Microarray 入门.docx
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Microarray入门
Microarray入门
导言
MICROARRAY，是固定在固体基片上的大量DAN序列的微阵列，是许多复杂核酸样本中特定DNA序列定性和定量研究的有效工具。
日益引起人们兴趣的MICROARRAY，已经用于基因作图、变异分析和基因表达的检测，并且，有希望成为科学研究和临床应用的标准工具。
从原理上和实践上，基因芯片都是已用于核酸定性、定量研究数十年的杂交方法（Southernblot[12]、Northernblot[13]、克隆杂交和点杂交[14]）的发展：
标记样本，再与阵列杂交；杂交足够的时间后，适当地洗膜数次；然后，探针与固定在特定位置上的样本DNA互补杂交而显现杂交印迹。
用MICROARRAY做平行杂交研究的思想本身并不新鲜，排列在滤膜上的阵列已经被用了很多年[15-17]。
然而，不同领域的技术进步已把那些相当笨拙的膜变成了今天更加实用、有效的平行基因分析的方法：
首先，大规模的测序工程产生的信息使得DNA集合聚集在一起成为可能，而这些DNA相当于许多组织（从细菌到人）中的全部基因或大部分基因；其次，技术进步已经使得生产高密度DNA阵列成为可能，从而使成千上万个基因展现在比标准的载玻片还小的面积上；最后，核酸荧光标记和荧光检测的进步使得这些芯片的应用更加简便、安全和准确。
本综述旨在描述一种微阵列技术的最新用法，通常被称作“点片”或“印片”。
之所以这样称呼是因为该方法是将通常的大于寡核苷酸（100bp以上）的DNA通过物理分配方法点在固体基片上，这与最近其它主流的微阵列技术（短的寡核苷酸被直接合成在固体支持物上[18，19]）方法不同。
在标准的点片操作中，把DNA样本（PCR产物、质粒等）装在96或384孔板中，用一个配有一束特殊设计点样针的机械手伸入板中相邻的样本孔中，吸上大约１µl的DNA样液，分别点在处理过的载玻片上。
通过交叉的方式，用适合96孔板的４根一束针头或384孔板的16根一束针头成功地将数千个DNA样本点在一个玻片面上。
用束状点样针接触每张玻片表面，可同时成功点100-200张具有同样阵列的芯片。
每点完一次后，要清洗、干燥点样针，然后再装载另几个DNA样液。
点完所有的点阵之后要处理玻璃片，使得DNA固定在玻片表面，以最大限度地减少探针非特异性结合在芯片上。
MICROARRAY已被用于很多不同的目的。
通过MICROARRAY，数千个序列能立即被检测出来。
这篇综述着重于基因芯片在基因表达研究中的应用以及在基因组表达检测中的应用原理，并详细描述了MICROARRAY的制作和使用过程。
一、基因表达的检测
基因表达检测的最终技术目标是能确定所关注的任何组织、细胞的RNA的绝对表达量。
可以先从样本中抽提RNA，再标记RNA，然后将这些标记物作探针与芯片杂交，就可得出原始样本中不同RNA的量。
然而用于杂交的某个特定基因的RNA的量与在一个相应杂交反应中的信号强度之间的关系十分复杂，它取决于多种因素，包括标记方法、杂交条件、目的基因的特征和序列。
所以芯片的方法最好用于检验两个或多个样本中的某种RNA的相对表达量。
样本之间某个基因表达的差异性（包括表达的时间、空间特性及受干扰时的改变）是基因表达最重要的，而了解RNA的绝对表达丰度只为进一步的应用或多或少地起一些作用。
双色杂交：
为了最大限度地增加差异显示的可靠性和精确性，我们用两种具有不同光谱的荧光染料标记两种不同样本，然后混合这两种探针，并同时与一张芯片杂交的方法来直接对比这两种样本。
两样本中的一种基因的相对表达量可通过同源目的基因的两种染料的荧光强度的比值检测出来。
这个比值对以上讨论的那些可能影响与某个特定基因杂交探针绝对量，但不影响两种标记探针杂交相对量的因素不敏感。
DNA基因表达谱芯片的应用范围：
最简单的基因表达谱检测是比较两种不同细胞或组织样本中的与芯片阵列中相应基因对应的mRNA的相对丰度。
例如，可对比试验干预前后，或经某种处理后连续时段内的细胞以及不同分化时期的细胞，也可以对比突变型和野生型之间的mRNA表达的不同方式。
这种试验方法灵活，使研究者可以收集到有关每种基因表达调节的更准确信息。
例如，通过一张芯片上的多核糖体RNA和总mRNA的对比杂交，可以测出每个基因的翻译效率；通过细胞核和细胞质中的polyARNA样本的差异性杂交，可以估计出细胞核与细胞质中的每种polyARNA的分布：
同样的方法还可以调查其它类型的亚细胞单位。
I型和II型试验：
许多受关注的生物学问题都能用双色杂交试验这种最简单的方法来研究。
即两种样本直接在一张芯片上进行比较（被称为I型试验[20]）。
然而，对于需要对比多个样本的复杂问题，这种直接的比较就不适用了。
针对这种情况，我们使用一种替代的试验设计，即在每次杂交中加一个一般对照作参考，这样既保持了双色杂交内部对照的本质特征，又可形成在大量样本中的推断对比，而不需要每个成对样本单独对比（这样的试验设计为II型试验）。
这种方法最普遍的应用是用于时段（time-course）试验[21]，即每个时点（timepoint）与一个原始时点作对比。
由于在某个时点的一个特定基因的量相对于一个固定的参照（原始时点）而被检测，那么就可研究通过这个时段的每个基因的活动方式。
参照物不一定与被检验的样本有关系，参照物最主要的属性是它应提供一个杂交信号，这样在芯片上任何一个目的基因的杂交信号比值的分母就不会为零。
因为在被对比的大量样本中，一个理想的参照物对于每个样本来说，都是一样材料的混合，在这个混合物中，在一个样本中表达的任何一个基因，也会在参照物中表达出来。
二、仪器设备
制作和应用基因芯片，需要两种设备：
一个是制作芯片的机械手（又称点样仪）和一个扫描芯片的装置，一般是一个激光共聚焦显微镜（或称扫描仪）。
许多大的实验室和生物技术公司对基因芯片技术的冲动已被操作芯片试验所要求的较高专业技能和其惊人的价格所冲淡了。
为了使该技术操作更方便，价格更可接受，我们设计了价格相对便宜，及对分子生物学家来说更易操作、不需要太多工程专业经验就能装配和操作的仪器。
并且在网上（http:
//rana.stanford.edu/hardware）登载了详细的数据、设计结构和操作说明书。
点样仪和扫描仪两项仪器总的价格大约是60000美金。
三、靶DNA的制备
靶DNA的选择：
对于大规模基因表达的研究，每个被分析的基因都需要一个特定的杂交目标，从本质上讲，因为任何双链DNA样本（以及大部分单链DNA样本）都能被点在处理过的玻璃片上，所以点片用的靶DNA的选择很大程度上取决于所要研究的基因的可获得程度。
对于那些基因组已被完全测序的有机体，最简单的方法是用PCR扩增基因组中已知的、预知的开放阅读框（或研究者感兴趣的子集）。
寡核苷酸合成费用的不断降低（现在大约每对引物10美元）及96孔PCR仪的广泛应用使得这一方法十分可行，甚至对于相对大的基因组也适用。
我们实验室已经用这种方法制作了来自于测序酵母（Saccharomycescerevisiae）基因组[22]大约6200个开放阅读框的芯片，其中含启动子和终止子。
对那些基因组未测序或部分测序的，或者是基因组带有大量内含子的生物体，这种方法不适合。
对于很多生物体，如人和小鼠，目前常用来自cDNA文库的带有特异性序列的克隆，以及ESTs来鉴定不同mRNA的转录物[23]，而与这些转录物相应的单个cDNA克隆就可以作为靶DNA用于点芯片。
我们实验室最近已用这种方法制作了约10000个基因的人类基因芯片，点在芯片上的DNA序列是用PCR扩增的cDNA克隆（I.M.A.G.E.cDNA文库）[24]的插入片段。
对于那些没启动基因组测序计划的或还没得到序列的有机体，来自cDNA文库的克隆（相当正规的实验室能最大限度地减少重复）也能作为点片的靶DNA。
在预先没有关于序列、基因图位点和基因序列数据库编号的任何信息的情况下，也能收集到每个克隆的表达数据。
人们会发现，用小的DNA片段来代表每个基因要比用全长开放阅读框或1000bpcDNA更有益。
例如，在相互之间有显著同源性的酵母基因中，用代表序列差异最大部分的PCR产物代替整个编码区，可增加两基因之间的鉴别力，每个基因理想的表达量是目前研究的一个复杂问题。
PCR扩增：
一般来说，一个100µl的PCR反应所提供的DNA足可以点1000张芯片，我们大多数的100µl反应体系都是在96孔PCR仪（PerkinElmer9600sand9700s）中完成的。
扩增的实验参数取决于所用的模板和引物的类型，然而限定PCR的模板、引物、dNTP、镁离子、标准缓冲液和酶是十分重要的。
一般附加剂如甘油或明胶因改变表面张力或竞争玻片表面的附着位点而影响点片过程，应避免使用。
点样DNA的制备：
为了纯化PCR产物以制备点样DNA，我们一般用异丙醇沉淀PCR产物，然后在3×SSC中以大约100ng/µl的浓度重新悬浮DNA。
沉淀既能在PCR孔板中又能在V型底96孔组织培养板中进行。
首先在每孔中加入10µl醋酸铵（3M，ph5.2）；再加110µl异丙醇（我们用异丙醇而不用乙醇，使得沉淀混合物的总体积减少到能与PCR孔板或组织培养板容积相适应）；置孔板于-20℃，1小时（如果时间不允许，这一步可省略）；4℃下，3500×g（或3500rpm）离心沉淀1小时；在孔板下放2-3层纸巾以防破碎。
在一个离心机转头接头上可以叠放4块V底孔板一起旋转，在每块孔板之间放一个纸垫，然后把孔板小心地捆在一起，以防滑落。
沉淀后，吸出或颠倒孔板来弃去液体。
用100µl70%乙醇（用95%乙醇配制，因为100%乙醇中可能含有荧光杂质）洗沉淀，再离心30分钟，吸去或轻轻倒出液体，在体积适合96孔板的抽干机中浓缩干燥沉淀，（我们用SavantSpeedVacPlusSC210A；如果没有该仪器可在空气中干燥沉淀，但要防止灰尘）。
在10-15µl3×SSC（ph7.0）中重悬沉淀，4℃下至少放置12小时，小心封好孔板，以免蒸发。
因为过多的盐及DNA的浓缩会影响点片。
重新悬浮后，把溶液转移到软板中（Fisher3911MicroTestIIIFexibleAssayPlates）备用点片。
封严孔板，储存于4℃或-20℃直到使用。
在点片前，将孔板轻轻地离心一下，以保证所有物质都集中于孔底。
有些用户在用这种沉淀程序时，很难得到前后一致的结果。
有很多从PCR反应中回收纯化DNA的附加方法，也能买到大量纯化PCR反应的试剂盒。
我们没有对点片中的这种方法做过广泛的调查。
这一步骤主要目的是尽可能减少对DNA终溶液的污染，盐、清洁剂、甘油、明胶和一些特定的粒子如过柱树脂等会影响后续很多点片步骤。
如果操作这一步，必须十分小心，以确保去除DNA终溶液中的杂质。
任何其他点片用的DNA溶液制备的替代方法都应先做小规模的试验，并且用于整个点片和杂交过程以确保合适。
下面介绍已被成功使用的一种候选方法。
聚丙烯酰胺葡聚糖纯化法：
这种方法的原理是用一个简单的凝胶过滤树脂，保留盐离子和其它一些小的分子，而排出PCR产物。
因为DNA在水中洗脱而被排出，这样就不需要沉淀过程了。
同上所述，操作时必须十分谨慎，以防树脂污染点片溶液。
要纯化100µlPCR反应物，准备聚丙烯酰胺葡聚糖S400树脂（SigmaS400HR）并以2:
1的比例用ddH2O稀释。
以100µl每等份分装到96孔滤板中（PolytiltronicsUN800-PSC/mepp/D）。
向板中加400µlddH2O洗４次，用真空排枪（VacuumManifold）（PolyfiltronicsUNIVAES）吸出液体，把这个滤板套入聚丙烯96孔板中，４℃，2000rpm（ＢackmanGS-6离心机，带有Ｇ.Ｈ.3.8转头和ＢackmanMicropluscarriers）离心５分钟，弃去所有残留液体。
加100µl双蒸水（ddH2O）如上方法离心。
加100µlPCR产物混匀，倒入一个干净孔板中，在抽干机中干燥。
最终用３×SSC重新溶解PCR纯化产物。
四、玻片的准备
我们的微阵列绝大多数是点在用左旋多聚赖氨酸（poly-L-lysine）修饰处理的载玻片上的。
我们尝试过许多备选的修饰物，包括多种硅烷，但没有一个像poly-L-lysine这样简便而可靠。
为了准备左旋多聚赖氨酸修饰的玻片，把准备的载玻片（GoldSeal产品，目录号是3010）放在金属或玻璃架上（从Wheaton可以购到各种型号的架子），使玻片垂直固定，把架子放在一个合适型号的玻璃缸内。
一定要使用玻片架，架子要放在低速离心机中，到此步结束时它们要被旋转干燥。
最好避免把玻片从一种类型的架子上转移到另一种上。
虽然大多数玻片盒上都标有“干净”，但处理玻片前再清洗是必要的。
用50gNaOH溶解于200mlddH2O，再加300ml95%的乙醇（不要用100％乙醇）制备500ml碱性洗液，把玻片完全浸没在洗液中至少２小时，洗完用ddH2O全面冲洗５次，摇５分钟冲洗。
保持玻片浸没在ddH2O中，一旦洗净玻片，它们暴露于空气中的时间越短越好，因为灰尘会影响修饰和点片的过程。
准备修饰溶液（350ml），包含35mlpoly-L-lysine（0.1％Ｗ／Ｖ溶于水，SigmaP8920）,35ml灭菌过滤PBS和280mlddH2O，把该溶液倒入一个干净的玻璃缸中快速把玻片从最后一次洗液中移到修饰溶液中。
轻轻摇动溶液１小时，把修饰处理过的玻片插进一个装有干净ddH2O的缸中，上下抽动５次，把这个玻片架转移到一个低速离心机中（在架下放纸巾吸液体），旋转使玻片干燥（５分钟，室温下，1000rpm,BeckmanGs-6离心机，带有G.H.3.8.转子和BeckmanMicropluscarriers）。
用铝箔包裹干燥的玻片，防止灰尘。
把包好的玻片架放进一个真空干燥炉中，45℃，10分钟，真空干燥。
把玻片从铝箔中取出放进一个干净的塑料玻片架上（木头和软木塞有可能会使玻片上粘上粒子，最好不用），用封紧的玻片盒室温贮存。
这些玻片不能马上用于点片，必须被固化（或风化）至少数周，使其表面充分疏水干燥（玻片一般在修饰处理一个月后用于点片），修饰处理后的玻片表面的疏水性对于保证DNA样点足够小以形成高密度阵列是十分重要的。
一批玻片准备就绪，就要作抽样质检，方法是取出一张玻片，在其表面放150µlH2O,把玻片与水平呈45度角，观察水滴在玻片表面滑落，如果留下明显的滑落轨迹，就说明该玻片已经可以使用。
然而，检验玻片是否能用于点片,唯一最可靠的方法是在这一批玻片中先点几张作实验（见点片一节）。
六、制备探针
分离RNA：
我们成功尝试了各种方法制备的RNA，包括热酚抽提、异硫氰酸胍稳定及其它方法等，这些方法已在别处综述过，就不在此赘述了。
我们也成功尝试了Invitrogen的FastTrak2.0mRNAisolationkits（InvitrogenK1593-02），用于抽提人和酵母的样品。
主要判定指标为产出高质量的RNA。
对基因表达研究来说，最好的结果是用poly-dARNA作为逆转录模板，尽管，至少对酵母菌来说，用总RNA作为逆转录模板也取得了好结果。
一个好实验对每种标本需要至少1µg（越多越好）polyARNA（或100µg总RNA）以用作合成荧光标记cDNA探针的模板。
扩增小量RNA的方法正在尝试之中，与在这讨论的方法进行比较。
标记：
已有许多方法用于从RNA制备标记探针。
在多数情况下，我们直接在oligo-dT为引物进行逆转录反应时标记cDNA。
在某些条件下，用随机引物进行cDNA合成也可用于标记，尽管此方法不是对所有微阵列设计都适用。
例如，由3’端序列组成的微阵列更适用于oligo-dT反转录的cDNA探针，由完整cDNA序列或含预测开放阅读框架序列构成的微阵列对两种逆转录方法都适用。
样品还可在未标记的第一链合成后进行第二链合成时再标记。
以下列出三种方法。
荧光染料：
很多荧光染料标记的双脱氧核苷酸可由商业渠道取得。
出色的结果是用Cy3-和Cy5-dUTP获得，两者激发光谱分得很开，用多种酶均可获得特异活性掺入，干燥后就可激发荧光，从而简化了图象获取过程。
我们取得良好结果的其它荧光染料包括R110（PerkinElmer）、TAMRA（PerkinElmer）和SpectrumOrange（Vysis）。
oligo-dT和随机引物逆转录标记：
所有试剂应经过灭菌及DEPC处理。
RNA溶于10µl水中，该溶液应包括一些对照RNA（参见本文后半部分）。
加2.5µl（6µg）引物（20-meroligo-dT，anchoredoligo-dT，randomhexamer或randomnonamer：
2.5µg/µl，用水配制）。
70°C水浴10分钟以变性RNA，放于冰上。
将下列试剂混合：
2µlMMLV逆转录酶（GibcoBRLSuperScriptIIRnaseH-ReverseTranscriptasekit;目录号18064-014），6µl5×first-strandbuffer（SuperScriptkit;250mMTris-HCl，pH8.3，375mMKCl，15mMMgCl2），3µl0.1MDTT（也在试剂盒中），6µl5×nucleotides（2.5mMdATP，2.5mMdCTP，2.5mMdGTP，1.0mMdTTP），3µl1mMCy3或Cy5标记的dUTPs（Amersham）。
上述混合液加入RNA-引物溶液，终体积为30µl，42°C保温1小时。
加入1µlSuperScriptII逆转录酶，42°C再保温1小时。
加1.5µl20mMEDTA以终止反应，加入15µl0.1MNaOH降解模板RNA，70°C孵育10分钟，立即加入15µl0.1MHCL以中和样品（荧光染料，尤其是Cy5对高PH敏感）。
将样品放入Microcon30微浓缩器（Amicon），并加入500µlTE（10mMTris，pH8.0，1mMEDTA），在台式离心机上高速离心5-10分钟，以调整体积至10-20µl，弃流出液，加500µlTE，再次离心。
二次离心后，Microcon滞存的探针应显著比流出液清亮。
这一个成功标记反应的非常有力的指示现象。
如果没有一点颜色滞存，标记反应就不太可能产生好的染交结果。
将离心柱反转，再离心1分钟，以收集探针，将Cy3、Cy5标记的探针混合，并TE调整体积至500µl，用离心柱调整体积至8µl（到此，颜色应显紫色）。
加2µl封闭液，封闭液含10g/µl20-meroligo-dA，10µg/µlyeasttRNA以及10µg/µlhumancot-1DNA（用于人探针时，GibcoBRL目录号15279-011）。
加入2.1µl20×SSC（终浓度为3.5×）和0.4µl10%SDS（终浓度为0.3%）。
注意加SDS时，枪头外壁不应有SDS，因为过多SDS会对杂交反应产生负影响。
将样品放入100°C水浴1分钟，以变性样品。
该样品应在实验台上自然冷却。
对人样品，应在室温下放置30分钟，以允许cot-1酶切DNA片段与重复序列杂交，对酵母样品来说，样品一旦冷却下来即可用于杂交反应了。
对杂交面积为2cm×2cm的阵列来说，杂交液体积适宜用12µl，杂交面积越大，也就需要更大体积的杂交液。
用Klenow酶标记cDNA：
用以上方法制备cDNA模板，唯一例外之处是5×核苷酸溶液中的每种dNTP浓度为2.5mM（即逆转录反应中每种dNTP的终浓度均为0.5mM），不含荧光染料标记的核苷酸。
按前述方法调节样品至终体积20µl，加入3µl随机引物（hexamer或nonamer，4µg/µl），100°C变性1分钟，置实验台上冷却5分钟。
加入5µl10×buffer（100mMTris-HCl，pH7.4，50mMMgCl2，75mMDTT），5µl10×nucleotides（0.25mMdATP，0.25mMdCTP，0.25mMcGTP，0.09mMdTTP），1.5µl1mMCy3或Cy5dUTP（Amersham），2µl（10U）无外切酶活性的Klenow酶（USB，目录号E700572），13.5µlddH2O至终体积50µl。
37°C温育4小时。
按前述方法纯化样品并准备杂交。
七、杂交
用台式离心机将探针样品高速离心1分钟，以沉淀任何可能的杂质。
用移液枪将样品吸加到阵列中央，注意不要碰到离心管中任何沉淀并避免形成气泡。
封盖玻片（要足够大以覆盖整个阵列杂交区表面），注意不要形成气泡。
在该玻片的另一区域滴加5µl3×SSC，以提供杂交舱内湿度，由此可以确保杂交过程中探针混合物不会蒸干。
将玻片放入封口的杂交舱中，并浸入65°C水浴，4-6小时。
八、杂交后处理
杂交后，小心擦干杂交舱并移出玻片，浸入盛有洗液1（2×SSC，0.1%SDS）的玻片槽中，玻片点样面朝下，这样当盖玻片掉落时不会划伤阵列表面。
剥落盖玻片后，将玻片在洗液中晃动2-3次后移入盛有洗液2（1×SSC）的玻片槽中，小心操作，尽可能减少洗液1混入玻片槽2中，因为SDS会干扰玻片图象质量。
轻柔摇晃玻片槽2分钟，将玻片移入盛有洗液3（0.2×SSC）2分钟，然后离心甩干玻片。
所有洗液温度均应为室温。
改变这些步骤的温度和时间会改变杂交的严谨性。
九、参照
由于微阵列试验的高平行性，所以在每张阵列反应中加入多种参照物是可能的而且是很有价值的。
下面将描述一些有用的参照。
掺入RNA：
在探针制备过程的各个阶段加入已知量的参照RNA，对检测和评价每次实验的各个方面是非常有用的。
很明显，选用的掺入RNA不应与待研究的有机体的RNA有交叉杂交，但两者总体特性应相近（GC含量、长度、poly-A尾巴）。
许多酵母菌基因可以在人基因表达阵列上用作参照，因为两者在核苷酸水平的同源性很有限。
将上百个这样的基因点于人的基因阵列上只是显著增加了点样时间。
将这些基因克隆到带有噬菌体RNA聚合酶结合位点和人造poly-A尾巴的质粒上，就可以制备用于各个实验阶段的参照基因的大量RNA。
此类参照可用于各个方面，例如，参照RNA可以按不同比例或以不同总浓度掺入Cy3、Cy5标记反应，由此可以测定杂交严谨性、输入比和输出比的校正以及检测灵敏度。
RNA质量参照：
某一类型核酸与互补靶基因结合的量与互补序列长度有关。
所以某一给定cDNA的杂交信号强度随RNA质量好坏而不同。
这会导致不能理解的微阵列杂交结果，例如，用不同质量的同一RNA衍生得到的等量cDNA用于杂交时，会看到ratio值明显不相同。
谨慎选择靶基因序列可使这个问题的影响最小化。
对oligo-dT逆转录的cDNA，如果靶基因序列局限在3’端，则对RNA质量最不敏感。
RNA质量可由相应参照物方便地检测，例如叠瓦式覆盖整个基因的长度为100-200bp的一组DNA片段可以用于测定待比较样品中的RNA相对质量，而降解RNA及由oligo-dT逆转录标记的cDNA于5’序列含量较多的基因杂交会产生相应比例的弱信号。
制备叠瓦式基因片段作为参照，在RNA和探针制备的各个阶段掺入进去，例如，收获细胞时、分离poly-ARNA时、探针标记时以及杂交前，由此可以鉴定设计RNA质量问题的实验步骤。
封闭参照：
如前所述，由于探针和靶基因之间存在非基因特异性的相似性，尤其是由重复序列引致的，大多数杂交反应需加入冷DNA进行封闭。
与此类潜在的混淆序列相应的参照靶基因可用于检测封闭是否成功。
例如，如果重复序列被成功封闭，在人类基因表达阵列上含有人cot-1酶切DNA片段的基因点应产生极弱
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