

⑧VA标准溶液：

取脱醛乙醇溶解VA标品（纯度85％的视黄醇或纯度90％的视黄醇乙酸酯），使其浓度约为1mg/ml视黄醇。

临用前以紫外分光光度法标定其浓度；

⑨1％酚酞指示剂。

（3）操作方法。

①样品处理：

根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。

a.皂化法：

适用于VA含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，皂化过程费时，易导致VA损失。

皂化：

称样0.5～5g样品于锥形瓶，加入10ml氢氧化钾及20～40ml乙醇，电热板上加热回流30min至皂化完全。

提取：

将皂化液移入分液漏斗，先用30ml水洗皂化瓶（如有渣子，用脱脂棉滤入分液漏斗），再用50ml乙醚分两次冲洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗，振摇2min，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗。

皂化瓶再用30ml乙醚分两次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗，振摇后静置分层，将水层放入第三分液漏斗，醚层并入第一分液漏斗。

如此重复操作，直至醚层不再使三氯化锑－三氯甲烷溶液呈蓝色（无VA）。

浓缩：

将醚液经过无水硫酸钠滤入锥形瓶，再用约25ml乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入锥形瓶内，用水浴蒸馏，回收乙醚。

待瓶中剩约5ml乙醚时取下，减压蒸干，立即加入一定量三氯甲烷（约5ml）使VA含量在适宜的浓度范围内（3～5μg/ml）。

b.研磨法：

适用于每克样品VA含量大于5～10μg样品的测定，如动物肝脏。

步骤简单、省时，结果准确。

研磨：

精确称样2～5g，放入盛有3～5倍样品质量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。

提取：

将均质化的样品移入带盖的锥形瓶，准确加入50～100ml乙醚。

紧压盖子，用力振摇2min，静置澄清（大约需1～2h），或离心澄清（因乙醚易燃、易挥发，气温高时应在冷水浴中操作）。

浓缩：

取澄清乙醚液2～5ml放入比色管这抽气蒸干，立即加入1ml三氯甲烷溶解残渣。

②标准曲线的制备

准确取VA标液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml于6个10ml容量瓶中，用三氯甲烷配制标准系列。

再取6个比色管顺次移入标准系列各1ml，各管加入1滴乙酸酐，制成标准比色系列。

于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将标准比色管序列按顺序移入光路前，迅速加入9ml三氯化锑－三氯甲烷溶液，于6s内测定吸光度，以吸光度为纵坐标，VA含量为横坐标，绘制标准曲线。

③样品测定

取两个比色管，分别加入1ml三氯甲烷（样品空白液）和1ml样品液，各加1滴乙酸酐。

其余步骤同标准曲线的制备。

分别测定样品空白液和样品溶液的吸光度，从标准曲线中查得相应的VA含量。

（4）结果计算。

计算公式如下：

式中，X－VA含量，mg/100g；

C－由标准曲线上查得样品溶液中VA含量，μg/ml；

C0－由标准曲线上查得样品空白液中VA含量，μg/m；

W－样品质量，g；

V－样品提取后加入三氯甲烷定容的体积，ml；

100/1000－样品中VA由μg/g折算成mg/100g的折算系数①。

【知识拓展】

三氯化锑比色法的适用范围及特点：

a.本法适用于维生素Ａ含量较高的各种样品（高于5～10μg/g），对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰，不易比色测定；

b.该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差。

比色测定必须在6s内完成，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。

三氯化锑比色法测定VA含量时需要说明的问题及注意事项如下：

a.维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光；

b.三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成

白色沉淀．因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗；

c.如果样品中含有β－胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮－己烷混合液为洗脱液进行柱层析。

d.所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会出现沉淀，干扰比色沉淀。

故在每1ml氯仿中应加入乙酸酐1滴，以保证脱水。

2、VD的测定－三氯化锑比色法

（1）原理。

在氯仿溶液中，VD与三氯化锑结合生成一种橙黄色化合物，此化合物在620nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与VD的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。

（2）试剂。

①25％三氯化锑－三氯甲烷溶液；

②三氯化锑－三氯甲烷－乙酰氯溶液：

在试剂①中加入为其体积3％的乙酰氯，摇匀；

③无水乙醚（不含过氧化物）；

④无水乙醇（不得含有醛类物质）；

⑤石油醚（沸程30～60℃）：

重蒸；

⑥VD标液：

取0.25g维生素D2，用三氯甲烷定容至100ml，此液浓度为2.5mg/ml，临用时用三氯甲烷配制成0.025～2.5μg/ml的标准使用液；

⑦聚乙二醇（PEG）600；

⑧白色硅藻土：

Celite545（柱层析载体）；

⑨氨水；无水硫酸钠；中性氧化铝；

⑩0.5mol/L氢氧化钾。

（3）操作方法。

操作流程如下：

（4）结果计算：

同VA的测定。

【知识拓展】

采用三氯化锑比色法测定VD的含量时，如果样品中有VA共存，样品皂化提取后可用以下方法进行分离纯化：

a.分离柱的制备：

取一支内径为2.2cm，具有活塞和砂芯板的玻璃层析柱。

第一层：

加入1～2g无水硫酸钠，铺平整；

第二层：

称取15gCelite545置于250ml碘量瓶中，加入80ml石油醚，振摇2min，再加入10ml聚乙二醇600，剧烈振摇10min，使其黏合均匀，然后倾入层析柱内；

第三层：

加5g中性氧化铝；

第四层：

加入2～4g无水硫酸钠。

轻轻地转动层析柱，使第二层的高度保持在12cm左右。

b.纯化：

先用30～50ml石油醚淋洗分离柱，然后将样品提取液倒入柱内，再用石油醚淋洗。

弃去初收集的10ml淋洗液，再用200ml容量瓶收集淋洗液至刻度。

淋洗速度保持2～

3ml/min；

将淋洗液移入500ml分液漏斗，每次加100～150ml水，洗涤3次，弃去水层（去除残留的聚乙二醇，以免与三氯化锑形成混浊物，影响比色）；

将上述石油醚层通过无水硫酸钠脱水后，置于浓缩器中减压浓缩至干，或在水浴上用水泵减压抽干，立即加入5ml三氯甲烷溶解备用。

3、VE的测定－比色法

（1）原理。

维生素E能将高价铁离子还原为铁离子，低价铁离子与联氮苯发生颜色反应，可以进行比色测定。

（2）试剂。

①无水乙醚（不含过氧化物）；

②无水乙醇（不得含有醛类物质）；

③2％的氢氧化钾；

④2mol/L氢氧化钾甲醇溶液；

⑤0.5％α，α′－联吡啶无水乙醇溶液；

⑥0.2％三氯化铁无水乙醇溶液，临用前现配；

⑦吸附剂FloridinXS：

在50g吸附剂中加入100ml盐酸，置沸水浴上1h，放置冷却至室温，倾出酸液。

再加入100ml盐酸，搅拌均匀，30min后弃去酸液，用水洗至中性，然后用乙醇和苯相继洗涤，室温下晾干备用；

⑧VE标准溶液：

取VE标品（α－生育酚醋酸酯纯品），用无水乙醇溶解定容，使其浓度大约为1mg/mL，临用前以紫外

分光光度法分别标定其准确浓度后，再用无水乙醇稀释成浓度为5μg/ml的标准使用液；

⑨甲醇；

（3）操作方法。

操作流程如下：

（4）结果计算。

同VA的测定。

【知识拓展】

采用比色法测定VE的含量时，样品的皂化、纯化操作步骤具体如下：

a.皂化：

取1g脂肪提取液于脂肪瓶中，加入2ml2mol/L氢氧化钾甲醇溶液。

连接回流冷凝管，在氮气流中于72～74℃温度下皂化数分钟。

皂化液用8ml甲醇稀释，并移入分液漏斗，加10ml水。

用乙醚萃取3次，每次30～50ml。

合并乙醚液，用200ml水分3次洗涤，再用2％的氢氧化钾洗涤一次，最后用水洗至中性。

将乙醚提取液经过无水硫酸钠柱子或漏斗脱水，在CO2气流中，减压蒸发至干，再用5ml苯溶解。

b.纯化：

取处理好的吸附剂装满12×30cm的分离柱，用苯润湿。

将上述样液倾入柱中，用苯淋洗至洗出液为25ml。

若柱层上出现微蓝绿色带，系类胡萝卜素；出现暗蓝色带，系VA。

如果没有胡萝卜素存在，可直接用25ml苯溶解残渣。

四、水溶性维生素的测定

【知识拓展】

水溶性维生素B1、B2和C，广泛存在于动植物组织中，饮食来源充足。

但是由于它们本身的水溶性质，除满足人体生理、生化作用外，任何多余量都会从小便中排出。

因此，为避免耗尽，需要经常地由饮食来提供。

水溶性维生素的特点如下：

a.水溶性维生素都易溶于水，而不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂；

b.在酸性介质中很稳定，既使加热也不容易被破坏；但在碱性介质中不稳定，易于分解，特别是在碱性条件下加热，大部或全部可被破坏；

c.易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响；

d.维生素B2对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；

e.维生素C对氧、铜离子敏感，易被氧化。

根据水溶性维生素的性质特点，测定水溶性维生素时，一般都在酸性溶液中进行前处理。

1、VC（抗坏血酸）的测定

测定VC常用的方法有靛酚滴定法、苯肼比色法、荧光法及高效液相色谱法、极谱法等。

其中靛酚滴定法测定的是还原型抗坏血酸。

该法简便、灵敏，但特异性较差，对深色样液滴定终点不易判断。

苯肼比色法测定的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。

该法操作复杂，特异性较差。

荧光法测定的是抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。

该法操作较复杂，但准确度较高，重现性好。

高效液相色谱法准确度高，重现性好，灵敏、简便、快速。

（1）2,6—二氯靛酚滴定法。

①原理：

还原型抗坏血酸可以还原染料2,6－二氯靛酚。

该染料在酸性溶液中呈粉红色（在中性或碱性溶液中呈蓝色），被还原后颜色消失。

还原型抗坏血酸还原染料后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。

在没有杂质干扰时，一定量的样品提取液还原标准染料液的量，与样品中抗杯血酸含量成正比。

②试剂

a.2%草酸溶液；1%草酸溶液；

b.抗坏血酸标准溶液：

准确称取20mg分析纯抗坏血酸溶

于1%草酸溶液中，移入100mL容量瓶，用1%草酸溶液稀释至刻度，摇匀，于冰箱中保存。

使用时用1%草酸溶液稀释10倍。

此标准使用液相当0.02mg/mL维生素C；

c.2,6－二氯靛酚溶液：

称取2,6－二氯靛酚50mg，溶解并稀释至250mL，此液应贮于棕色瓶中并冷藏；

d.0.1mol/L碘酸钾溶液：

精确称取干燥的碘酸钾0.3567g，用水溶解并定容于100mL容量瓶，混匀；

e.0.001mol/L碘酸钾溶液：

吸取0.1mol/L碘酸钾溶液1mL，用水稀释至100mL（此溶液相当于抗坏血酸0.088mg/mL）；

f.1%淀粉溶液；

g.6%碘化钾溶液。

③操作方法。

操作流程如下：

④结果计算。

计算公式如下：

式中，X－样品中抗坏血酸含量，mg/100g；

V－滴定样液时消耗染料的体积，ml；

V0－滴定空白时消耗染料的体积，ml；

T－1ml染料溶液相当于抗坏血酸标准容易的量，mg/ml；

W－滴定时所取滤液中含有样品的质量，g。

【知识拓展】

2,6－二氯靛酚滴定法测定抗坏血酸时需要说明的问题及注意事项如下：

a.样品处理过程若打碎的浆泡沫过多，在稀释时可加辛醇数滴，使去掉泡沫；

b.滴定开始时，染料要迅速加入，直至红色不立即消失，而后逐滴加入，并不断摇动锥形瓶直至终点，整个滴定过程不宜超过2min；

c.样品中可能有其它杂质也能还原染料，但速度较抗坏血酸慢，所以滴定以30秒粉红色不退为终点；

d.若滤液颜色很深，终点不易辨别，可用白陶土脱色后再滴定，但应选择脱色力强而对抗坏血酸无损失的白陶土。

有的资料介绍用试样滤液来滴定染料溶液至红色为终点（此种方法标定染料时也应用标准抗坏血酸溶液滴定染料液）；

e.分析新鲜果蔬时，用1%草酸不能使酶失去活力，不能稳定抗坏血酸，故用2%草酸。

（2）2,4—二硝基苯肼比色法。

①原理：

总抗坏血酸包括还原型、脱氢型抗坏血酸和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2,4–二硝基苯肼作用生成红色脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量呈正比，可进行比色定量。

②试剂：

a.4.5mol/L硫酸：

量取250ml浓硫酸小心加入700ml水中，冷却后用水稀释至1000ml；

b.85%硫酸；

c.2%2，4–二硝基苯肼：

取2,4–二硝基苯肼2g于100ml

4.5mol/L硫酸中，过滤（不用时存于冰箱内，每次使用前必须过滤）；

d.2%草酸溶液；

e.1%草酸溶液；

f.1%硫脲溶液：

溶解1g硫脲于100ml1%草酸溶液中；

g.2%硫脲溶液：

溶解2g硫脲于100ml1%草酸溶液中；

h.1mol/L盐酸：

取100ml盐酸，加入水中，并稀释至1200ml；

i.抗坏血酸标准溶液：

称取100mg纯抗坏血酸溶解于100ml2%草酸溶液中，此溶液每毫升相当于1mg抗坏血酸；

j.活性炭：

将100g活性炭加到750ml1mol/L盐酸中，回流1h~2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子（Fe3+）为止，然后置于110℃烘箱中烘干。

③操作方法：

操作流程如下。

④结果计算：

计算公式如下：

式中，X－样品中总抗坏血酸含量，mg/100g；

C－由标准曲线查得“样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度，μg/mL；

V－试样用1％草酸溶液定容的体积，ml；

F－样品氧化处理过程中的稀释倍数；

W－试样质量，g。

【知识拓展】

采用2,4—二硝基苯肼比色法测定总抗坏血酸含量时，其标准曲线绘制的具体操作步骤如下：

a.加2g活性炭于50ml标准溶液中，振动1min后过滤；

b.吸取10ml滤液放入500ml容量瓶中加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。

抗坏血酸浓度20μg/mL；

c.吸取5，10，20，25，40，50，60ml稀释液，分别放人7个100ml容量瓶中，用10%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的深度分别为1，2，4，5，8，10，12μg/mL；

d.分别吸取4ml各不同浓度的上述抗坏血酸标准使用液于7个试管中，吸取4ml水于试剂空白管，各加入1ml2%2,4–二硝基苯肼溶液，混匀，将全部试管放入37℃±5℃恒温箱或恒温水浴中，保温3h后将8个试管取出，全部放入冰水冷却后，向每一试管中加入5ml85%硫酸，滴加时间至少需要1min，边加边摇，。

将试管自冰水取出，在室温放置30min后，以试剂空白管调零，比色测定；

e.以吸光度值为纵坐标，以抗坏血酸浓度（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线。

【知识拓展】

2,4－二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸时需要说明的问题及注意事项如下：

a.本法为国家标准方法，适用于蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸的测定；

b.活性炭对抗坏血酸的氧化作用，是基于其表面吸附的氧进行界面反应，加入量过低，氧化不充分，测定结果偏低；加入量过高，对抗坏血酸有吸附作用，使测定结果也偏低；

c.硫脲的作用在于防止抗坏血酸的继续被氧化和有助于脎的形成。

2、VB1的测定

测定VB1常用的测定方法有比色法、荧光法和高效液相色谱法。

比色法：

灵敏度低、准确度差，适用于VB1含量高的样品；

荧光法和高效液相色谱法：

灵敏度较高、准确度好，适用于微量测定，是目前测定的主要方法。

荧光法使用原理及方法如下：

①原理：

硫胺素在碱性高铁氰化钾溶液中，能被氧化成蓝色荧光化合物－硫色素。

若不存在其他荧光物质干扰，荧光强度与硫色素含量成正比，即与溶液中硫胺素含量成正比。

如样品中所含杂质较多，应经离子交换剂处理，使硫胺素与杂质分离，然后测定纯化液中硫胺素的含量。

②仪器、试剂及具体操作方法：

详见GB/T5009.84—2003。