蛋白质的提取与检测.docx

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蛋白质的提取与检测

蛋白质的提取与检测

第一节细胞总蛋白的提取及含量测定

【基本原理】

蛋白质含量测定法是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。

目前常用的有四种经典的方法，即定氮法、双缩脲法（Biuret法）、Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外吸收法。

另外还有两种近年普遍使用起来的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法）与二辛可宁酸法（BCA法）。

值得注意的是，上述方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这几种方法测定有可能得出不同的结果。

每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。

在选择方法时应考虑：

①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。

Lowry法：

蛋白质与碱性铜溶液中的二价铜离子络和使得肽键伸展，从而使暴露出的酪氨酸和色氨酸在碱性铜条件下与磷钼钨酸反应并产生深蓝色，在750nm有最大光吸收值。

在一定浓度范围内，反应液颜色的深浅与蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量成正比,由于各种蛋白质中的酪氨酸和色氨酸的含量各不相同，因此在测定时需使用同种蛋白质作标准。

Bradford法：

蛋白质与染料考马斯亮蓝G-250结合，使得染料最大吸收峰从465nm变为595nm，溶液的颜色由棕黑色变为蓝色。

在一定的线性范围内，反应液595nm处吸光度的变化量与反应蛋白量成正比，测定595nm处吸光度的增加即可进行蛋白定量。

BCA（Bicinchoninicacid）法：

二价铜离子在碱性的条件下，可以被蛋白质还原成一价铜离子（Biuretreaction）并与BCA相互作用产生敏感的颜色反应。

两分子的BCA螯合一个铜离子，形成紫色的反应复合物。

该水溶性的复合物在562nm处显示强烈的吸光性，吸光度和蛋白浓度在广泛范围内有良好的线性关系，根据吸光值可以推算出蛋白浓度。

【试剂配制】

1.1.74mg/ml（10mmol/L）PMSF：

0.174gPMSF溶解于100ml异丙醇，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。

2.细胞裂解液：

50mMTris-HCl（pH7.4），150mMNaCl，1mMPMSF，1mMEDTA，1%TritonX-100，4℃保存。

3.100mg/ml牛血清白蛋白（BSA）：

BSA0.1g，0.15mol/LNaCl1ml，充分溶解后-20℃保存。

4.0.15mol/LNaCl：

0.877gNaCl溶解于100ml去离子水，高温灭菌后室温保存。

5.考马斯亮蓝G250溶液：

考马斯亮蓝G250100mg，95%乙醇50ml，磷酸100ml，加去离子水至1L。

先用乙醇溶解考马斯亮蓝染料，再加入磷酸和去离子水，混匀后滤纸过滤，4℃保存。

6.PBS缓冲液（pH7.4）：

NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4•12H2O3.63g，KH2PO40.24g，溶解于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加去离子水定容至1L，常温保存备用。

【操作步骤】

一、细胞总蛋白的提取

1.人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231与食道癌细胞系EC109于含10%FBS的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下常规培养。

2.去除培养液后以预冷的PBS冲洗2～3遍。

3.加入适量的预冷的裂解液后置于冰上20～30min，不时摇动。

4.用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，转移将细胞碎片和裂解液至预冷的1.5ml离心管中；。

5.4℃、12000rpm离心15min。

6.将上清分装至1.5ml的EP管中，-20℃冻存备用。

二、蛋白含量测定（BCA法）（碧云天P0012）

1.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:

1）配制适量BCA工作液，充分混匀。

BCA工作液室温24小时内稳定。

2.完全溶解蛋白标准品，取10uL稀释至100uL，使终浓度为0.5mg/ml。

蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。

但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。

3.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20uL加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20uL。

4.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液（PBS）到20uL。

每个样品三个重复。

5.各孔加入200uLBCA工作液，37℃放置30分钟。

也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。

BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。

并且显色反应会因温度升高而加快。

如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。

6.酶标仪测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。

根据标准曲线计算出蛋白浓度。

标准品OD值

标准品浓度ug/uL

0.078

0

0.099

0.025

0.118

0.05

0.154

0.1

0.213

0.2

0.283

0.3

0.329

0.4

0.404

0.5

第二节SDS-PAGE电泳

【基本原理】

SDS-PAGE电泳技术（SDSpolyacrylamedegelelectrophoresis）首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn进一步完善。

当在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS后，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，其它因素可以忽略不计。

SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质分子之间以及其它物质分子之间的非共价键（氢键和疏水键）。

在强还原剂如巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）的存在下，蛋白质分子内的二硫键被打开并解聚成多肽链。

解聚后的蛋白质分子或其亚基与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同蛋白质分子之间原有的电荷差异，蛋白质-SDS复合物在溶液中的形状像一个长椭圆棒。

椭圆棒的短轴对不同的蛋白质-SDS复合物基本上是相同的，但长轴的长度则与蛋白质分子量的大小成正比，因此这种复合物在SDS-PAGE系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度即蛋白质分子量的大小。

当蛋白质的分子量在15～200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。

因此，SDS-PAGE不仅可以分离鉴定蛋白质，而且可以根据迁移率大小测定蛋白质的分子量。

【试剂配制】

1.10%SDS：

10gSDS加入100ml去离子水中，50℃水浴下溶解，室温保存。

2.1.5mol/LTris-HCl（pH8.8）：

Tris-base45.43g，加入200ml去离子水溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，加去离子水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

3.1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）：

Tris-base30.29g，加入200ml去离子溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，加去离子水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。

4.电泳缓冲液：

Tris-base3.03g，Glycine18.77g，SDS1g，加入适量去离子水溶解后定容至1L，室温保存。

5.5×Loadingbuffer：

50%甘油，250mMTris-HCl（pH6.8），10%β-巯基乙醇，2.5‰溴酚蓝，10%SDS。

混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。

6.10%过硫酸胺（AP）：

0.1g过硫酸胺溶解于1.0ml去离子水，4℃保存，保存时间为2周。

7.四甲基乙二胺（TEMED）：

分装少量原液于棕色瓶，4℃避光保存。

8.30%Acr/Bic（37.5:

1）：

丙烯酰胺（Acr）29.2g，甲叉双丙烯酰胺（Bic）0.8g，加入适量去离子水于37℃下充分溶解并定容至100ml，4℃保存。

注意：

Acr/Bic均具有毒性，易吸附和积累，应戴手套进行操作。

9.凝胶脱色液：

500ml乙醇，100ml冰醋酸，加去离子水定容至1L，室温保存。

10.考马斯亮蓝G250蛋白染色液：

0.1g考马斯亮蓝G250溶解于100ml脱色液中，混匀后滤纸过滤去除颗粒性物质，置于棕色瓶中室温保存。

11.凝胶保存液：

450ml脱色液中加入50ml甘油，混匀后室温保存。

12.

SDS-PAGE浓缩胶（5%Acrylamide）配方：

13.

分离胶配方

【操作步骤】

一、凝胶的配制与电泳

（1）凝胶配制与上样

1.玻璃板对齐后放入夹中卡紧。

然后垂直卡在架子上准备灌胶。

2.配制10%浓度的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。

灌胶时使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生，待灌入2/3的分离胶后应立即封胶，用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。

3.胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。

4.配制5%浓度的浓缩胶，将剩余空间灌满后立即将梳子插入浓缩胶中；插梳子时要使梳子保持水平，浓缩胶凝固的过程中要补胶1～2次。

5.待到浓缩胶凝固后，竖直向上轻轻拔出梳子，用水冲洗一下浓缩胶，将其放入加有电泳缓冲液的电泳槽中。

6.取出含50μg蛋白样品与5×Loadingbuffer按比例充分混合，煮沸5min。

7.加足够的电泳液后用微量加样器贴壁上样，注意不要吸进气泡。

（2）电泳

1.以初始电压为80V进行电泳,30min，样品进入分离胶后改为120～150V。

2.在溴酚兰泳动至距胶下缘约1cm时即可终止电泳（目的蛋白条带一般跑过分离胶的1/3，可根据预染蛋白Marker调整电泳时间）。

二、考马斯亮蓝染色

1.电泳后的凝胶于染色液中振荡染色4h或40℃染色1h，然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次。

2.多次变换脱色液直至凝胶背景脱净为止，为加快脱色，可略加温度。

3.凝胶保存：

脱去背景色的凝胶在保存液中浸泡30min，然后将凝胶放在玻璃板上，用保存液浸湿玻璃纸包住凝胶在室温下干燥即可。

第三节免疫印迹（WesternBlot）

【基本原理】

WesternBlot中文一般称为蛋白质免疫印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。

其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。

通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

WesternBlot与Southern印迹杂交或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素/NC膜或聚偏二氟乙烯/PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色、化学发光或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

【试剂配制】

1.电转液：

Tris-base5.8g，Glycine2.9g，SDS0.37g，甲醇200ml，去离子水定容至1L，室温保存。

2.TBS：

20mMTris-HCl（pH7.4），150mMNaCl，室温保存；

3.TBST：

即含0.05%Tween20的TBS缓冲液。

4.封闭液与抗体稀释液：

均为含5%脱脂奶粉的TBST，溶解后4℃保存。

【操作步骤】

一、转膜

1.将PVDF膜在甲醇中浸泡3min，完全浸湿后置于入转膜液中。

2.将胶平铺于海绵上，按图示顺序铺上膜与每侧1～2张滤纸，注意用玻璃棒逐出气泡，剪去滤纸与膜的过多部分。

从负极（黑色板）依次铺海绵-滤纸（3层）-胶-PVDF膜-滤纸（3层）。

3.将夹子放入转移槽中，要使夹子的黑面对转移槽的黑面，夹的白面对红面。

4.将转移槽置于冰水混合物中，300mA，1.5h（同时放入冰袋，外面包冰）。

5.以预染蛋白Marker观察转移效果。

注意：

①转移液含甲醇，操作时要戴手套；②整个操作均在转移液中进行，要不断的擀去气泡；③膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路；④注意转膜时电极方向是“膜正胶负”。

二、免疫反应

1.封闭：

将PVDF膜从电转槽中取出，去离子水与TBST稍加漂洗，浸没于封闭液（脱脂奶粉5%）中缓慢摇荡2h。

传统上有两种封闭液：

脱脂奶粉或BSA，脱脂奶粉成本低但不能用于磷酸化蛋白（因脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白），使用脱脂奶粉会结合磷酸化抗体从而易产生高背景。

某些抗体用BSA封闭时因不明原因可能会产生比脱脂奶粉更强的信号。

2.结合一抗：

将β-Actin一抗（兔抗人、鼠）用封闭液稀释至适当浓度（1：

2000），室温下作用2h或4℃过夜。

3.洗涤：

TBST漂洗PVDF膜后再浸洗三次，每次5～10min。

4.结合二抗：

按适当比例（1：

5000）稀释HRP标记的二抗（羊抗兔），室温作用2h。

5.洗涤：

TBST漂洗膜后再浸洗2次，每次5～10min。

二、DAB显色（按产品说明书操作）

二氨基联苯胺（3，3’-diaminobenzidine，DAB）是过氧化物酶HRP（Peroxidase）的生色底物，在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成棕褐色不溶性产物。

用于检测过氧化物酶的活性，灵敏度高，特异性好。

其适用于蛋白质杂交和免疫化学，以及原位杂交染色等。

将配好的DAB直接滴加在目的片段位置，避光显色至

蛋白目的条带明显出现。

将膜揭起置去离子水中漂洗后

放滤纸上晾干即可观察与扫描。

发光鉴定

　　Westernblot检测系统中常用交联酶两大家族就是辣根过氧化物酶HRP-ECL或碱性磷酸酶AP-NBT/BICP。

碱性磷酸酶很早就被用于检测系统-包括固定化抗原（WB）监测和核酸检测。

但是做AP实验经常会遇到显色背景偏高的问题，所以就WB本身来说偏爱HRP的要比AP多。

AP显色底物的生成物主要是蓝紫色，成像好，容易拍照。

但是背景也偏高，整个显色过程更有技术性，有许多个人技巧在里面。

如今由于HRP系统的化学发光系统已经不断改进，使得灵敏度不断提高，化学发光显色上与AP不相上下。

就生色反应来说，AP显色得灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。

1.HRP-ECL发光法：

　　将A、B发光液按比例稀释混合。

膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带（5min左右）后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。

取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。

2.AP-NBT/BICP显色法：

　　每片NBT/BICP可溶解于30ml水中，使用前将一片分装在30个EP管中，每张3×9cm的膜取一管配成1ml即可。

将PBST或TTBS洗涤过的膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于NBT/BICP溶液液滴上，并用不透明物体（如报纸）遮挡光线，显色20s后每10s观察一次，至条带明显或有本底出现时将膜揭起置去离子水中漂洗后放滤纸上晾干即可观察与扫描。