大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计.docx

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大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计

大肠杆菌基因组DNA的提取

一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。

1、实验原理

提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。

在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。

用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。

为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。

CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3mol/LNaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。

最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。

2、实验试剂与仪器

1）实验材料：

大肠杆菌

2）实验试剂：

LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/LNaCl， CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇

3）实验仪器：

恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅

3、溶液配制

1）LB液体培养基：

细菌培养用胶化蛋白胨10g/L，细菌培养用酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，去离子水。

（搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105pa高压下蒸汽灭菌20min.）

2）TE缓冲液：

1MTris溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解）

1Mtris-HClpH8.0溶液（取1MTris溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用） 

TE缓冲液（10mMTris-HCl1MmEDTApH=8.0，1MTris-HClBufferPH=8.05ml

0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）

3）蛋白酶K：

（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用）

4）CTAB/NaCl溶液：

（5%w/v，5gCTAB溶于100ml0.5MNaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存）

4、实验方法步骤

1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。

2、取菌液1.5ml置于离心管中，以5000rpm冷冻离心1min，弃上清液

3、加190ulTE悬浮沉淀，并加10ul10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠

4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀，37℃保温1小时。

5、加30ul5mol/LNaCl,混匀。

6、加30ulCTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min

7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提（25：

24:

1），5000rmp离心10min

8、取上清液，加入300ul氯仿/异戊醇（24:

1）抽提，5000rmp离心10min

9、取上清液，加入300ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止10min，沉淀DNA，5000rmp离心10min

10、加500ul70%乙醇洗沉淀，5000rmp离心10min

11、弃上清液，待酒精挥发尽后加30ulTE溶解

12、溶解于20ulTE中，-20℃保存。

二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。

细菌基因组DNA提取试剂盒：

1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒

DP302-0250次420元

2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒

TaKaRa DV810A50650元

3、Biomiga细菌基因组DNA提取试剂盒

GD2411-01BacterialgDNAkit50次423元

GD2411-02BacterialgDNAkit250次1798元

4、Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒

BSC12S150次400元

BSC12M1100次750元

5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒

D3350-00E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit5210元

D3350-01E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit50980元

D3350-02E.Z.N.A.TMBacterialDNAkit2003350元

荧光定量PCR试验（标准曲线法）

定量实验是一种实时实验，用于在聚合酶链反应（PCR）的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列（靶）数量。

其中靶可以是DNA、cDNA或RNA。

【实验原理】

在实时定量实验中，反应是在PCR产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来描述的，而不是在固定循环次数后累积的PCR产物最终数量来描

述。

扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。

在PCR的最初几次循环中，荧光信号没有明显变化。

该预定义的PCR循环范围称为基线。

首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度（与基线循环相对应的Rn值）的数学趋势，生成一个基线简化扩增曲线。

然后，算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度（deltaRn[∆Rn]值）与阈值交叉的点。

∆Rn值与阈值交叉的分数循环定义为CT。

一、试验设计

使用StepOne软件中的DesignWizard（设计导向）创建新实验

1、定义实验属性

在ExperimentProperties（实验属性）屏幕上，输入实验的标识信息，然后选择要设计的实验类型。

1）ExperimentName（实验名称）。

2）Barcode（条码），然后输入您的PCR反应板上的条码。

（可不填）

3）UserName（用户名）。

4）Comments（注释）。

（可不填）

5）选择Quantitation（定量）实验类型

6）Next>（下一步）

2、定义方法和材料

在Methods&Materials（方法和材料）屏幕上，选择用于实验的定量方法、试剂、升降温速度和PCR模板。

1）将StandardCurve（标准曲线）选为定量方法。

将StandardCurve（标准曲线）选为定量方法。

标准曲线实验确定样本中靶序列的绝对量。

从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果。

当设置反应板时，标准曲线方法需要靶、标准品和样本。

用于标准曲线实验的PCR反应包括以下组分：

•样本－其中靶数量未知的样本。

•标准品－数量已知的样本。

•标准品稀释序列－一组用于构建标准曲线的标准品稀释液（例如，1:

2、1:

4、1:

8、1:

16、1:

32）。

•重复数－含有相同组分和量的相同反应数。

•阴性对照－含有水或缓冲液的样本，不含模板；也称为“无模板对照

（NTC）”。

阴性对照应不会扩增。

2）为试剂选择TaqMan®Reagents（TaqMan试剂）（包括两个引物一个探针）。

–如果使用TaqMan试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择

TaqMan®Reagents（TaqMan试剂）。

TaqMan试剂包括两个引物和一个

TaqMan®探针。

引物设计用于扩增靶。

TaqMan探针设计用于杂交靶，并

在扩增靶时产生荧光信号。

切记！

AppliedBiosystems不建议将TAMRATM染料随StepOneTM系统用作荧光报告基团或淬火基团。

–如果使用SYBRGreen试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选

择SYBR®GreenReagents（SYBRGreen试剂）。

SYBRGreen试剂包括两

个引物和SYBRGreen染料。

引物设计用于扩增靶。

SYBRGreen染料可在

结合到双链DNA时产生荧光信号。

SYBRGreen染料通常是添加到反应的

SYBRGreen母液的一部分。

如果使用SYBRGreen染料：

选择IncludeMeltCurve（包括解链曲线）以执行扩增靶的解链曲线分析。

将Standard（标准）选为升降温速度。

AppliedBiosystems不提供SYBR

Green试剂的Fast母液。

3）为升降温速度选择Standard（~2hourstocompletearun）（标准（约两小时完成运行））。

–如果为PCR反应使用Fast试剂，则选择Fast（~40Minutesto

CompleteaRun）（快速（约40分钟完成运行））。

–如果为PCR反应使用标准试剂（包括SYBRGreen试剂和TaqMan试剂），则选择Standard（~2HourstoCompleteaRun）（标准（约2小时完成运行））。

4）为模板类型选择gDNA（genomicDNA）（gDNA（基因组DNA））。

5）Next>（下一步）。

3、设置靶

在Targets（靶）屏幕上，输入您想在PCR反应板中定量的靶数量，然后为每个靶设置检测。

1）单击Howmanytargetsdoyouwanttoquantifyinthereactionplate?

（您想在反应板中定量多少靶？

）字段，然后输入1（根据需要填）。

注意：

靶检测表中的行数将以您输入的数字更新。

2）选择SetUpStandards（设置标准品）复选框，以为靶检测设置标准品。

建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线。

注意：

SetUpStandards（设置标准品）复选框默认情况下已选取。

3）设置靶1检测：

a.单击EnterTargetName（输入靶名称）单元格，然后输入RNaseP（示例）。

b.从Reporter（报告基团）下拉菜单中，选择FAM（默认）。

–如果要将FAMTM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端，则选择FAM。

–如果要将JOETM染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端，则选择JOE。

–如果要将VIC®染料加在您用于检测靶的TaqMan探针的5′端，则选择VIC。

–如果您正使用SYBR®Green染料以检测双链DNA，则选择SYBR。

c.从Quencher（淬火基团）下拉菜单中，选择NFQ-MGB（默认）。

–如果要将非荧光淬火基团－小沟结合物加在您正用于检测靶的TaqMan探针的3′端，则选择NFQ-MGB。

–如果您正使用SYBRGreen染料，则选择None（无）。

4）Next>（下一步）。

4、设置标准品

在Standards（标准品）屏幕上，为所有标准曲线输入反应板中的点数和重复数。

对于每条标准曲线，输入起始量并选择序列倍数。

1）单击Howmanypointsdoyouneedforeachstandardcurve?

（每条标准曲线您需要多少个点？

）字段，然后输入5。

建议每条标准曲线应至少有五个稀释点。

2）单击Howmanyreplicatesdoyouneedforeachpoint?

（每个点您需要多少次重复反应？

）字段，然后输入3。

建议每个点三次重复反应。

3）为RNaseP（示例）检测定义标准品数量范围：

a.单击EnterStartingQuantity（输入起始量）字段，然后输入10000。

由于标准品数量的范围会影响扩增效率计算，因此应仔细为您的检测考虑标准品数量的适当范围：

–为了更准确地测量扩增效率，请使用大范围的标准品数量，扩大到5个至6个对数级之间。

如果您为标准品指定大范围的数量，您需使用PCR产物或高度浓缩的模板，如cDNA克隆。

–如果您的cDNA模板数量有限且/或靶是低拷贝数转录物，或已知在给定范围之内，则可能需要小范围的标准品数量。

b.从SelectSerialFactor（选择序列倍数）下列菜单中，选择1:

2。

序列倍数用于计算标准曲线所有点中的数量。

如果您的起始数量是最高数

量，则选择如1:

2、1:

3之类的稀释倍数。

如果您的起始数量是最低数量，则选择如2X、3X之类的浓缩倍数。

4）查看StandardCurvePreview（标准品曲线预览）窗格。

标准曲线应包含如下点：

10000、5000、2500、1250和625。

5）Next>（下一步）。

5、设置样本

在Samples（样本）屏幕上，输入反应板中要包括的样本、重复数和阴性对照数，然后选择样本/靶反应以进行设置。

1）单击Howmanysamplesdoyouwanttotestinthereactionplate?

（您想在反应板中检测多少样本？

）字段，然后输入2。

（根据需要填）

2）单击Howmanyreplicatesdoyouneed?

（您需要多少次重复反应？

）字段，然后输入3。

建议对每个样本反应重复三次反应。

3）单击Howmanynegativecontrolsdoyouneedforeachtargetassay?

（每个靶检测您需要多少阴性对照？

），然后输入3。

建议对每个靶检测进行三次阴性对照反应。

4）4.设置样本1：

a.单击EnterSampleName（输入样本名）字段，然后输入pop1（用于重复组1）。

b.保留Color（颜色）字段中的默认设置。

5）设置样本2：

a.单击EnterSampleName（输入样本名）字段，然后输入pop2（用于重复组2）。

b.保留Color（颜色）字段中的默认设置。

6）选择AllSample/TargetReactions（所有样本/靶反应）以检测所有样本中的所有靶。

–选择AllSample/TargetReactions（所有样本/靶反应）以检测所有样本中的所有靶。

–选择SpecifySample/TargetReactions（指定样本/靶反应）以指定每个样本中要检测的靶。

7）在WellCount（反应孔数）窗格中，确认存在：

•6个未知反应孔U

•15个标准品反应孔S

•3个阴性对照反应孔N

•24个空反应孔

8）在ViewPlateLayout（查看检测板布局）选项卡上：

a.从ArrangePlateby（反应板布局方式）下拉菜单中，选择Rows（按行）

（默认）。

b.从PlaceNegativeControls（放置阴性对照）下拉菜单中，选择UpperLeft（左上角）（默认）。

9）Next>（下一步）。

6、设置运行方式

在RunMethod（运行方法）屏幕上，查看默认运行方法的反应体积和温度变化过程设置。

若需要，您可调整默认运行方法或用RunMethod（运行方法）库中的某种方法进行替换。

1）单击选择GraphicalView（图形视图）选项卡（默认）或TabularView（表格视图）选项卡。

2）单击ReactionVolumePerWell（每个反应孔的反应体积）字段，然后输入25µL。

为“反应体积/反应孔”输入介于10至30的值。

StepOne系统支持10至

30µL之间的反应体积。

3）确保温度变化过程设置显示保持和循环阶段。

–确保温度变化过程设置适合试剂。

–如果正执行一步法RT-PCR扩增，则包括一个反转录步骤。

如果实验需要一个不同的温度变化过程设置，调整温度变化过程设置或用

RunMethod（运行方法）库中的某个温度变化过程设置进行替换。

RunMethod（运行方法）库包括在StepOne软件中。

4）Next>（下一步）。

7、查看反应设置

在ReactionSetup（反应设置）屏幕上，选择检测类型（如果使用TaqMan试剂），然后查看为准备PCR反应、标准稀释序列和样本稀释而计算的剂量。

若需要，您可调整反应体积、额外反应体积、组分浓度、标准品浓度和/或稀释后样本浓度。

切记！

对反应板中的每个靶检测执行这些步骤。

完成ReactionMixCalculations（反应预混液计算）选项卡

1）选择ReactionMixCalculations（反应预混液计算）选项卡（默认）。

2）从SelectTarget（选择靶）窗格中，选择RNaseP。

3）从AssayType（检测类型）下拉菜单中，选择Inventoried/MadetoOrder（库存/定制）。

如果正使用TaqMan试剂，选择所使用的检测类型：

–如果正使用AppliedBiosystemsTaqMan®GeneExpressionAssays（库存/定制）或AppliedBiosystemsCustomTaqMan®GeneExpressionAssays，则

选择Inventoried/MadetoOrder（库存/定制）。

–如果正使用PrimerExpress®软件设计检测，则选择Custom

（定制）。

4）确认ReactionVolumePerWell（每个反应孔的反应体积）字段中显示25µL。

为“反应体积/反应孔”输入介于10至30的值。

StepOne系统支持10至

30µL之间的反应体积。

5）确认ExcessReactionVolume（额外反应体积）字段中显示10%。

包括额外反应体积以弥补移液过程中的损失。

建议至少准备10%的额外反应体积。

6）在ReactionsforRNaseP（RNaseP反应）窗格中：

a.确认MasterMixConcentration（母液浓度）字段中显示2.0X。

b.确认AssayMixConcentration（检测预混液浓度）字段中显示20.0X。

c.查看PCR反应的组分和计算的剂量。

7）在StandardDilutionSeriesforRNaseP（RNaseP的标准品稀释序列）窗格中：

a.单击StandardConcentrationinStock（储液中标准品的浓度）字段，然后输入20000。

b.单击units（单位）字段，然后输入copiesperµL。

c.查看为准备标准品稀释序列计算的剂量。

完成SampleDilutionCalculations（样本稀释计算）选项卡

1）选择SampleDilutionCalculations（样本稀释计算）选项卡。

2）单击DilutedSampleConcentration（10XforReactionMix）（稀释后样本浓度）（对于反应预混液为10X），然后输入6.6。

3）从单位下拉菜单中，选择ng/µL（默认）。

4）查看为样本稀释计算的剂量。

8、实验材料订购

在MaterialsList（材料列表）屏幕上，查看建议用于准备PCR反应板的材料列表。

或者，您可从AppliedBiosystemsStore（AppliedBiosystems产品仓库）订购所建议的材料。

创建购物篮，向购物列表中添加项目，然后登录以提交您的订单。

您必须具有不受限制的网络连接才能访问AppliedBiosystemsStore（AppliedBiosystems产品仓库）。

1）在AppliedBiosystemsStore（AppliedBiosystems产品仓库）网站上查找靶检测套件：

a.确保您的计算机已连接到因特网。

b.单击EnterGeneName（输入基因名）字段，输入RNaseP，然后单击FindAssay（查找检测套件）。

c.在FindAssayResults（发现检测套件结果）对话框中，选择您的检测套件。

d.单击ApplyAssaySelection（应用检测套件选择）。

2）完成ExperimentMaterialsList（实验材料列表）窗格：

a.从Display（显示）下拉菜单中，选择AllItems（所有项）（默认），然后查看建议的材料。

若需要，使用右侧的滚动条查看所有项。

3）用于进行定量实验的Inventoried/MadetoOrder检测设计用于配合以下TaqMan®母液使用：

TaqMan®FastUniversalPCRMasterMix（2✕）,NoAmpErase®UNG，

250次反应，编号

TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix，200次反应，编号

TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix，2000次反应，编号

10包装TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix，编号

TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase®UNG，200次反应，编号

TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix,NoAmpErase®UNG，

2000次反应，编号

10包装TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix，NoAmpErase®

UNG，编号

4）靶DNA或cDNA有几种TaqMan和SYBRGreen试剂可用于定量实验。

a.TaqMan®试剂

TaqMan®FastUniversalPCRMasterMix（2✕）,No

AmpErase®UNG，250次反应

TaqMan®2✕UniversalPCRMasterMix，200次反应，编号

TaqMan®2