大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计.docx

1、大肠杆菌基因组DNA的提取及荧光定量PCR试验设计大肠杆菌基因组DNA的提取一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。1、实验原理提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、

2、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。2、实验试剂与仪器1）实验材料：大肠杆菌2）实

3、验试剂：LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl，CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅3、溶液配制1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L，细菌培养用酵母提取物5 g/L，NaCl 10g/L，去离子水。 (搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121，1.034105 pa高压下蒸汽灭菌20min.)2）TE缓冲液：1M Tris 溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶

4、解）1M tris-HCl pH8.0 溶液（取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用）TE缓冲液（10 mM Tris-HCl 1Mm EDTA pH=8.0，1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml0.5M EDTA PH =8.0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存）3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20备用）4）CTAB/NaCl溶液：（5% w/v，5gCTAB溶于100ml 0.5M Na

5、Cl溶液中，需加热到65使之溶解，然后室温保存） 4、实验方法步骤1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。2、取菌液1.5ml置于离心管中，以5000rpm冷冻离心1min，弃上清液3、加190 ul TE悬浮沉淀，并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀，37保温1小时。5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀。6、加30ul CTAB/NaCl溶液，混匀，65保温20min7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1），5000rmp离心10min8

6、、取上清液，加入300ul氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000rmp离心10min9、取上清液，加入300ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止10min，沉淀DNA，5000rmp离心10min10、加500ul 70%乙醇洗沉淀，5000rmp离心10min11、弃上清液，待酒精挥发尽后加30ulTE溶解12、溶解于20ul TE中，-20保存。二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。细菌基因组DNA提取试剂盒：1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒DP302-02 50次 420元2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRa DV810A 50 650元3、Biomiga

7、细菌基因组DNA提取试剂盒GD2411-01 Bacterial gDNA kit 50次 423元GD2411-02 Bacterial gDNA kit 250次 1798元4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒BSC12S1 50次 400元 BSC12M1 100次 750元5、OMEGA细菌基因组DNA提取试剂盒D3350-00 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 5 210元D3350-01 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 50 980 元D3350-02 E.Z.N.A.TM Bacterial DNA kit 200

8、3350元荧光定量PCR试验（标准曲线法）定量实验是一种实时实验，用于在聚合酶链反应 (PCR) 的每个扩增循环期间测定靶核苷酸序列 （靶）数量。其中靶可以是 DNA、 cDNA 或 RNA。【实验原理】在实时定量实验中，反应是在 PCR 产物的扩增达到固定荧光水平时的循环期间时间点来描述的，而不是在固定循环次数后累积的 PCR 产物最终数量来描述。扩增曲线以图形形式显示在执行的循环次数中检测到的荧光。 在 PCR 的最初几次循环中，荧光信号没有明显变化。该预定义的 PCR 循环范围称为基线。首先，软件通过计算归一化报告荧光信号强度 （与基线循环相对应的 Rn 值）的数学趋势，生成一个基线简化

9、扩增曲线。然后，算法将搜索扩增曲线上基线校准后归一化报告荧光信号强度 （ delta Rn Rn 值）与阈值交叉的点。 Rn 值与阈值交叉的分数循环定义为 CT。一、试验设计使用StepOne软件中的Design Wizard（设计导向）创建新实验1、定义实验属性在 Experiment Properties （实验属性）屏幕上，输入实验的标识信息，然后选择要设计的实验类型。1）Experiment Name （实验名称）。2）Barcode （条码），然后输入您的 PCR 反应板上的条码。（可不填）3）User Name （用户名）。4）Comments （注释）。（可不填）5）选择 Qua

10、ntitation （定量）实验类型6）Next （下一步）2、定义方法和材料在 Methods & Materials （方法和材料）屏幕上，选择用于实验的定量方法、试剂、升降温速度和 PCR 模板。1）将 Standard Curve （标准曲线）选为定量方法。将 Standard Curve （标准曲线）选为定量方法。 标准曲线实验确定样本中靶序列的绝对量。 从已知量的稀释序列中构建的标准曲线用于归档结果。 当设置反应板时，标准曲线方法需要靶、标准品和样本。用于标准曲线实验的 PCR 反应包括以下组分： 样本 其中靶数量未知的样本。 标准品 数量已知的样本。 标准品稀释序列 一组用于构建

11、标准曲线的标准品稀释液 （例如，1:2、1:4、 1:8、 1:16、 1:32） 。 重复数 含有相同组分和量的相同反应数。 阴性对照 含有水或缓冲液的样本，不含模板；也称为 “无模板对照(NTC)”。阴性对照应不会扩增。2）为试剂选择 TaqMan Reagents （ TaqMan 试剂）（包括两个引物一个探针） 。如果使用 TaqMan 试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择TaqMan Reagents （ TaqMan 试剂） 。 TaqMan 试剂包括两个引物和一个TaqMan 探针。 引物设计用于扩增靶。 TaqMan 探针设计用于杂交靶，并在扩增靶时产生荧光信号。切记！

12、Applied Biosystems 不建议将 TAMRATM 染料随 StepOneTM 系统用作荧光报告基团或淬火基团。如果使用 SYBR Green 试剂以检测扩增并定量样本中靶的数量，则选择 SYBR Green Reagents （ SYBR Green 试剂）。 SYBR Green 试剂包括两个引物和 SYBR Green 染料。 引物设计用于扩增靶。 SYBR Green 染料可在结合到双链 DNA 时产生荧光信号。 SYBR Green 染料通常是添加到反应的SYBR Green 母液的一部分。 如果使用 SYBR Green 染料：选择 Include Melt Curve

13、 （包括解链曲线）以执行扩增靶的解链曲线分析。将 Standard （标准）选为升降温速度。 Applied Biosystems 不提供 SYBRGreen 试剂的 Fast 母液。3）为升降温速度选择 Standard (2 hours to complete a run) （标准 （约两小时完成运行） 。 如果为 PCR 反应使用 Fast 试剂，则选择 Fast (40 Minutes toComplete a Run) （快速 （约 40 分钟完成运行） ）。 如果为 PCR 反应使用标准试剂 （包括 SYBR Green 试剂和 TaqMan 试剂） ，则选择 Standard (

14、2 Hours to Complete a Run) （标准 （约 2 小时完成运行） 。4）为模板类型选择 gDNA (genomic DNA) （ gDNA （基因组 DNA） ） 。5）Next （下一步） 。3、设置靶在 Targets （靶）屏幕上，输入您想在 PCR 反应板中定量的靶数量，然后为每个靶设置检测。1）单击 How many targets do you want to quantify in the reaction plate? （您想在反应板中定量多少靶？）字段，然后输入 1（根据需要填）。注意： 靶检测表中的行数将以您输入的数字更新。2）选择 Set Up St

15、andards （设置标准品）复选框，以为靶检测设置标准品。建议反应板中的每个靶检测设置一条标准曲线。注意： Set Up Standards （设置标准品）复选框默认情况下已选取。3）设置靶 1 检测：a. 单击 Enter Target Name （输入靶名称）单元格，然后输入 RNase P（示例）。b. 从 Reporter （报告基团）下拉菜单中，选择 FAM （默认） 。 如果要将 FAMTM 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5 端，则选择FAM。 如果要将 JOETM 染料加在您用于检测靶的 TaqMan 探针的 5 端，则选择JOE。 如果要将 VIC 染料加在您

16、用于检测靶的 TaqMan 探针的 5 端，则选择VIC。 如果您正使用 SYBR Green 染料以检测双链 DNA，则选择 SYBR。c. 从 Quencher （淬火基团）下拉菜单中，选择 NFQ-MGB （默认） 。 如果要将非荧光淬火基团小沟结合物加在您正用于检测靶的 TaqMan 探针的 3 端，则选择 NFQ-MGB。 如果您正使用 SYBR Green 染料，则选择 None （无） 。4）Next （下一步） 。4、设置标准品在 Standards （标准品）屏幕上，为所有标准曲线输入反应板中的点数和重复数。对于每条标准曲线，输入起始量并选择序列倍数。1）单击 How man

17、y points do you need for each standard curve? （每条标准曲线您需要多少个点？）字段，然后输入 5。建议每条标准曲线应至少有五个稀释点。2）单击 How many replicates do you need for each point? （每个点您需要多少次重复反应？）字段，然后输入 3。建议每个点三次重复反应。3）为 RNase P （示例）检测定义标准品数量范围：a. 单击 Enter Starting Quantity （输入起始量）字段，然后输入 10000。由于标准品数量的范围会影响扩增效率计算，因此应仔细为您的检测考虑标准品数量的适当

18、范围： 为了更准确地测量扩增效率，请使用大范围的标准品数量，扩大到 5 个至6 个对数级之间。 如果您为标准品指定大范围的数量，您需使用 PCR 产物或高度浓缩的模板，如 cDNA 克隆。 如果您的 cDNA 模板数量有限且/或靶是低拷贝数转录物，或已知在给定范围之内，则可能需要小范围的标准品数量。b. 从 Select Serial Factor （选择序列倍数）下列菜单中，选择 1:2。序列倍数用于计算标准曲线所有点中的数量。 如果您的起始数量是最高数量，则选择如 1:2、 1:3 之类的稀释倍数。 如果您的起始数量是最低数量，则选择如 2X、 3X 之类的浓缩倍数。4）查看 Standa

19、rd Curve Preview （标准品曲线预览）窗格。 标准曲线应包含如下点：10000、 5000、 2500、 1250 和 625。5）Next （下一步） 。5、设置样本在 Samples （样本）屏幕上，输入反应板中要包括的样本、重复数和阴性对照数，然后选择样本/靶反应以进行设置。1）单击 How many samples do you want to test in the reaction plate? （您想在反应板中检测多少样本？）字段，然后输入 2。（根据需要填）2）单击 How many replicates do you need? （您需要多少次重复反应？）字段，

20、然后输入 3。建议对每个样本反应重复三次反应。3）单击 How many negative controls do you need for each target assay? （每个靶检测您需要多少阴性对照？） ，然后输入 3。建议对每个靶检测进行三次阴性对照反应。4）4. 设置样本 1：a. 单击 Enter Sample Name （输入样本名）字段，然后输入 pop1 （用于重复组 1） 。b. 保留 Color （颜色）字段中的默认设置。5）设置样本 2：a. 单击 Enter Sample Name （输入样本名）字段，然后输入 pop2 （用于重复组 2） 。b. 保留 Col

21、or （颜色）字段中的默认设置。6）选择 All Sample/Target Reactions （所有样本/靶反应）以检测所有样本中的所有靶。 选择 All Sample/Target Reactions （所有样本/靶反应）以检测所有样本中的所有靶。 选择 Specify Sample/Target Reactions （指定样本/靶反应）以指定每个样本中要检测的靶。7）在 Well Count （反应孔数）窗格中，确认存在： 6 个未知反应孔U 15 个标准品反应孔S 3 个阴性对照反应孔N 24 个空反应孔8）在 View Plate Layout （查看检测板布局）选项卡上：a. 从

22、 Arrange Plate by （反应板布局方式）下拉菜单中，选择 Rows （按行）（默认） 。b. 从 Place Negative Controls （放置阴性对照）下拉菜单中，选择 Upper Left（左上角） （默认） 。9）Next （下一步） 。6、设置运行方式在 Run Method （运行方法）屏幕上，查看默认运行方法的反应体积和温度变化过程设置。 若需要，您可调整默认运行方法或用 Run Method （运行方法）库中的某种方法进行替换。1）单击选择 Graphical View （图形视图）选项卡 （默认）或 Tabular View （表格视图）选项卡。2）单击

23、Reaction Volume Per Well （每个反应孔的反应体积）字段，然后输入 25 L。为 “反应体积/反应孔”输入介于 10 至 30 的值。 StepOne 系统支持 10 至30 L 之间的反应体积。3）确保温度变化过程设置显示保持和循环阶段。 确保温度变化过程设置适合试剂。 如果正执行一步法 RT-PCR 扩增，则包括一个反转录步骤。如果实验需要一个不同的温度变化过程设置，调整温度变化过程设置或用Run Method （运行方法）库中的某个温度变化过程设置进行替换。 Run Method（运行方法）库包括在 StepOne 软件中。4）Next （下一步） 。7、查看反应设

24、置在 Reaction Setup （反应设置）屏幕上，选择检测类型 （如果使用 TaqMan 试剂），然后查看为准备 PCR 反应、标准稀释序列和样本稀释而计算的剂量。 若需要，您可调整反应体积、额外反应体积、组分浓度、标准品浓度和/或稀释后样本浓度。切记！ 对反应板中的每个靶检测执行这些步骤。完成 Reaction Mix Calculations （反应预混液计算）选项卡1）选择 Reaction Mix Calculations （反应预混液计算）选项卡 （默认）。 2）从 Select Target （选择靶）窗格中，选择 RNase P。3）从 Assay Type （检测类型）下

25、拉菜单中，选择 Inventoried/Made to Order（库存/定制） 。如果正使用 TaqMan 试剂，选择所使用的检测类型： 如果正使用 Applied Biosystems TaqMan Gene Expression Assays （库存/定制）或 Applied Biosystems Custom TaqMan Gene Expression Assays，则选择 Inventoried/Made to Order （库存/定制）。 如果正使用 Primer Express 软件设计检测，则选择 Custom（定制）。4）确认 Reaction Volume Per Wel

26、l （每个反应孔的反应体积）字段中显示 25 L。为 “反应体积/反应孔”输入介于 10 至 30 的值。 StepOne 系统支持 10 至30 L 之间的反应体积。5）确认 Excess Reaction Volume （额外反应体积）字段中显示 10%。包括额外反应体积以弥补移液过程中的损失。建议至少准备 10% 的额外反应体积。6）在 Reactions for RNase P （ RNase P 反应）窗格中：a. 确认 Master Mix Concentration （母液浓度）字段中显示 2.0X。b. 确认 Assay Mix Concentration （检测预混液浓度）字

27、段中显示 20.0X。c. 查看 PCR 反应的组分和计算的剂量。7）在 Standard Dilution Series for RNase P （ RNase P 的标准品稀释序列）窗格中：a. 单击 Standard Concentration in Stock （储液中标准品的浓度）字段，然后输入 20000。b. 单击 units （单位）字段，然后输入 copies per L。c. 查看为准备标准品稀释序列计算的剂量。完成 Sample Dilution Calculations （样本稀释计算）选项卡1）选择 Sample Dilution Calculations （样本稀释

28、计算）选项卡。2）单击 Diluted Sample Concentration (10X for Reaction Mix) （稀释后样本浓度）（对于反应预混液为 10X） ，然后输入 6.6。3）从单位下拉菜单中，选择 ng/L （默认） 。4）查看为样本稀释计算的剂量。8、实验材料订购在 Materials List （材料列表）屏幕上，查看建议用于准备 PCR 反应板的材料列表。或者，您可从 Applied Biosystems Store （ Applied Biosystems 产品仓库）订购所建议的材料。 创建购物篮，向购物列表中添加项目，然后登录以提交您的订单。 您必须具有不受

29、限制的网络连接才能访问 Applied Biosystems Store （ AppliedBiosystems 产品仓库） 。1）在 Applied Biosystems Store （ Applied Biosystems 产品仓库）网站上查找靶检测套件：a. 确保您的计算机已连接到因特网。b. 单击 Enter Gene Name（输入基因名）字段，输入 RNase P，然后单击 FindAssay （查找检测套件） 。c. 在 Find Assay Results （发现检测套件结果）对话框中，选择您的检测套件。d. 单击 Apply Assay Selection （应用检测套件选择

30、） 。2）完成 Experiment Materials List （实验材料列表）窗格：a. 从 Display （显示）下拉菜单中，选择 All Items （所有项） （默认） ，然后查看建议的材料。 若需要，使用右侧的滚动条查看所有项。3）用于进行定量实验的Inventoried/Made to Order 检测设计用于配合以下 TaqMan 母液使用：TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2), No AmpErase UNG，250 次反应，编号TaqMan 2 Universal PCR Master Mix， 200 次反应，编号TaqMa

31、n 2 Universal PCR Master Mix， 2000 次反应，编号10 包装 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix，编号TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG，200 次反应，编号TaqMan 2 Universal PCR Master Mix, No AmpErase UNG，2000 次反应，编号10 包装 TaqMan 2 Universal PCR Master Mix， No AmpEraseUNG，编号4）靶DNA 或 cDNA有几种 TaqMan 和 SYBR Green 试剂可用于定量实验。a.TaqMan 试剂 TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2), NoAmpErase UNG， 250 次反应TaqMan 2 Universal PCR Master Mix， 200 次反应，编号TaqMan 2