高表达JNK3增进表阿霉素诱导的细胞凋亡.docx
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高表达JNK3增进表阿霉素诱导的细胞凋亡
高表达JNK3增进表阿霉素诱导的细胞凋亡
【摘要】目的：
构建人cJun氨基结尾激酶3（JNK3）真核表达载体，转染HEK293细胞，成立稳固表达细胞系；以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡关系.方式：
以pDBLeuJNK3质粒为模板PCR扩增人JNK3基因全长，DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体mycHisB，经PCR和酶切鉴定，DNA测序正确，脂质体转染法转染HEK293细胞，通过G418选择培育，成立稳固表达细胞系.RTPCR，WesternBlot检测携带Myc标签的JNK3融合蛋白的表达，流式检测表阿霉素对稳固表达JNK3基因的HEK293细胞的促凋亡作用.结果：
成功构建了JNK3真核表达载体并已稳固转入HEK293细胞，成立了稳固表达细胞系，成功地表达目的基因；与对照细胞相较表阿霉素能明显增进高表达JNK3基因的HEK293细胞发生细胞凋亡.结论：
JNK3稳固表达细胞系的成立和高表达JNK3增进表阿霉素诱导的细胞凋亡，为进一步研究JNK3的功能提供了良好的实验基础.
【关键词】CJum氨基结尾激酶真核表达载体转染因表细胞凋亡
0引言
cJun氨基结尾激酶（cJunNterminalkinases，JNKs）为丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivatedproteinkinase，MAPK）超家族之一.在脊椎动物，JNK由jnk1，jnk2，jnk3三种基因编码，表达的JNK1，JNK2，JNK3蛋白要紧位于细胞质，为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶.JNK3与JNK1，JNK2的不同在于：
JNK3有一个与位于JNK1，JNK2的N结尾保守的甲硫氨酸残基融合在一路的延长的N结尾区域［1］；JNK1，JNK2在组织内普遍表达，JNK3在脑、心脏、睾丸等组织特异表达.最近几年来研究发觉JNK3参与神经细胞凋亡的调控，可增进缺血、缺氧和有毒化学物质致使的神经细胞的凋亡.目前对JNK3促细胞凋亡机制还不是很清楚.咱们通过构建稳固转染JNK3基因的细胞系，以表阿霉素作为凋亡诱导剂研究JNK3与细胞凋亡的关系，为研究JNK3增进细胞凋亡机制提供细胞模型.
1材料和方式
材料菌株JM109，质粒pDBLeuJNK3，mycHisB和HEK293细胞由本实验室保留.DMEM，G418（Gibco公司）；胎牛血清（LifeTechnologies公司）；PCR及酶切产物纯化试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、反转录试剂盒（Promega公司）；DNAMarker，DNA限制性内切酶（EcoRⅤ，XhoⅠ）、pyrobestDNApolymerase，rTaq酶（TaKaRa公司）；T4DNA连接酶（NewEnglandBiolab公司）；Trizol、转染试剂脂质体lipofectamine2000（Invitrogen公司）；AnnexinⅤFITC试剂盒（晶美生物工程）；Myc抗体、actin抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG和ECL检测试剂（SantaCruz公司）；其余试剂均为国产分析纯.
方式
引物设计与合成依照GenBank登录的人JNK3基因的序列（序列号为NM_002753）设计引物,上游引物为：
5′ccggatatcATGAGCCTCCATTTCTTAT3′，下游引物为：
5′ccgctcgagCGCTGCTGCACCTGTGCTG3′，别离在上游引物和下游引物的5′端加入EcoRV，XhoI的酶切位点和3个爱惜碱基，引物由赛百盛公司合成.
人JNK3基因全长的获取以pDBLeuJNK3质粒为模板，采纳PCR扩增人JNK3基因，全长1269bp.PCR50μL反映体系中加pDBLeuJNK3质粒模板1μL，10×PCRBuffer5μL，mmol/LdNTPMix4μL,10μmol/LJNK3上下游引物各2μL，pyrobestDNApolymeraseμL，加无菌水至50μL.反映条件：
94℃5min；94℃30s，62℃30s，72℃80s，35个循环；72℃10min.PCR产物经10g/L琼脂糖凝胶电泳分离鉴定并胶回收纯化.
人JNK3真核表达载体的构建将上述PCR产物和mycHisB质粒别离用限制性内切酶EcoRⅤ和XhoⅠ酶切后，10g/L琼脂糖凝胶电泳分离、胶回收纯化，经T4DNA连接酶连接后转化JM109感受态，铺在含氨苄青霉素的LB平板上挑选，选取阳性克隆进行菌落PCR和酶切鉴定，阳性克隆经测序分析后证明并命名为JNK3.
成立稳固表达人JNK3的HEK293细胞系HEK293细胞在含100mL/L小牛血清的DMEM培育基中，于37℃，50mL/LCO2的饱和湿度下培育.待细胞融合至70％～80％时依照Lipofectamine2000操作说明书进行重组质粒JNK3和空质粒mycHisB的转染.转染48h后，用胰蛋白酶消化细胞，从头铺在直径为10cm的细胞培育皿中，待细胞贴壁后，换含有G418（1400mg/L）的选择性培育基加压培育2wk，每3d换液清除死亡细胞，待细胞培育皿中长出肉眼可见的单克隆时挑选单克隆并依次转移至96孔板、24孔板、6孔板、培育瓶内扩大培育.挑选出的稳固表达人JNK3和Myc标签的HEK293细胞系，别离命名为HEK293JNK3细胞和HEK293mock细胞.
检测JNK3的表达搜集HEK293JNK3细胞和HEK293mock细胞，按Trizol试剂说明书抽提细胞总RNA，按反转录试剂盒说明书进行反转录.取1μg定量后的RNA，加水补至10μL，70℃10min，加10×反映缓冲液2μL，MgCl24μL，dNTP2μL，OligodT1μL，rRNasinμL，AMV（15U）μL.反映体系共20μL；42℃1h；95℃5min；4℃5min.以GAPDH（900bp）为内参进行PCR反映.在25μLPCR反映体系中加入cDNA模板1μL，10×PCRBufferμL，mmol/LdNTP2μL，10μmol/LJNK3和GAPDH上下游引物各μL，rTaq酶μL，加水补足至25μL，反映条件为：
94℃5min；94℃30s，58℃30s,72℃80s，30个循环；72℃10min.取等体积RTPCR产物进行10g/L琼脂糖凝胶电泳分析.
Blot检测JNK3蛋白的表达搜集挑选细胞，用含蛋白酶抑制剂的单去污细胞裂解液裂解细胞，4℃，12000g，离心10min，搜集上清.对搜集的蛋白样品进行定量，取20μg处置后的蛋白样品进行SDSPAGE电泳，电转移至PVDF膜上，50g/L脱脂奶粉室温振荡封锁2h，与1∶2000稀释后的Myc一抗4℃孵育留宿，TBST洗膜3次.然后与1∶5000稀释后的HRP标记的二抗室温孵育1h，TBST洗膜3次，ECL显色系统检测目的蛋白，显影.
流式细胞术检测细胞凋亡对数生长期的HEK293JNK3细胞和HEK293mock细胞，调整细胞计数为2×108/L，接种于50mL细胞培育瓶中，常规培育24h后，同时加入终浓度为，，mg/L的表阿霉素，空白对照组加入等量DMEM，继续培育48h后搜集细胞，进行AnnexinV/PI标记：
将细胞悬浮于250μL结合缓冲液中，调细胞数为1×109/L,加AnnexinV/FITC5μL，20mg/L碘化丙锭溶液10μL，混匀，室温避光孵育15min，用适量稀释缓冲液稀释，流式细胞仪检测. 2结果
人JNK3基因的扩增PCR扩增产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，所得PCR片段约为1269bp，与预期的人JNK3cDNA全编码区的长度相符（图1）.
真核表达载体JNK3的构建和鉴定挑选出的JNK3阳性克隆质粒经EcoRⅤ和XhoⅠ酶切后取得2个条带（图2），1条为约1300bp大小的目的条带，1条为5500bp大小的空载体条带；以mycHisB载体上的通用引物进行测序，证明JNK3重组质粒插人片段的序列与人JNK3的cDNA序列完全一致，说明人JNK3的真核表达载体构建成功.
1：
DNAMarker（DL2000）；2：
JNK3PCR片段.
图1人JNK3基因的PCR扩增（略）
1：
DNAmarker（DL15000）；2：
mycHisB；3：
JNK3.
图JNK3重组质粒的双酶切鉴定（略）
稳固细胞株的挑选和鉴定提取G418挑选出的稳固细胞株HEK293JNK3和HEK293mock细胞中的总RNA，RTPCR检测JNK3的表达.HEK293JNK3所提RNA能扩增出代表JNK3基因（1269bp）及内参GAPDH基因（900bp）的条带；而HEK293mock细胞所提RNA仅能扩增代表内参GAPDH基因的900bp的条带，说明JNK3基因在稳固细胞株中mRNA水平上取得了表达（图3）.提取HEK293mock和HEK293JNK3细胞中的总蛋白，WesternBlot检测JNK3融合蛋白的表达，HEK293JNK3用Myc抗体检测到约46ku的JNK3融合蛋白条带，而HEK293mock对照细胞那么没有相应的条带,说明JNK3基因在稳固细胞株中蛋白水平上取得了表达（图4）.
1：
DNAmarker（DL2000）；2：
HEK293mock；3：
HEK293JNK3.
图3稳固细胞株中JNK3的RTPCR分析结果（略）
1：
HEK293mock；2:
HEK293JNK3.
图4稳固细胞株中JNK3融合蛋白的表达（略）
流式细胞术检测表阿霉素诱导的细胞凋亡用,,mg/L终浓度表阿霉素处置HEK293mock细胞的凋亡率别离为25%，31%，78%；处置HEK293JNK3细胞的凋亡率别离为38%，61%，93%.与HEK293mock细胞相较表阿霉素能明显增进高表达JNK3基因的HEK293细胞发生细胞凋亡（P＜）.
图5高表达JNK3增进表阿霉素诱导的细胞凋亡（略）
3讨论
JNK信号通路是MAPK中重要的通路之一.由JNK1，JNK2和JNK3成员组成，JNK1和JNK2在组织普遍表达，JNK3局限在大脑、心脏和睾丸表达.最近几年来研究发觉JNK3在帕金森综合征、阿尔茨海默、中风等神经退行性疾病中发挥重要作用［2］.JNK3与细胞凋亡紧密相关.稳固转染JNK3p54的PC12细胞，能明显增强UV和紫杉醇诱导的细胞凋亡［3］.JNK3和p38增进亚砷酸钠诱导的皮质神经元凋亡［4］.JNK3基因敲除小鼠可拮抗兴奋性毒性氨基酸诱导的海马区神经细胞凋亡［5］,减少局部脑缺血缺氧致使的神经细胞凋亡［6-7］.
由于JNK3在组织表达超级局限，与细胞凋亡的关系又超级紧密.咱们以pDBLeuJNK3质粒为模板，通过PCR的方式取得人JNK3基因全长，并成功地将其插入mycHisB载体的CMV启动子下面，构建了JNK3的真核表达载体.经PCR和酶切鉴定后，用载体通用引物测序证明序列准确无误后，通过脂质体介导将JNK3重组载体转染HEK293细胞，通过G418挑选成立了稳固表达细胞株，即HEK293JNK3［8］.以空质粒转染HEK293细胞为对照,用RTPCR和WesternBlot方式别离从转录水平和蛋白水平检测了JNK3基因的表达，结果说明重组人JNK3基因在HEK293细胞中能被有效地转录和翻译，说明构建稳固表达JNK3细胞株成功.以表阿霉素作为凋亡诱导剂，与空质粒转染HEK293细胞对照相较表阿霉素能明显增进高表达JNK3基因的HEK293细胞发生细胞凋亡，为进一步研究JNK3增进细胞凋亡机制提供了细胞模型.
【参考文献】
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