大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计.docx
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大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计
大肠杆菌基因组DNA的提取
一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。
1、实验原理
提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠(SDS)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。
SDS的作用机理是由于其能结合蛋白,中和蛋白的电性,使蛋白质的非共价键受到破坏,失去二级结构,从而变形失活,蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶,其重要特性是能在SDS和EDTA(乙二胺四乙酸二钠)存在的情况下保持很高的活性。
在匀浆后提取DNA的反应体系中,SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白和DNA分离;而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸,使DNA分子完整地分离出来。
用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质,最后用无水乙醇沉淀DNA。
为获得高纯度DNA,操作过程中常加入RNaseA除去RNA。
CTAB(十六烷基三乙基溴化铵)是一种去污剂,可溶解细胞膜,它能与核酸形成复合物,在高盐溶液中(0.7mol/LNaCl)是可溶的,当降低溶液盐浓度到一定的程度(0.3mol/LNaCl)时,从溶液中沉淀,通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白,多糖物质分开。
最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA,而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。
2、实验试剂与仪器
1)实验材料:
大肠杆菌
2)实验试剂:
LB液体培养基,TE溶液,10%SDS,蛋白酶K,5mol/LNaCl, CTAB/NaCl溶液,酚/氯仿/异戊醇,异丙醇,70%乙醇
3)实验仪器:
恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅
3、溶液配制
1)LB液体培养基:
细菌培养用胶化蛋白胨10g/L,细菌培养用酵母提取物5g/L,NaCl10g/L,去离子水。
(搅拌溶解后,用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml,用20/50ml摇瓶分装5瓶,包扎好,在121℃,1.034×105pa高压下蒸汽灭菌20min.)
2)TE缓冲液:
1MTris溶液(取Tris242.2g,加ddH2O至1600ml,加热溶解)
1Mtris-HClpH8.0溶液(取1MTris溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0(需浓盐酸约8.5ml),加ddH2O定容至200ml,高压灭菌备用)
TE缓冲液(10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0,1MTris-HClBufferPH=8.05ml
0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后,高温高压灭菌,室温保存)
3)蛋白酶K:
(20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水,-20℃备用)
4)CTAB/NaCl溶液:
(5%w/v,5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中,需加热到65℃使之溶解,然后室温保存)
4、实验方法步骤
1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中,一级培养过夜,以10%的接种量进行二级培养,培养至对数期(4-6h)。
2、取菌液1.5ml置于离心管中,以5000rpm冷冻离心1min,弃上清液
3、加190ulTE悬浮沉淀,并加10ul10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠
4、加入1ul蛋白酶K(20mg/ml),混匀,37℃保温1小时。
5、加30ul5mol/LNaCl,混匀。
6、加30ulCTAB/NaCl溶液,混匀,65℃保温20min
7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提(25:
24:
1),5000rmp离心10min
8、取上清液,加入300ul氯仿/异戊醇(24:
1)抽提,5000rmp离心10min
9、取上清液,加入300ul的异丙醇,颠倒混匀,室温下静止10min,沉淀DNA,5000rmp离心10min
10、加500ul70%乙醇洗沉淀,5000rmp离心10min
11、弃上清液,待酒精挥发尽后加30ulTE溶解
12、溶解于20ulTE中,-20℃保存。
二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。
细菌基因组DNA提取试剂盒:
1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒
DP302-0250次420元
2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒
TaKaRa DV810A50650元
3、Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒
GD2411-01BacterialgDNAkit50次423元
GD2411-02BacterialgDNAkit250次1798元
4、Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒
BSC12S150次400元
BSC12M1100次750元
5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒
D3350-00E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit5210元
D3350-01E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit50980元
D3350-02E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit2003350元
荧光定量PCR试验(标准曲线法)
定量实验是一种实时实验,用于在聚合酶链反应(PCR)的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列(靶)数量。
其中靶可以是DNA、cDNA或RNA。
【实验原理】
在实时定量实验中,反应是在PCR产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来描述的,而不是在固定循环次数后累积的PCR产物最终数量来描
述。
扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。
在PCR的最初几次循环中,荧光信号没有明显变化。
该预定义的PCR循环范围称为基线。
首先,软件通过计算归一化报告荧光信号强度(与基线循环相对应的Rn值)的数学趋势,生成一个基线简化扩增曲线。
然后,算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度(deltaRn[∆Rn]值)与阈值交叉的点。
∆Rn值与阈值交叉的分数循环定义为CT。
一、试验设计
使用StepOne软件中的DesignWizard(设计导向)创建新实验
1、定义实验属性
在ExperimentProperties(实验属性)屏幕上,输入实验的标识信息,然后选择要设计的实验类型。
1)ExperimentName(实验名称)。
2)Barcode(条码),然后输入您的PCR反应板上的条码。
(可不填)
3)UserName(用户名)。
4)Comments(注释)。
(可不填)
5)选择Quantitation(定量)实验类型
6)Next>(下一步)
2、定义方法和材料
在Methods&Materials(方法和材料)屏幕上,选择用于实验的定量方法、试剂、升降温速度和PCR模板。
1)将StandardCurve(标准曲线)选为定量方法。
将StandardCurve(标准曲线)选为定量方法。
标准曲线实验确定样本中靶序列的绝对量。
从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果。
当设置反应板时,标准曲线方法需要靶、标准品和样本。
用于标准曲线实验的PCR反应包括以下组分:
•样本-其中靶数量未知的样本。
•标准品-数量已知的样本。
•标准品稀释序列-一组用于构建标准曲线的标准品稀释液(例如,1:
2、1:
4、1:
8、1:
16、1:
32)。
•重复数-含有相同组分和量的相同反应数。
•阴性对照-含有水或缓冲液的样本,不含模板;也称为“无模板对照
(NTC)”。
阴性对照应不会扩增。
2)为试剂选择TaqMan®Reagents(TaqMan试剂)(包括两个引物一个探针)。
–如果使用TaqMan试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量,则选择
TaqMan®Reagents(TaqMan试剂)。
TaqMan试剂包括两个引物和一个
TaqMan®探针。
引物设计用于扩增靶。
TaqMan探针设计用于杂交靶,并
在扩增靶时产生荧光信号。
切记!
AppliedBiosystems不建议将TAMRATM染料随StepOneTM系统用作荧光报告基团或淬火基团。
–如果使用SYBRGreen试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量,则选
择SYBR®GreenReagents(SYBRGreen试剂)。
SYBRGreen试剂包括两
个引物和SYBRGreen染料。
引物设计用于扩增靶。
SYBRGreen染料可在
结合到双链DNA时产生荧光信号。
SYBRGreen染料通常是添加到反应的
SYBRGreen母液的一部分。
如果使用SYBRGreen染料:
选择IncludeMeltCurve(包括解链曲线)以执行扩增靶的解链曲线分析。
将Standard(标准)选为升降温速度。
AppliedBiosystems不提供SYBR
Green试剂的Fast母液。
3)为升降温速度选择Standard(~2hourstocompletearun)(标准(约两小时完成运行))。
–如果为PCR反应使用Fast试剂,则选择Fast(~40Minutesto
CompleteaRun)(快速(约40分钟完成运行))。
–如果为PCR反应使用标准试剂(包括SYBRGreen试剂和TaqMan试剂),则选择Standard(~2HourstoCompleteaRun)(标准(约2小时完成运行))。
4)为模板类型选择gDNA(genomicDNA)(gDNA(基因组DNA))。
5)Next>(下一步)。
3、设置靶
在Targets(靶)屏幕上,输入您想在PCR反应板中定量的靶数量,然后为每个靶设置检测。
1)单击Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinthereactionplate?
(您想在反应板中定量多少靶?
)字段,然后输入1(根据需要填)。
注意:
靶检测表中的行数将以您输入的数字更新。
2)选择SetUpStandards(设置标准品)复选框,以为靶检测设置标准品。
建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线。
注意:
SetUpStandards(设置标准品)复选框默认情况下已选取。
3)设置靶1检测:
a.单击EnterTargetName(输入靶名称)单元格,然后输入RNaseP(示例)。
b.从Reporter(报告基团)下拉菜单中,选择FAM(默认)。
–如果要将FAMTM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端,则选择FAM。
–如果要将JOETM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端,则选择JOE。
–如果要将VIC®染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端,则选择VIC。
–如果您正使用SYBR®Green染料以检测双链DNA,则选择SYBR。
c.从Quencher(淬火基团)下拉菜单中,选择NFQ-MGB(默认)。
–如果要将非荧光淬火基团-小沟结合物加在您正用于检测靶的TaqMan探针的3′端,则选择NFQ-MGB。
–如果您正使用SYBRGreen染料,则选择None(无)。
4)Next>(下一步)。
4、设置标准品
在Standards(标准品)屏幕上,为所有标准曲线输入反应板中的点数和重复数。
对于每条标准曲线,输入起始量并选择序列倍数。
1)单击Howmanypointsdoyouneedforeachstandardcurve?
(每条标准曲线您需要多少个点?
)字段,然后输入5。
建议每条标准曲线应至少有五个稀释点。
2)单击Howmanyreplicatesdoyouneedforeachpoint?
(每个点您需要多少次重复反应?
)字段,然后输入3。
建议每个点三次重复反应。
3)为RNaseP(示例)检测定义标准品数量范围:
a.单击EnterStartingQuantity(输入起始量)字段,然后输入10000。
由于标准品数量的范围会影响扩增效率计算,因此应仔细为您的检测考虑标准品数量的适当范围:
–为了更准确地测量扩增效率,请使用大范围的标准品数量,扩大到5个至6个对数级之间。
如果您为标准品指定大范围的数量,您需使用PCR产物或高度浓缩的模板,如cDNA克隆。
–如果您的cDNA模板数量有限且/或靶是低拷贝数转录物,或已知在给定范围之内,则可能需要小范围的标准品数量。
b.从SelectSerialFactor(选择序列倍数)下列菜单中,选择1:
2。
序列倍数用于计算标准曲线所有点中的数量。
如果您的起始数量是最高数
量,则选择如1:
2、1:
3之类的稀释倍数。
如果您的起始数量是最低数量,则选择如2X、3X之类的浓缩倍数。
4)查看StandardCurvePreview(标准品曲线预览)窗格。
标准曲线应包含如下点:
10000、5000、2500、1250和625。
5)Next>(下一步)。
5、设置样本
在Samples(样本)屏幕上,输入反应板中要包括的样本、重复数和阴性对照数,然后选择样本/靶反应以进行设置。
1)单击Howmanysamplesdoyouwanttotestinthereactionplate?
(您想在反应板中检测多少样本?
)字段,然后输入2。
(根据需要填)
2)单击Howmanyreplicatesdoyouneed?
(您需要多少次重复反应?
)字段,然后输入3。
建议对每个样本反应重复三次反应。
3)单击Howmanynegativecontrolsdoyouneedforeachtargetassay?
(每个靶检测您需要多少阴性对照?
),然后输入3。
建议对每个靶检测进行三次阴性对照反应。
4)4.设置样本1:
a.单击EnterSampleName(输入样本名)字段,然后输入pop1(用于重复组1)。
b.保留Color(颜色)字段中的默认设置。
5)设置样本2:
a.单击EnterSampleName(输入样本名)字段,然后输入pop2(用于重复组2)。
b.保留Color(颜色)字段中的默认设置。
6)选择AllSample/TargetReactions(所有样本/靶反应)以检测所有样本中的所有靶。
–选择AllSample/TargetReactions(所有样本/靶反应)以检测所有样本中的所有靶。
–选择SpecifySample/TargetReactions(指定样本/靶反应)以指定每个样本中要检测的靶。
7)在WellCount(反应孔数)窗格中,确认存在:
•6个未知反应孔U
•15个标准品反应孔S
•3个阴性对照反应孔N
•24个空反应孔
8)在ViewPlateLayout(查看检测板布局)选项卡上:
a.从ArrangePlateby(反应板布局方式)下拉菜单中,选择Rows(按行)
(默认)。
b.从PlaceNegativeControls(放置阴性对照)下拉菜单中,选择UpperLeft(左上角)(默认)。
9)Next>(下一步)。
6、设置运行方式
在RunMethod(运行方法)屏幕上,查看默认运行方法的反应体积和温度变化过程设置。
若需要,您可调整默认运行方法或用RunMethod(运行方法)库中的某种方法进行替换。
1)单击选择GraphicalView(图形视图)选项卡(默认)或TabularView(表格视图)选项卡。
2)单击ReactionVolumePerWell(每个反应孔的反应体积)字段,然后输入25µL。
为“反应体积/反应孔”输入介于10至30的值。
StepOne系统支持10至
30µL之间的反应体积。
3)确保温度变化过程设置显示保持和循环阶段。
–确保温度变化过程设置适合试剂。
–如果正执行一步法RT-PCR扩增,则包括一个反转录步骤。
如果实验需要一个不同的温度变化过程设置,调整温度变化过程设置或用
RunMethod(运行方法)库中的某个温度变化过程设置进行替换。
RunMethod(运行方法)库包括在StepOne软件中。
4)Next>(下一步)。
7、查看反应设置
在ReactionSetup(反应设置)屏幕上,选择检测类型(如果使用TaqMan试剂),然后查看为准备PCR反应、标准稀释序列和样本稀释而计算的剂量。
若需要,您可调整反应体积、额外反应体积、组分浓度、标准品浓度和/或稀释后样本浓度。
切记!
对反应板中的每个靶检测执行这些步骤。
完成ReactionMixCalculations(反应预混液计算)选项卡
1)选择ReactionMixCalculations(反应预混液计算)选项卡(默认)。
2)从SelectTarget(选择靶)窗格中,选择RNaseP。
3)从AssayType(检测类型)下拉菜单中,选择Inventoried/MadetoOrder(库存/定制)。
如果正使用TaqMan试剂,选择所使用的检测类型:
–如果正使用AppliedBiosystemsTaqMan®GeneExpressionAssays(库存/定制)或AppliedBiosystemsCustomTaqMan®GeneExpressionAssays,则
选择Inventoried/MadetoOrder(库存/定制)。
–如果正使用PrimerExpress®软件设计检测,则选择Custom
(定制)。
4)确认ReactionVolumePerWell(每个反应孔的反应体积)字段中显示25µL。
为“反应体积/反应孔”输入介于10至30的值。
StepOne系统支持10至
30µL之间的反应体积。
5)确认ExcessReactionVolume(额外反应体积)字段中显示10%。
包括额外反应体积以弥补移液过程中的损失。
建议至少准备10%的额外反应体积。
6)在ReactionsforRNaseP(RNaseP反应)窗格中:
a.确认MasterMixConcentration(母液浓度)字段中显示2.0X。
b.确认AssayMixConcentration(检测预混液浓度)字段中显示20.0X。
c.查看PCR反应的组分和计算的剂量。
7)在StandardDilutionSeriesforRNaseP(RNaseP的标准品稀释序列)窗格中:
a.单击StandardConcentrationinStock(储液中标准品的浓度)字段,然后输入20000。
b.单击units(单位)字段,然后输入copiesperµL。
c.查看为准备标准品稀释序列计算的剂量。
完成SampleDilutionCalculations(样本稀释计算)选项卡
1)选择SampleDilutionCalculations(样本稀释计算)选项卡。
2)单击DilutedSampleConcentration(10XforReactionMix)(稀释后样本浓度)(对于反应预混液为10X),然后输入6.6。
3)从单位下拉菜单中,选择ng/µL(默认)。
4)查看为样本稀释计算的剂量。
8、实验材料订购
在MaterialsList(材料列表)屏幕上,查看建议用于准备PCR反应板的材料列表。
或者,您可从AppliedBiosystemsStore(AppliedBiosystems产品仓库)订购所建议的材料。
创建购物篮,向购物列表中添加项目,然后登录以提交您的订单。
您必须具有不受限制的网络连接才能访问AppliedBiosystemsStore(AppliedBiosystems产品仓库)。
1)在AppliedBiosystemsStore(AppliedBiosystems产品仓库)网站上查找靶检测套件:
a.确保您的计算机已连接到因特网。
b.单击EnterGeneName(输入基因名)字段,输入RNaseP,然后单击FindAssay(查找检测套件)。
c.在FindAssayResults(发现检测套件结果)对话框中,选择您的检测套件。
d.单击ApplyAssaySelection(应用检测套件选择)。
2)完成ExperimentMaterialsList(实验材料列表)窗格:
a.从Display(显示)下拉菜单中,选择AllItems(所有项)(默认),然后查看建议的材料。
若需要,使用右侧的滚动条查看所有项。
3)用于进行定量实验的Inventoried/MadetoOrder检测设计用于配合以下TaqMan®母液使用:
TaqMan®FastUniversalPCRMasterMix(2✕),NoAmpErase®UNG,
250次反应,编号
TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,200次反应,编号
TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,2000次反应,编号
10包装TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,编号
TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase®UNG,200次反应,编号
TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase®UNG,
2000次反应,编号
10包装TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase®
UNG,编号
4)靶DNA或cDNA有几种TaqMan和SYBRGreen试剂可用于定量实验。
a.TaqMan®试剂
TaqMan®FastUniversalPCRMasterMix(2✕),No
AmpErase®UNG,250次反应
TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,200次反应,编号
TaqMan®2