湘江四环素及抗性基因含量特征及其季节变化.docx

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湘江四环素及抗性基因含量特征及其季节变化

湘江四环素及抗性基因含量特征及其季节变化

　　摘要：

采用高效液相色谱质谱法分析了湘江长沙河段水体及底泥中4种常见四环素类抗生素的含量特征及其季节变化，并采用实时荧光定量PCR研究了该水域相应的5种代表性抗生素抗性基因（tetA，tetC，tetG，tetM和tetX）的存在及丰度.结果表明，水体中四环素类抗生素的质量浓度均值在16.23～496.73ng?

L-1之间，底泥中四环素类抗生素的质量分数为347.77～3829.75ng?

kg-1，易受季节变化影响.5种目标抗性基因在所有样品中均有检出，其中tetA和tetC的绝对拷贝数及相对丰度较高，为湘江长沙河段的优势抗性基因.相关性分析表明：

冬季水体中的tetA和tetC含量与底泥中的含量显著相关，几种目标抗生素与抗性基因之间并不存在明显线性关系.

　　关键词：

基因；湘江；四环素抗生素

　　中图分类号：

X172文献标识码：

A

　　Abstract：

Thispaperadoptedhighperformanceliquidchromatographymassspectrograph（HPLCMS）toinvestigatetheoccurrenceandseasonalchangesoftetracyclineantibioticsintheXiangRiveranditssediments.Fiverepresentativeantibioticresistancegenes（tetA，tetC，tetG，tetM，tetX）inwaterandsedimentsampleswerequantifiedwithrealtimePCR.Theconcentrationsoftetracyclineshowedsensitiveseasonalchanges，rangingfrom16.23ng?

L-1to496.73ng?

L-1inthewatersamples，andfrom347.77ng?

kg-1to3829.75n?

kg-1inthesedimentsamples，respectively.Thetargetresistancegenesweredetectedinallsamples.Comparedwithotherresistancegenes，tetAandtetCwerehigherinabsolutecopynumberandrelativeabundance，suggestingthatthetetAandtetCweredominantintheXiangRiver.StatisticalanalysisindicatedapositivecorrelationbetweentherelativeabundanceoftetAandtetCinthewatersamplesandthesedimentsamplesinwinter.Therewasnolinearlyrelationshipbetweenantibioticsandresistancegenes.

　　Keywords：

genes；theXiangRiver；tetracycline

　　近年来，抗生素及抗生素抗性基因（AntibioticsResistanceGenes，ARGs）污染已经成为日益严峻的全球性环境问题[1-2].

　　四环素类抗生素具有广谱性、质优价廉等优点，是目前应用最广泛用量最大的抗生素种类之一[3].该类抗生素对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和衣原体等微生物发挥作用，具有广谱抗菌性和良好的治疗效果.四环素类抗生素主要包括四环素（Tetracyline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）、金霉素（Chlortetracycline，CTC）和强力霉素（Doxycycline，DOX）等，这些抗生素不仅广泛应用于医疗，还作为兽药大量用于畜禽养殖业和水产养殖业[4].中国是四环素类抗生素生产、销售和使用的大国，年出口量高达1.34×107kg.湘江是长江七大支流之一，也是长沙市饮用水的主要来源.湘江长沙河段周边居民超过700万，周边畜禽养殖场和医疗机构密集，在医疗及养殖业中均普遍存在大量使用抗生素的问题.2009年仅长沙主城区共有72个主要排污口，每天至少将20万吨生活污水、医药废水、养殖废水和工业废水直接排入湘江及其支流，导致湘江水质不断恶化，严重影响了市民健康与经济的发展.但截至目前为止，关于湘江流域水体和底泥中抗生素及ARGs污染特征的研究还未见报道.因此，亟待开展湘江水体及底泥中抗生素含量及ARGs丰度的调查，以反映湘江抗生素及ARGs的污染现状.本研究选取了湘江长沙河段上游至下游10个采样点，分别采用高效液相色谱质谱法和实时荧光定量PCR法对湘江长沙河段流域及其支流水体和底泥中4种四环素类抗生素（TC，OTC，CTC和DOX）和5种典型ARGs（tetA，tetC，tetG，tetM和tetX）进行分析研究.此外，还探讨了ARGs和抗生素浓度之间的关系，以期为阐明中国水环境四环素类抗生素及ARGs的环境状况提供科学依据.

　　1材料与方法

　　1.1样品采集

　　本研究采集了湘江长沙河段及其主要支流的江水和底泥样本.从上游至下游共设10个采样点，距离城市污水处理厂、医院农业灌溉区和养鱼场等区域10～20km，编号分别为S1～S7（湘江）和T1～T3（湘江主要支流），采样点分布如图1所示.在每个采样点及采样点上下游50m处分别采集2.5L距河面约0.5m深处的水样，100g河流底泥，然后将3个水样和底泥样品分别混合，水样装入棕色灭菌玻璃瓶中于4℃条件下保存，河流底泥样品装入无菌密实袋中于-18℃条件下保存.　　1.2四环素类抗生素检测

　　所有水样通过0.45μm滤膜（Waters公司）后，按1000mL水加入0.5mgNa2EDTA，加入盐酸调pH至3.0.取经过预处理的样品提取液各10mL经5mL甲醇和5mL水活化的OasisHLB进行固相萃取富集后，依次用5mL水和5mLV甲醇∶V水=5∶95溶液淋洗.减压抽干5min，最后用10mLV甲醇∶V乙酸乙酯=10∶90溶液洗脱.将洗脱液在40℃吹氮、浓缩至干，用1mL标准溶液溶解残渣，过0.45μm滤膜，供高效液相色谱质谱仪测定.

　　将底泥样品冷冻干燥后破碎至0.30mm粒径，称取4g放入锥心瓶中，加入20mLEDTAMcllvaine缓冲溶液，振荡30min，取上层提取液.反复提取3次，用0.45μm滤膜过滤，其余操作同水样.

　　选取4种常见四环素类抗生素包括四环素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）和强力霉素（DOX）.依照冀秀玲等[1]报道方法，利用高效液相色谱质谱仪（Agilent1100）检测水样及河流底泥样品中的目标抗生素含量.

　　1.3抗生素抗性基因（ARGs）检测

　　1.3.1DNA提取

　　采用DNA提取试剂盒（TIANGEN，Beijing）提取底泥样品及水样中的DNA.提取的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳验证并用核酸蛋白仪检测其浓度.目的DNA条带单一，A260/280值在1.8～2.0之间，表明提取的DNA纯度较高.

　　1.3.2普通PCR扩增

　　选取16SrDNA和5种四环素类抗性基因tetA，tetC，tetG，tetM和tetX作为目的基因，抗性基因引物设计参考已发表的文献[5].PCR反应体系：

DNA1μL，2×PlusPCRMasterMix（TIANGEN，Beijing）12.5μL，下游引物（25μM）各0.5μL，ddH2O，10.5μL，总体积25μL.PCR反应程序：

95℃5min，然后95℃30s，退火温度30s（表1），72℃45s，循环35次，最后72℃5min.PCR在MyCyclerthermalcycle（BioRad，America）上进行，每组目的基因扩增反应重复3次，每次设置两组无模板阴性对照.

　　1.3.3ARGs定量分析

　　对上述PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，割胶回收、纯化.将目的DNA片段与pGMT载体连接后，转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞.挑选菌落培养.使用高纯度小量质粒提取试剂盒（BioTeke，Beijing）提取质粒.将提取的质粒用核酸蛋白质测定仪（eppendorf）检测含量及浓度.按10倍浓度梯度稀释，绘制标准曲线（r2>0.9900）.定量PCR反应体系：

DNA1μL，2×SYBRrealtimePCRpremixture（BioTeke，Beijing）10μL，下游引物（25μM）各0.5μL，ddH2O8μL，总体积20μL.定量PCR反应程序：

95℃30s，然后95℃10s，退火温度（表1）15s，72℃15s，35个循环，78℃26s.定量PCR在iCyclerIQ5Thermocycler（BioRad，America）上进行，每组目的基因扩增反应重复3次，每次设置两组无模板阴性对照.由样本中目的基因的绝对拷贝数和内参基因16SrDNA绝对拷贝数的比值得到基因相对丰度.基因相对丰度代表的是微生物群落中所含的抗性基因数量，更能反映基因在样本中的分布情况.

　　2结果与讨论

　　2.1抗生素含量水平

　　表2列出了4种四环素类抗生素在湘江长沙河段水体及底泥中的含量.结果显示，无论在夏季（6月）还是冬季（12月），湘江长沙河段水体及底泥中各种四环素类抗生素（强力霉素除外）均有不同程度检出，说明湘江长沙河段流域已广泛受到四环素类抗生素的污染.底泥样品中四环素类抗生素质量分数均值为347.77～3829.75ng?

kg-1，远高于水体中抗生素质量浓度均值16.23～496.73ng?

L-1，与之前报道的黄浦江[6]和海河[7]流域抗生素含量的检测结果类似，表明河流沉积物已经成为四环素类抗生素重要的蓄积池.沈群辉等[6]测得黄浦江底泥样品中抗生素质量浓度均值为江水中的15～130倍；Zhou等[8]在海河底泥中检测到高浓度四环素含量，Luo等[7]却发现海河水体中四环素含量低于检测下限.水体环境中四环素类药物检出率和检测水平较底泥低，可能是由于四环素类药物在土壤、黏粒，包括沉积物中都有很强的吸附性，易在河流底泥中蓄积[9].本研究中，湘江长沙河段水体及底泥中四环素和土霉素的检出率达到100%，远高于其他国家和地区的检出率[10-11]，这在一定程度上反映了湘江长沙河段周边区域四环素类抗生素的大量使用和排放.从表2可以看出，湘江长沙河段水体中冬季的四环素类抗生素质量浓度明显高于夏季.12月水体中的四环素平均质量浓度为412.65ng?

L-1，约为6月份的25倍；12月水体中土霉素质量浓度均值为496.73ng?

L-1，约为6月的16倍；12月水体中金霉素平均质量浓度为23.55ng?

L-1，但是6月水体中没有检测到金霉素.湘江长沙河段冬季水体中四环素类抗生素含量明显高于夏季，可能是由以下几个原因引起：

一是冬季是湘江的枯水期，江水水量小，流速慢，抗生素被水流稀释的速率减慢导致水体中抗生素浓度增大；二是冬季是感冒等疾病的多发季节，人畜抗生素用量也随之