利胆排石片中大黄素大黄酚含量测定的不确定评定毕业论文.docx
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利胆排石片中大黄素大黄酚含量测定的不确定评定毕业论文
题目（中文）：
利胆排石片中大黄素、大黄酚含量测定的不确定评定
（外文）：
UncertaintymeasurementinthecontentdeterminationofEmodinandRhubarbphenolinLIdanpaishitablet
院（系）：
药学院
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日期：
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日期：
年月日
目录
1.前言………………………………………………………………………………1
2.文献综述…………………………………………………………………………3
3.实验部分……………………………………………………………………………5
4.不确定度的评定……………………………………………………………………5
5.研究结果及讨论……………………………………………………………………5
6.结术语……………………………………………………………………………5
7.致谢…………………………………………………………………………………5
8.参考文献……………………………………………………………………………5
利胆排石片中大黄素和大黄酚含量测定的不确定度评定
专业：
药学班级：
07级药学1班作者：
黄芳指导老师：
吴杰连
摘要：
目的：
对HPLC法测定利胆排石片中的大黄素和大黄酚的含量的不确定度进行分析，找出影响不确定度的因素。
方法：
采用HPLC法测定大黄素和大黄酚的含量，并根据《测量不确定度评定与表示》（JFL059—1999）中有关规定评估其不确定度。
结果:
不确定度评估大黄素为0.002%、大黄酚为0.0015%。
结论：
严格按照操作规范，尽可能减少稀释过程影响，可有效降低引入的不确定度，保证测定结果准确。
关键词：
利胆排石片；大黄素；大黄酚；高效液相色谱；测量不确定度
应为题目
Abstract:
objective:
UncertaintymeasurementinthecontentdeterminationofEmodinandRhubarb
phenolinLIdanpaishitabletbyHPLC,findouttheinfluentialfactorsofuncertainty.Methods:
todeterminatethecontentofemodinandrhubarbphenolbyusingreveed-phaseHPLC,accordingtorelevantprovisionsin"theassessmentandexpressionofuncertaintyinmeasurement"（JFL059-1999）andevaluatetheuncertainty.Results:
theuncertaintyevaluationofemodinis0.002%,rhubarbphenolicis0.0015%.Conclusion:
operateStrictlyaccordingtothestandardsoastoreducetheeffectionofdilutionprocess,whichcanreduceeffectivelytheintroduceduncertaintyandguaranteetheaccuracyofmeasurementresults
Keywords:
LIDANPAISHIPIAN,Emodin,Rhubarbphenol,HPLC,Measurementuncertainty
一．前言
利胆排石片收载于《中华人民共和国药典》中．处方由大黄、金钱草等10味中药材组成，具有清热利湿，利胆排石等功效，临床上用于湿热蕴毒、腑气不通所致的胁痛、胆胀，症见胁肋胀痛、发热、尿黄、大便不通；胆囊炎、胆石症见上述证候者[1]。
处方中大黄的主要有效成分是葸醌衍生物。
具有破气除胀。
消积导滞。
和胃利胆等药效[2]。
本文建立了同时测定利胆排石片中大黄索和大黄酚2种蒽醌类化合物含量测定的HPLC法，为利胆排石片的质量控制提供参考依据，建立HPLC测定法的不确定度评定方式.
2．综述
大黄素（Emodin）是一种羟基蒽醌类的衍生物，主要来源于蓼科植物掌叶大黄根茎，是中药大黄的主要有效单体，其化学名称为1，3，8-三羟基-6-甲基蒽醌（1，3，8一trihydroxy-6-methyl-anthraquinone），其是分布最广泛的一种蒽醌类物质，从许多霉菌、地衣、高等植物及昆虫中均有发现[3]，广泛存在于大黄的根茎、鼠李的树皮和根皮、决明的种子中。
大黄酚（chrysophan01）是蓼科（Polygonaceae）植物大黄体内的次生代谢物质，属游离蒽醌类化合物[4]。
为大黄的有效成分之一，其化学名为l，8一二羟基-3甲基蒽醌（1,8-dihydroxy-3methylanthraquinone），主要来源于蓼科植物掌叶大黄根,巴天酸模根,齿果酸模根,叶望洒南嫩根,种子,百合科植物黄金萱根,根茎。
测量不确定度是表征合理赋予测量的分散性与测量结果相关联的参数[5]。
测量结果的可靠性很大程度取决于其不确定度的大小，不确定度越小，说明测量水平越高，测量结果使用价值越大。
本文根据（测量不确定度评定与表示）（JJF1059-1999）有关规定，对利胆排石片中用HPLC法测定大黄素和大黄酚含量的测量不确定度进行了分析，以期找出影响不确定度的因素，对不确定度进行评估。
2.1大黄素
2.1.1大黄素的结构及性质
1．1.1结构大黄素是由八个醋酸单位生物合成而来的[3]，结果见下图
1．1.2物理性质橙色针状晶体，熔点256～257℃；不溶于水，能溶于乙醇，稍溶于乙醚、氯仿、苯，溶于苛性碱水溶液、碳酸钠溶液或氨溶液中并显樱红色。
2.1.2药理作用
1．2.1抑制胰酶作用
大黄素能抑制胰酶的分泌,对与急性胰腺炎发病直接有关的5种胰酶（胰蛋白酶、胰弹性蛋白酶、胰糜蛋白酶、胰激肽释放酶和胰脂肪酶）具有明显的抑制作用[6]
1.2.2抗氧化及清除氧自由基的作用
大黄素还具有清除氧自由基的作用。
大黄素对大鼠的脑匀浆脂质过氧化引起的极弱化学发光均有猝灭作用，构效关系提示大黄素邻位和中位羟基取代是该类物质抗氧化所必需的[7]。
1.2.3肝保护作用
展玉涛等[8]给大鼠皮下注射质量分数为40%CCl4制备肝纤维化模型,并以小、中和大剂量大黄
素治疗，通过放射免疫法测定大鼠血清透明质酸，结果显示大黄素组血清透明质酸明显低于模型组，认为大黄素能降低肝纤维化大鼠血清透明质酸[8]。
大黄素能减轻CCl4对肝细胞的损伤，对大鼠肝纤维化有治疗作用[9,10]。
1.2.4对循环系统的作用
大黄素对多种血管有舒张作用,能抑制5-羟色胺对血管的收缩作用,协同乙酰胆碱的舒张作用,其舒张作用与自由基或氢过氧化及cGMP增加有关。
大黄素还可抑制血小板聚集，改善微循环，降低血液粘度[11]。
1.2.5抗癌作用
大黄素能增强抗癌药物5-氟尿嘧啶、丝裂霉素和氨甲蝶呤对人肝癌BEL-7402细胞的细胞毒作用，并能部分逆转人乳腺癌细胞MCF-7/Adr:
对阿霉素的抗药性[12]。
2.2大黄酚
2．1物理性质
六方形或单斜形结晶（乙醇或苯）,熔点196°,升华。
几乎不溶于水,略微溶于冷醇,易溶于沸乙醇,溶于苯、氯仿、乙醚、冰醋酸及丙酮等,极微溶于石油醚。
橙黄色片状体,熔点198°。
2.2药理作用
作为大黄的有效成分之一的大黄酚，其药理作用的文献报道却很少，仅限于传统的抗菌、泻下、止血等方面。
大黄酚具有抗菌、缩短血液凝固时间、兴奋神经、麻痹肌肉、止咳、利尿、抗癌作用，特别是近年来研究表明，大黄酚能延缓衰老，能清除氧自由基，增强抗氧化能力和改善学习记忆障碍等作用[13]。
但是大黄酚具有味苦、难溶于水、理化性质不稳定，遇光易氧化，对胃有一定的刺激性等不利因素。
2.3大黄素、大黄酚的含量测定方法研究进展
测定方法有极谱法、紫外分光光度法、纸层析一分光光度法、薄层层析一分光光度法、比色法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、纸色谱法、荧光法等[14]。
3．1高效液相色谱法赵仁邦利用高效液相色谱法准确测定了何首乌中大黄酸、大黄素、大黄素甲醚的含量[15]。
其采用了70％甲醇超声提取浓缩后，用氯仿萃取分离出游离和结合
型的蒽醌，得到定量用试液。
在439nm检测波长下，以甲醇：
异丙醇：
水=80：
10：
lO（磷酸调节pH为3．0）为流动相，C18为固定相，采用HPLC法测定各种成分的含量。
经过实验证明，该方法较传统的比色法等精密度更高，结果更准确可靠，产品的回收率高。
．
3．2分光光度法孙小梅等[16]对大黄素的分光光度测定及其应用进行了研究。
结果证明了光度法成相容易，分相迅速，操作简便，盐用量低，无毒性并且能得到高纯度的产品---大黄素，实际应用前景广阔。
实验还发现，大黄素在NaOH溶液中的平衡是可逆的，溶液中pH的变化，导致共轭环上一OH的离解。
当NaOH过量时，大黄素结构中蒽醌上3个羟基完全质子化，加上共轭环上有甲基的推电子作用，共轭体系内电子云流动增加。
电子跃迁所需能量降低，吸收光谱红移，而且最大吸收波长稳定在530nm。
当提高酸度，一0一得质子，溶液又恢复至黄色，反应前后，大黄素结构未发生变化。
根据这一原理建立了一种光度分析大黄素的新方法--Tween80一（NH4）2S04液一固萃取体系。
3．3高效薄层光密度法库尔班江[17]在硅胶高效薄层色谱板上利用高效薄层光密度法测定了牛黄解毒丸中大黄素的含量。
其经过硅胶薄层层析在展开剂甲苯一乙酸乙酯一甲酸（15：
2：
1）下，可以使大黄素斑点清晰完整，与其他成分的斑点分辨显著，并且在甲醇一氯仿（1：
1）混合溶剂中得到游离的大黄素。
结果证明该方法具有简便、快速，重现性好，回收率高，
高效薄层色板板间误差小，精密度高，测定结果准确可靠的优点。
3．4反相高效液相色谱法张丹等[18]利用反相高效液相色谱法测定了大黄药材中游离及结合型蒽醌类衍生物的含量。
其采用的色谱条件为：
色谱柱HypersilC18柱（250mm*4．6mmi．d．，10μm），流动相为甲醇一乙腈一水（3：
5：
2，磷酸调pH2．8），流速为1．0ml／min，柱温为25℃，检测波长为225nm。
经过实验证明此种方法简便、快速、准确，可以用于大黄药材及
其制剂的质量评定。
但是对于其他的药材是否适用，还需要进一步验证。
2.4.不确定度分析
4.1不确定度来源
在实际工作中，结果的不确定度有许多来源，如定义不完整、取样、基体效应和干扰、环境条件、质量和仪器不确定度、参考值、测量方法和程序中的估计和假定，以及随机变化。
刘永利等[20]对复方丹参片中HPLC法测定丹参酮含量的测量不确定度进行了分析，影响不确定度的因素主要为样品不均匀性，并提出在分析测定时应加以严格控制，可以采取合理的取样方式、将样品研细过筛来控制。
饶毅等[21]对HPLC法测定大豆异黄酮的不确定度评定中指出不确定的主要影响因素是稀释过程中带来的不确定度，可以采用较大容器来配制溶液来控制。
陈建琴[22]对HPLC法测定苯巴比妥东莨菪碱片含量的测量不确定度评价中指出测量结果的不确定度主要来源于仪器进样重复性，因此在实验中应严格规范操作，控制好对测定有最大影响的不确定度分量。
胡震[23]等采用HPLC-DAD方法同时测定了重要栀子中栀子苷，藏红花素及绿原酸三种主要成分的含量，并对测定结果进行不确定度评定，指出样品的均匀性，分析方法的精密度和准确性对测试结果影响最大。
因此提出在样品浓度校正要稳定，在检测限内进行检测。
范能全，彭兰[24]对HPLC法测定青霉素V钾片含量的不确定评价中对各个不确定度分量进行量化，提出了该法的合成不确定度评估结果，指出称样量是测定结果的最主要影响因素。
4.2不确定度的分量[19]
不确定度可分为标准不确定度、合成不确定度、扩展不确定度。
其中标准不确定度是指以标准差表示的测量不确定度。
合成标准不确定度是指当测量结果是由若干个其他量的值求得时，按其他各量的方差或（和）协方差算得的标准不确定度。
扩展不确定度是指确定测量结果区间的量，合理赋予被测量之值分布的大部分可望含于此区间。
4.3不确定度的评定方法[19]
不确定度的评定方法可分为A类评定方法和B类评定方法。
4.4测量不确定度评定程序[19]
建立评定模型（测量数学模型），标准不确定度的A类评定，标准不确定度的B类评定，合成标准不确定度的确定，扩展不确定度的确定，报告不确定度。
测量不确定度的评估过程如下：
第一步：
规定被测量，第二步：
识别不确定度的来源，第三步：
不确定度分量的量化，第四步：
计算合成不确定度
三3、实验部分
3.1主要仪器与试剂
实验仪器：
液相色谱仪：
安捷伦高效液相色谱系统，填料：
SinochromODS-BP（4.6×200nm,5um）,
CP225D型电子天平（德国Sartorius公司，分度值为0．01mg）。
大黄素、大黄酚对照品（批号分别为518-82-1、481-74-3，中国药品生物制品检定所）
利胆排石片供试品：
河南广宇博科生物制药有限公司
批号：
国药准字Z41021088
甲醇为色谱纯，水为超纯水，磷酸，三氯甲烷其他试剂均为分析纯。
3.2方法与结果
3.2.1色谱条件以及确定
刘意[25]HPLC法同时测定利胆排石片中4种蒽醌类成分的含量,其中以色谱柱为依利特SinoChromODS-BP柱（4．6mm×200mm，5μm），流动相为甲醇：
0．1％磷酸溶液（80：
20,v／v），流速为1．0mL·min-1，检测波长为254nm，柱温为室温。
进样量为10μl。
精密度实验大黄素RSD=1.3％,大黄酚RSD=1.1％，重现性试验大黄素RSD=1.2％，大黄酚RSD=0.6，回收率平均率大黄素RSD=1.3％,大黄酚RSD=100.4%,大黄酚RSD=100.0%,该法操作简便易行，快速、灵敏。
刘善新[26]HPLC法测定复方大黄利胆片中大黄素、大黄酚的含量,其中以：
LichmspherCl8柱（4．6mm*150mm5μm）为色谱柱）,流动相：
甲醇:
0．1％磷酸溶液（85：
15），流速：
1mL·min-1，检测波长254nm，柱温30℃。
理论塔板数按大黄素峰计算不低于3000。
在（0.0412～0.2060）μg范围内线性关系良好，平均回收率为97．17％．RSD为1．03％，大黄酚在（O．08176～0.4088）μg范围内线性关系良好，平均回收率为97．37％，RSD为1．28％。
该方法简便、准确、重复性好，可作为该制剂含量测定方法。
3.2.2溶液的制备
2.2.1对照品溶液的制备：
分别精密称取大黄素对照品2．22mg和大黄酚对照品1.95mg置10mL量瓶中，加三氯甲烷1mL，振摇使溶解，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得大黄素对照品储备液和大黄酚对照品储备液。
分别取大黄素、大黄酚对照品储备液各1mL，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品储备液，大黄素和大黄酚的浓度分别为22.2μg·ml-1、19.5μg·ml-1。
2．2．2供试品溶液的制备：
取本品粉末适量，精密称定为0．1536g,置25mL量瓶中，精密加入甲醇25mL，超声30min，放冷，再用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过。
精密量取续滤液5mL，置蒸发皿中，挥去溶剂，加8％的盐酸溶液10mL，超声处理5min，再加三氯甲烷10mL，置分液漏斗中。
用少量三氯甲烷洗涤容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷层，酸液再用三氯甲烷提取2次．每次10mL．合并三氯甲烷液，减压回收溶剂至干。
残渣加三氯甲烷1mL使溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
3.2.3线性关系考察
精密吸取对照品1.0μL,2.5μL,5.0μL,7.5μL,10.0μL，12.5μl分别进样，得不同体积对应的峰面积。
以体积V为横坐标，峰面积A为纵坐标。
用Excel做图，得大黄素回归曲线方程为：
A=93.418V-5.5528,R=1，大黄酚回归曲线方程为：
A=70.732V-2.6695，R=1。
3.2.4精密度试验
取同一浓度对照品溶液，在上述色谱条件下。
重复进样6次，计算大黄素和大黄酚的色谱峰面积的RSD分别为1.57%和1.90%，结果表明，仪器精密度良好。
3.2.5供试品含量测定
用进样针取供试品溶液10μL，测得其大黄素的峰面积为17.9代入回归曲线方程中，得到其相应的体积为0.25μL，相当于在10μl进样量里有对照品溶液0.25μL，换算成质量为0.032mg，大黄素在利胆排石片中的含量为0.021﹪。
测得大黄酚的峰面积为14.4代入回归曲线方程中，得到其相应的体积为0.24μL，相当于在10μl进样量里有对照品溶液0.24μL，换算成质量为0.020mg，大黄素在利胆排石片中的含量为0.016﹪。
图1大黄素标准曲线
图2大黄酚标准曲线
表1大黄素、大黄酚混合对照品线性考察取的体积与峰面积情况
序号
1
2
3
4
5
6
X体积（μl）
1
2．5
5
7.5
10
12.5
Y峰面积（A）
大黄素
89.4
228.4
460.5
692.9
926.9
1165.7
大黄酚
68.5
173.9
351.2
527.6
703.9
881.7
表2精密度考察项混合对照品大黄素、大黄酚测定峰面积情况
序号
1
2
3
4
5
6
Y峰面积（A）
大黄素
925.6
921.6
924.7
925.2
924.3
926.7
大黄酚
705.8
706.6
707.9
707.8
706.1
702.2
图3大黄素、大黄酚混合对照品HPLC图
图4供试品HPLC图
3.2.6重复性试验
取同一厂家的样，按“2．2．2”项下方法制备6份供试品溶液，在上述色谱条件下，进样分析，计算大黄素和大黄酚含量的RSD分别为0．69％和0．43％。
结果表明，方法重复性良好。
结果见表3
表3供试品中大黄素、大黄酚含量测定峰面积情况
序号
1
2
3
4
5
6
Y峰面积（A）
大黄素
15.9
16.4
16.6
15.5
17.4
17.3
大黄酚
14.2
14.8
14.7
14.3
14.1
13.7
3.2.7稳定性试验
取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6和8h，在上述色谱条件下，进样分析，计算大黄素和大黄酚色谱峰面积的RSD分别为0.27％、0.19％。
结果表明，样品溶液在8h内稳定。
结果见表4
表4供试品稳定性实验中大黄素、大黄酚含量测定峰面积情况
序号
0
2
4
6
8
Y峰面积（A）
大黄素
17.6
17.3
17.9
17.4
17.1
大黄酚
14.4
14.7
14.9
14.5
14.8
3.2.8加样回收率实验
取已知含量的供试品粉末6份，每份O．075g．精密称定,分别加入低、中、高3个浓度的混合对照品储备液，按“2．2．2”项下方法操作．制备供试品溶液，每个浓度2份，进样分析。
大黄素、大黄酚的平均回收率分别为100．4％（RSD=0．4％）,100．0％（RSD=0．9％）.结果（见表5）。
表5加样回收率试验结果
取样量
/g
样品含量/μg
加入量
/μg
测得量
/μg
回收率
平均回收率/%
RSD
/%
大黄素
0.07201
42.87
90.90
133.9
100.1
100.4
0.4
0.07101
42.27
90.90
133.5
100.4
0.07562
45.01
181.8
134.9
100.6
0.07509
44.70
181.8
225.5
99.7
0.07263
43.23
272.7
316.6
100.6
0.07209
42.91
272.7
317.9
100.8
大黄酚
0.07201
135.8
33.60
169.5
100.3
100.0
0.9
0.07101
133.9
33.60
167.9
101.0
0.07562
142.6
67.20
210.1
100.4
0.07538
142.2
67.20
209.8
100.7
0.07238
136.5
100.8
235.9
98.6
0.07209
136.0
100.8
235.6
98.9
四4、不确定度的评定
依据《测量不确定度评定与表示》（JJF1059-1999）进行不确定度评定。
采用数学模型不确定度X=Mi.As.Vs／Ai.Vi.Ms,其中mi为对照品的质量，As为样品的峰面积，Vs为样品稀释体积，Ai为对照品的峰面积，Vi为对照品的稀释体积，Ms为样品的称样量。
4.1不确定度分量的分析
被测样品的不确定度包括对照品峰面积的不确定度、对照品溶液的不确定度、样品峰面积的不确定度、样品溶液不确定度这4个方面。
其中对照
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