KX078芒果苷的提取与分离研究.docx

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KX078芒果苷的提取与分离研究

摘要

芒果叶为漆树科植物芒果的干燥叶，含有止咳化痰作用的有效成分芒果苷[1]，是生产芒果止咳片、银花芒果颗粒剂等中成药的主要原料。

芒果苷的现代药理研究表明，其还具有免疫调节、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等作用[2-4]。

本实验采用聚酰胺对芒果叶的总黄酮物质进行分离提纯，重点考察此过程中利用再生聚酰胺分离芒果苷的效果，然后采用红外光谱法、高效液相色谱等方法进行纯度分析。

实验结果表明，芒果叶经过酒精提取，再生后的聚酰胺柱仍能分离得到纯度较高的芒果苷。

在分离纯化的过程中，酒精的浓度以及含量，聚酰胺的再生处理以及实验时间等等都对实验有较大的影响。

关键词：

芒果叶；芒果苷；聚酰胺；分离精制

abstract

Mangoleavesdrysumacleavesofplants,Theroleofcontainingtheactiveingredientincoughandphlegmisinsidemangiferin,Itistheproductionofcoughmangoslices,mangoYinhuathemainrawmaterialofproprietaryChinesemedicinesparticulateagentsMangiferinmodernpharmacologicalstudieshaveshownthatItalsohasimmunomodulatory,antimicrobial,anti-virus,anti-tumoreffectsInthisstudy,polyamideresin，mangoleavesontheseparationandpurificationoftotalflavonoids,andthenanalyzedbyhighperformanceliquidchromatographypurity.Theresultsshowedthatmangoleavesafteralcoholextraction,separationandpurificationofpolyamidecolumnwithhighpuritycanbemangiferin.Intheextractionandpurificationprocess,thealcoholconcentrationandcontent,processingandrecyclingofpolyamideexperimentaltime,andsoareagreatinfluenceontheexperiment.

Keywords:

Mangoleaves;mangoglycosides;extraction

芒果苷的提取与分离研究

1绪论

1.1前言

芒果苷（mangiferin），又名芒果素、知母宁，分子式为C19H18O11，分子量为422，熔点267～272℃，在紫外检测下240nm，258nm，316 nm，366 nm有明显的吸收，淡灰黄色针状结晶（50%乙醇）。

熔点267～272℃（分解）。

旋光度+43.3°（c=0.9，吡啶），32°（乙醇）。

略溶于甲醇、乙醇、水、可溶于热稀甲醇、热稀乙醇，不溶于非极性溶剂，与fecl3试剂反应呈污绿色，对Hcl-mg反应呈橙红色。

芒果苷是一种四经基毗酮的碳糖昔，属双苯毗酮类黄酮类化合物，在多种植物中存在，芒果苷具有广泛的药理活性，除了传统意义上的抗氧化，抗炎，抗变态反应，抗病毒，保肝等生物活性外，近年来对其治疗糖尿病，降血脂，免疫调节以及抗治疗肿瘤作用的研究日趋深入，开发芒果苷作为治疗糖尿病，降血脂，治疗自身免疫性疾病以及防治肿瘤药物的前景十分广阔[6]。

因此，芒果苷制品将更受人们欢迎而获得迅速发展。

1.2芒果苷药理作用研究概况

1.2.1对中枢神经系统的作用

芒果苷具有明显的中枢神经系统兴奋作用，50~100mg/kg剂量的芒果苷腹腔注射可使所有受试动物出现动作震颤、竖毛、强迫性撕打和自主活动增加等症状。

黄华艺等[7]的研究认为，芒果苷具有清除脑组织中过氧化脂质的作用，减轻过氧化脂质对神经元的损伤，从而保护神经元的正常功能。

1.2.2对呼吸系统的作用

邓家刚等[8]的研究表明，芒果苷对豚鼠组胺、乙酰胆碱混合引喘有明显延长引喘潜伏期作用；对小鼠浓氨水引咳可明显延长引咳潜伏期，并明显减少小鼠咳嗽次数;对小鼠醋酸所致腹腔毛细血管通透性增高有明显抑制作用；对小鼠气管酚红排泌有明显促进作用。

芒果苷具有肾上腺糖皮质激素样抗炎作用，可降低毛细血管通透性，其抗炎反应率达38%。

1.2.3对心血管系统的作用

1~2mg剂量的芒果苷对正常或功能低下的离体Ringer's液灌注蛙心均有短暂，确切的增强心肌收缩力的作用，且该作用不被普萘洛尔所阻断。

因此，它可能是一种心脏直接刺激剂[8]。

在心肌缺血再灌注损伤中，芒果苷能清除心肌缺血再灌注产生的NO和活性氧，降低缺血再灌注心脏冠状动脉流出物中乳酸脱氢酶和肌酸激酶的活力，保护心肌缺血再灌注损伤，0.1mmol/L芒果苷的保护作用与1500U/mlSOD和过氧化氢酶相同[9]。

1.2.4抗病毒作用

Zheng等[10]使用组织培养技术研究了芒果苷在单纯疱疹病毒中的抗病毒效应，表明芒果苷具有体外抗I型单纯疱疹病毒（HSV-I）作用，空斑减少率为56.8%，其抗病毒作用归因于它抑制细胞内病毒复制的能力。

1.3芒果苷的常用提取和纯化方法

1.3.1有机溶剂萃取

这是目前国内外使用最广泛的方法，很容易实现工业化生成。

其原理是利用黄酮类化合物与混入杂质极性不同，选用不同的溶剂萃取。

常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等，一般采取乙醇为提取溶剂。

高浓度的乙醇（如90%~95%）适于提取苷元，浓度60%左右的乙醇适于提取苷类。

提取次数一般为2~4次，提取方法有热回流提取和冷浸提取两种方式。

传统的热回流提取法具有成本低、安全性高、适合工业生产等优点。

缺点是：

①总黄酮提取率低；②温度过高导致部分黄酮类化合物分解；③由于提取溶剂中含水，在加热状态下，一些溶于水的杂质如糖类、蛋白质等一并进入提取液中，加大了进一步分离的困难。

1.3.2热水提取

此方法只限于提取苷类。

虽然设备简单，但因提取杂质多、黄酮收率低，故不常使用。

1.3.3碱性稀醇或碱性水提取

黄酮类成分大多具有酚羟基，可用碱性水或碱性稀醇浸出，浸出液经酸化后析出类黄酮化合物。

需要注意的是，应用此方法时，所用碱的浓度不宜过高，以免在强碱条件下加热破坏黄酮类化合物的母核。

1.3.4系统溶剂提取

用极性由小到大的溶剂依次提取，可以提取出大多数游离的黄酮化合物，但此法目前仅用于实验室，很难工业化。

1.3.5超滤法提取

选用超滤法可以提高提取物的纯度，并且在提取生产过程中，可以减少废水排放，避免臭水、污水产生，环保且降低生产成本。

2实验部分

2.1芒果叶中总黄酮的提取

2.1.1材料仪器与试剂

试剂：

分析纯无水乙醇、石油醚、柠檬酸、蒸馏水等

材料：

芒果叶（采自广东海洋大学校园内，洗净晾干切碎备用）

2.1.2实验仪器设备

UNICUV-2202紫外可见分光光度计

SHB循环水式多用真空泵

RE-52C型旋转蒸发器

PHS-3C型数字酸度计

恒温水浴锅等。

2.1.3总黄酮提取方法

工艺流程：

芒果叶粉碎→多次乙醇回流提取→滤液合并→滤液浓缩→石油醚萃取。

操作步骤：

将芒果叶阴干切碎后,称取500克投入提取锅,加入70%的乙醇于油浴中回流提取三次,第一次用13L乙醇提取1.5小时，第二次用13L乙醇提取1小时,第三次用10L乙醇提取1小时，合并提取液。

真空浓缩至膏状,置于干燥箱内80℃干燥成干膏。

将提取所得的干膏置于500ml圆底烧瓶中，加入100ml石油醚，搅拌萃取，倒出石油醚层，重复萃取，直至石油醚层无青色，收集萃余部份于80℃干燥箱内烘干。

2.1.4实验结果

经过回流提取，干燥浓缩后，得到粗黄酮称得重量为135.97g。

.

2.2聚酰胺柱分离芒果苷

2.2.1材料，仪器与试剂

材料芒果叶总黄酮提取物，聚酰胺，微孔滤膜

试剂无水乙醇，蒸馏水，氢氧化钠，醋酸，甲醇

仪器UV-2102p紫外可见分光光度计

SHZ-D循环水式真空泵

EV201旋转蒸发器

HH-S恒温水浴箱

DZF-6050真空干燥箱

GZX-9140MBE酒精比重计

药物天平，数显鼓风干燥箱，安捷伦液相色谱仪，红外光谱仪

2.2.2聚酰胺树脂的再生处理

树脂使用一段时间后受到污染导致吸附能力下降，需要再生以恢复其吸附能力，用过的聚酰胺由于受到污染，吸附了很多杂质，因此失去了其本来的颜色，为棕黄色，有粘性，用过的聚酰胺树脂先用95%乙醇浸泡48h后，过滤，粘性减小，然后用蒸馏水洗至流出的水无酒精味，再用1%NaOH浸泡24h，滤掉上层碱液，以蒸馏水洗至中性后用4倍量10%醋酸浸泡24h，再用蒸馏水洗至中性并浸泡备用[15]。

当其pH为7并且无酒精味时表示已经处理好了，经过再生处理后的聚酰胺，主链上带有的酰胺基团具有较强的极性，在大分子链聚集时，易形成氢键，因此分子间相互作用力较大，易结晶，致使材料的力学性能优良，并具有较高的熔点，是一种较优良的工程塑料，具有较优良的摩擦和耐磨性能，有一定的自润滑性，可在100度以下使用，耐热性较好，化学稳定性较好，耐各种熔剂及油类，可耐海水，但不耐酸，高温下可溶解于浓硫酸中，燃烧时可自熄，有异味，制品无毒，无臭，不易霉烂，吸水性大，可影响尺寸的稳定性，如果采用玻璃纤维增强则可减少吸水率，电性能良好，但要注意受吸水率的影响。

2.2.3样品装柱

一般每100ml体积的聚酰胺上样1.5到2.5g，根据量取得实验所用的聚酰胺积为1496ml，所以本实验中称取含黄酮芒果叶醇提干膏量30g进行实验。

取已处理好的聚酰胺，用蒸馏水湿法装柱，，并用充足的蒸馏水冲洗，让其充分沉降，使聚酰胺紧密，而达到使实验顺利进行，取已经准确称量的芒果叶总黄酮干膏30g加入少量水加热溶解，再加入少量聚酰胺搅拌，充分吸附后，真空挥去水分，上样到装好的聚酰胺柱中，在聚酰胺柱中的需要分离的总黄酮上加盖滤纸。

2.2.4样品洗脱

首先，用适量的水洗，除去极性较大杂质成分，并用20%NaOH溶液和紫外色谱检测跟踪黄酮类成分的洗脱情况。

当洗脱至洗脱溶液使NaOH溶液变成青绿色，在紫外检测下240nm，258nm，316nm，366nm有明显的吸收（扫描）换35%乙醇洗脱至大约24倍量，并紫外监测。

浓缩洗脱液，放置冰箱中冷却结晶备用。

2.2.5用乙醇萃取重结晶

将上面所得的晶体，以1：

700（g:

mL）比例加入50%的乙醇溶解，过滤弃去不溶物。

真空回收乙醇浓缩至出现少量不溶颗粒，倒出置于冰箱结晶24小时。

然后用微孔滤膜过滤，弃去滤液，收集晶体，于干燥箱中恒温50℃烘干。

2.2.6纯度检查及含量测定

芒果苷高效液相色谱分析含量测定采用归一化法，通过主峰面积和杂质峰面积比，进行纯度分析。

取35%乙醇洗脱所得结晶适量，用适量的流动相溶解，采用RP-HPLC法， C-18柱分离。

流动相：

甲醇一0.05 mol／L-1 磷酸（三乙胺调pH为3．5）65：

134，检测波长258 nm，柱温为室温，流速0.5mL?

min-1 。

以各结晶中芒果苷含量及纯度为分析指标，分析乙醇洗脱所得的结晶。

2.2.7红外光谱分析

利用物质对红外光波的吸收不进行定性及定量的，不同的物质具有不同的化学键，其吸收波长不同，而对光波吸收的多少与物质的量成正比的原理，对芒果苷的红外吸收光谱分析

2.2.8熔点测定

当晶体加热到一定温度时，随即从固态转变为液态，此时的温度可视为该物质的熔点，本实验用毛细管熔点测定，方法如下：

a．样品的干燥和研磨b．装样（把两头封闭长度约10到12cm的熔点管中间割裂，开口的一端插入样品粉末中，装样约高3到4mm，倒转填紧后，样高2~3mm）c．把装样品的毛细管附于温度计上（样品部分在水银球中部）d．放入热浴（温度计水银球在热浴中部，水银球不能碰瓶底也不能离开热浴液面）e．加热、控温（开始升温可快，接近熔点10℃时，控制升温速度1至2℃/minf．观察熔点（始熔：

固体收缩，当样品开始塌落并出现液相时，即为始熔；全熔：

固体完全消失而成透明的液体时，即为全熔）g．记录结果（熔点范围，即始熔至全熔温度）。

重复以上结果三次，求平均值

3结果与讨论

3.1实验结果

3.1.1聚酰胺洗脱

样品在聚酰胺柱中进行洗脱过程中，用紫外分光光度法进行检测，按时间顺序得到以下不同时间段的图谱：

其中a图为蒸馏水洗脱时聚酰胺柱中分离出物质的图谱，b1，b2，b3为用乙醇洗脱时分离出的物质图谱，其中在b3洗脱液前用20%NaOH进行测定洗脱液为洗脱液的本色，在b3后用变成青绿色，用35%乙醇洗脱至大约24倍量，并紫外监测当检测到的物质发生变化时，停止洗脱。

浓缩洗脱液，放置冰箱中冷却结晶备用。

图1水的洗脱液UV图谱如下图所示：

图235％醇的洗脱液B1UV图谱

图335％醇的洗脱液B2UV图谱

图435％醇的洗脱液B3UV图谱

B3为芒果苷的紫外图谱，在240nm，258nm，316 nm，366 nm有明显的吸收，在B3洗脱液之前洗脱出的物质不是芒果苷，在其后检测出的物质为芒果苷，说明聚酰胺对芒果苷的吸附比较强，较难洗脱。

当洗脱至洗脱溶液使NaOH溶液变不成青绿色，在紫外检测下240nm，258nm，316 nm，366 nm没有明显的吸收（扫描）时，停止洗脱，将洗脱出的含有芒果苷的的溶液进行真空浓缩，放至冰箱中24小时结晶，抽滤称量：

1.6g粗品。

用0.9g用乙醇萃取重结晶，干燥称量：

0.5g，没有进行重结晶的粗芒果苷干燥后：

0.4g，具体分析如下表格：

项目

芒果叶

提取出的芒果浸膏

试验用到的芒果浸膏

粗分离的芒果苷

实验用到的粗提取芒果苷量

重结晶后得到的芒果苷

收率

重量＼g

500

135.9

30

1.6

0.9

0.5

5.24％

3.1.2高效液相色谱分析

取35%乙醇洗脱所得结晶适量，用适量的流动相溶解，采用RP-HPLC法， C-18柱分离。

流动相：

甲醇一0.05 mol?

L-1 磷酸（三乙胺调pH为3．5）65：

134，检测波长258 nm，柱温为室温，流速0.5mL∕min-1 ，测得到的结果如下图：

根据归一化法得出，芒果苷的纯度为97.7395％.

3.1.3红外色谱分析

标准的芒果苷的红外吸收特征如下，3360,3155（肩峰，oh）,1652（共扼c=0），1618，1565，1492（苯环c=c），1hnmr（dmso-d6,500mhz）δppm：

13.73（1h,s，c1-oh）,10.42（3h,br.s,c3-oh,c6-oh,c7-oh）,6.42（1h，s），6.90（1h，s），7.45（1h，s）（芳环的三个氢），4.75（1h，d，j=10hz）（糖端基c1-h），3.2～3.8（5h,m,糖上其余氢）；13cnmr（dmso-d6,500mhz）δppm：

161.6（c-1），107.3（c-2），163.8（c-3），93.5（c-4），156.3（c-4a），150.9（c-4b），102.7（c-5），153.9（c-6），143.7（c-7），108.2（c-8），111.8（c-8a），101.4（c-8b），179.2（c=o），81.5（糖c-1），73.2（糖c-2），70.5（糖c-3），70.3（糖c-4），79.0（糖c-5），61.4（糖c-6）。

下图为实验所得的芒果苷红外光谱图：

图6样品红外标准图谱

图7芒果苷红外标准图谱

从图中可以对比出，用标准品做的红外图谱和样品的红外图谱大体相同，但是也有差别，其原因如下，样品干燥不够，所含水分比标准品多，由于实验条件的限制和个人经验知识水平等原因，样品的含量不能够达到百分之百的含量，所有样品的红外图谱与标准品会有差别。

3.1.4熔点的测定记录

文献表明，芒果苷的熔点267～272℃（分解），略溶于甲醇、乙醇、水、可溶于热稀甲醇、热稀乙醇，不溶于非极性溶剂，

第一次测定

第二次测定

第三次测定

平均值

269℃

268℃

269℃

268.3℃

实验测得数据符合文献资料所写的熔点，再一次验证了芒果苷的熔点。

3.2讨论

1.精制所得芒果苷熔点、UV图谱、IR图谱、高效液相分析证明所得精品是芒果苷，含量在97.5%以上。

2.结表明，从芒果叶中大量提取高纯度芒果昔是可行的，本文的研究为芒果苷分离精制生产提供了简洁途径。

3.结果表明，芒果苷收率较低，如果用应于生产，很多因素以及技术尚有待改进。

4.影响提取以及纯化的因素很多，从原料、提取溶剂到提取条件、脱色条件，每一步都影响到提取效率。

本实验根据已有的资料，找到最佳的提取条件，但是如果用应与工艺生产，有待进一步检验。

5.芒果叶药材资源非常丰富，且具有分布地域广，原料易得，价格低廉，甚至四季可采等优点。

但目前利用芒果叶开发的制剂品种为数甚少，剂型单一，更加限制其临床应用。

如何充分、合理开发芒果叶资源，为其临床应用提供充分的药学、药理学依据，还有待在系统的药效学、药代动力学、分子药理学和制剂学等方面进行进一步的研究工作。

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