脉冲场凝胶电泳.docx

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脉冲场凝胶电泳

脉冲场凝胶系统操作规范

文件编号：

VBQW11##-##

版本号：

A0

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批准：

批准日期：

颁发部门：

质量保障中心

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变更原因、依据及详细变更内容

制定人

分发部门

具体部门

1.目的

指导技术员规范地使用脉冲场凝胶系统。

2.适用范围

本标准适用于利用脉冲场凝胶系统对相关产品进行检测。

3.职责

分子部门负责本文件的编写，质量保障部及检验人员负责本标准的监督。

4.操作规范

4.1简介

4.1.1.技术原理

常规的琼脂糖凝胶电泳采用单一的均匀电场，一定大小的线状DNA分子经凝胶的分子筛作用以一定的速率由负极向正极移动。

但当DNA分子的长度超过一定极限后，其迁移率于则于分子大小无关，而主要是决定于电场强度。

实践表明，长度大于50kb的DNA不能在恒场强的琼脂糖凝胶电泳中较好的分离。

脉冲场凝胶系统（Pulsedfieldgalelectrophoresis,PFGE）正好解决这一问题。

PFGE采用两个交变电场，即两个电场交替地开启和关闭，DNA的电泳方向随着电场的变化而改变，大分子的DNA得以分离。

严格来讲，“脉冲”场电泳有些用词不当，应称作“交替”场电泳。

电场变换方向的间隔时间为脉冲时间，其分为从数秒到几小时。

通常脉冲时间越长分辨的DNA片段越长。

图一.脉冲场电泳交变示意图

图一是根据Carle和Olson最初设计的正交场电泳装置（orth-ogona1fieldgelelectrophoresis，OFAGE）绘制的PFGE示意图。

A、B代表两个交替开启和关闭的电场。

当A电场开启时，B电场关闭，DNA分子从A电场的负极（A-）向正极（A+）移动；当B电场开启时，DNA分子改变原来的运行方向，随B电场由负极（B-）向正极（B+）移动。

这样，随着电场方向的交替变化DNA分子即呈“Z”字形向前移动。

可以想象，较小的分子能相当快速地适应这种变化，但大分子则需更多的时间来改变方向，而真正用于前移的时间相对减少，从而将不同大小的分子分开。

4.1.2主要仪器设备和试剂

表1.主要试剂

序号

试剂

品牌

货号

备注

1.

LambdaPFGLadder

NEB

#N0341S

脉冲场电泳Maker

2.

PulsedFieldCertified™Agarose

BIO-RAD

#1620137

琼脂糖

3.

Tris

上海生工

TB0-194

用于Buffer配制

4.

硼酸

深圳化试

——

5.

EDTA

Sigma

E7889

6.

NaOH

科佑化

——

表2.主要设备

序号

仪器

品牌

型号

备注

1

脉冲场电泳仪

BIO-RAD

4.2准备工作

准备：

1）仪器线路和管道连接，确认管道连接密闭，不漏气；

2）220V电源，接地良好；

3）试剂准备：

0.5×TBE缓冲液或者1×TAE缓冲液3L；去离子水3L；

4）微波炉、天平、手术刀；

电泳半小时进行工作：

5）电泳槽水平的调节：

用水平泡调节电泳槽，确保电泳槽处于水平；

6）电泳槽内加入约2.2L去离子水（保证去离子水最低不少于2L，最高不超过2.5L）；

7）首先确保变压器打开；

8）开启主机开关，仪器开始自检，自检结束后开启蠕动泵开关，调节速度为“80~100”，使去离子说形成环流；

9）开启冷却泵，“settemp”调节电泳温度，推荐范围为12~15℃，一般设置为14℃，“actualtemp”显示实际温度；

10）15~20min后将去离子水放出，接着加入2.2L电泳缓冲液。

4.3灌胶

1）灌胶框放置：

不同的凝胶使用不同的灌胶框，框子突起应对准电泳槽的小孔；

2）灌胶框的水平调节：

用水平泡调节灌胶框的水平；

3）梳子的放置：

梳子不要和灌胶框密切接触，要保持1~2mm的距离；

4）制胶：

实验室配制的灌胶框有两种，一大一小；配制小板灌胶框一般需要0.5×TBE100~110mL；凝胶为脉冲场电泳专用琼脂糖；

5）灌胶：

加热好的琼脂糖溶液，不要立刻倒胶，带少许冷却后再倒胶；倒胶过程中如果有气泡产生，则用tip头将气泡戳破即可；待凝胶凝固，拔去梳子即可；

6）修胶：

制备好的凝胶，从灌胶架取下后，用手术刀片对凝胶进行修饰，把多余的凝胶刮去，以免多余的凝胶漂浮在电泳槽中，将流水孔堵塞；抑或直接在水龙头下冲洗一下凝胶块。

7）凝胶的放置：

点样孔的位置应靠近电泳槽的后侧。

8）调节泵速：

将蠕动泵的速度调节至“50~60”，以免流速过快将凝胶冲走。

4.4上样

1）液体样品：

液体样品点样方式同普通琼脂糖凝胶电泳，注意不要忘记加loadingbuffer。

用普通的loadingbuffer即可，主要在于帮助液体样品在点样孔中沉降；

2）加Maker：

若Marker为液体，则同普通点样；实验室Marker为胶状固体，注射器中保存，使用时推动注射器将Marker推出，用手术刀切下1~2mm的薄片，用Marker用手术刀放入点样孔即可；或者差梳子之前，将Maker薄片贴在梳子的前端，先灌胶，后插梳子，此时千万小心，一旦在插梳子过程中Makrer脱落，则需要重来。

4.5主机程序设置

CHEFMapperXA系统有4中产生程序的方法，主要介绍两种最常用的方法操作：

1）自动运算（AutoAlgorithm），试用于没有已知方法的电泳；

已分离220kb-2200kb片段为例，

a.按AutoAlgorithm键，若已有输入的程序，屏幕将显示“Youwilldestroylastprogram-Goon?

”，输入1确定；

b.屏幕显示“MolecularWeight:

Low”，输入220，按K-BASES键，再按ENTER键；

c.屏幕显示“MolecularWeight:

High”，输入2200，按K-BASES键，再按ENTER键；

d.屏幕显示“CalibrationFactor，[ ], enter for NC”，按ENTER键保留默认值；

e.屏幕显示“0.5x TBE,14 ℃, 1% PFC agarose”，按ENTER键确认；

f.屏幕显示运算生成的电泳参数“6V/cm，Runtime=28:

59hr，Includedangle120°”，连续按Enter键将光标移至下页；

g.屏幕继续显示电泳参数：

“Int. Sw. Tm = 26.31s, Fin. Sw.Tm = 3m48.48s, Ramping factor:

 a = [Linear]”；

h.连续按ENTER键至屏幕显示“A Program is in memory. Please enter another command.”。

i.直接按StartRun键即可开始电泳。

2）双矢量脉冲（TwoState），最常用的电泳方法，适用于大多数电泳；

a.按TwoState键，若已有输入的程序，屏幕将显示“Youwilldestroylastprogram-Goon？

”，输入1确定；

b.在“Gradient[ ] V/cm”中输入电场强度，先输入数字，在按Enter键；在“Runtime=[ ]”中输入总电泳时间，先输入数字，再按Minutes或Hours键，再按Enter键；在“Includedangle=”中输入脉冲场夹角，先输入数字，再按Enter键；

c.在“Int.Sw.Tm=”中输入起始转换时间，先输入数字，再按Seconds或Minutes或Hours键，再按Enter键；在“Fin Sw Tm=”中输入最终转换时间，先输入数字，再按Seconds或Minutes或Hours键，再按ENTER键；

d.屏幕显示“Rampingfactora=”，直接按Enter键保留默认值（线性的转化时间变化）；

e.屏幕显示“ARrogramisinmemory.Pleaseenteranothercommand.”，按StartRun键开始电泳。

f.其他形式的脉冲程序设置方式可详见产品说明书。

4.6凝胶染色和观察

电泳结束后，应及时取出凝胶，以免时间过长，导致条带弥散。

1）关机程序：

电泳结束后，依次关掉冷却泵，蠕动泵，主机开关，打开电泳槽，取出凝胶；

2）染色：

将凝胶放入合适容器内，加入去离子水，无需太多，覆盖凝胶即可；向溶液中加入20~30ulEB，不是EB替代物，染色15~20min左右即可在凝胶成像仪下观察电泳结果。

注意：

脉冲场电泳使用的染色剂为EB，不是EB替代物；EB替代物为太仓提供，浓度未知，一般将凝胶放入点用房中的白色废胶盒中，加去离子水没过凝胶，再加入20~30ulEB即可。

图一位NEB提供的LambdaLadderPFGMarker脉冲场电泳效果图；图二为根据实际实验条件，本实验室的结果。

3）断电处理

在该系统运行过程中若发生断电，断电3h内可继续启动仪器，程序将继续运行。

4.7电泳槽清理

脉冲场电泳结束后，若长时间不用，需要把其中的缓冲液排除，随后向其中加入不少于2L去离子水，开启循环泵，进一步清洁电泳槽，注意挑出其中漂浮的废胶块，以免造成电泳槽孔堵塞，最后将废水排除即可。

图一.LambdaLadderPRGMarker-NEB官方脉冲场电泳图谱

图二.采用TwoState程序，使用参数：

电场强度6V/cm，电泳时间24h（实际实验中，电泳18h即停止），转换角度120°，转换时间为3s~120s。

由图我们可以看出，至少有10条Maker指示条带清晰明亮，大小范围48.5~485Kb

5.注意事项

在脉冲场电泳的使用过程中，需要注意以下安全问题:

1）该系统在运行中使用高电压和大电流，因此当仪器运行时，切不可随意打开电泳槽，以免造成触电的危险，如果需要，可在电泳槽上贴出明确启事，以免他人好奇随意开启电泳槽；

2）在仪器运行过程中，若有需要打开电泳槽，首先按Pause键，当“highvoltage”指示灯熄灭后才可以打开；

3）蠕动泵和冷却泵的开启：

对这两个泵而言，开启先开蠕动泵，后开冷却泵；关闭先关冷却泵，再关蠕动泵，

以免液体冷凝在冷却泵中，无法循环。

4）EB有毒，使用时需要注意保护自己。

6.常见故障及解决方法

表3.脉冲场凝胶电泳系统常见问题及解决方法

常见问题

解决办法

仪器问题

电源指示灯不亮

1、检查主机后面的保险丝 

2、检查电源插头

3、联络维修工程师 

电源指示灯亮，但电极没有电压

1、检查电泳槽的盖子时候关闭 

2、检查25针连接线是否接触良好 

3、检查电泳槽和冷却泵之间的连接线是否接触良好 

4、检查电泳槽的电源线是否接触良好 

5、检查主机面板前面的  HV保险丝，如有必要，更换之

6、检查设置好的程序中，电压的设置不能为0V 

7、检查主机是否处于暂停状态 

凝胶在缓冲液中漂浮

蠕动泵的速度太快或太慢，请调到合适的速度，一般为50~60。

缓冲液不流动或流速慢 

1、检查管道系统是否有缠绕 

2、检查冷却泵：

当冷却泵制冷时，如果蠕动泵没有开，会造成管道内结冰，导致管道堵塞。

电泳条带扭曲，泳道弯曲等 

1、移开电泳槽中的温度计、胶铲等物体

2、因为流速太低，导致制冷不充分，或不均一：

实验表明制冷泵故障，可能造成电泳条带模糊甚至拖带弥散

3、检查缓冲液平面是否水平

4、检查电泳方向的电场矢量

5、替换损坏的电极

6、缓冲液体积必须大于2.2 L

 7、主机故障，请联系维修工程师 

应用问题

条带拖尾或模糊 

1、过分加热。

降低电压或缓冲液的离子浓度。

2、电场转换时间不适合，优化电场转换时间

3、凝胶浓度过低 

4、样品降解：

使用的内切酶不纯或洗涤的步骤太短

5、所用的琼脂糖内混有杂质

6、上样量太高：

调整样品浓度

 大片段DNA不能有效分离 

1、降低电压到2V/cm

2、电场转换时间延长

3、所用的琼脂糖内混有杂质

 泳道内背景太深

1、样品洗涤次数不够 

2、样品内混有RNA 或其他生物材料

 3、DNA 浓度太高 

条带弯曲

1、样品内的盐浓度或去垢剂浓度太高

2、缓冲液缓冲能力下降，更换缓冲液

3、点样孔歪曲，重新制胶

4、上样时样品块被挤碎 

5、蠕动泵速度太慢，检查管道是否有缠绕

条带变粗

1、使用薄梳子

2、减少上样量

7.关于参数设置的几点建议

在脉冲场电泳系统中，Buffer的种类、浓度，系统运行温度，脉冲角度、电场强度和时间是决定实验结果的关键因素，尤其是脉冲的角度、场强和时间。

1）脉冲角度：

实验表明，使用较小的脉冲角度，可以把电泳的时间减少50%，更有利于较大片段的分离，但较小片段的分离效果则较差。

如图三所示。

因此在实际实验中需要根据分离片段的大小来调整脉冲角度。

大部分选择120°。

图三.不同脉冲角度电泳结果展示图

2）脉冲时间：

脉冲时间就是电极在单一方向运行所需要的时间。

实验表明，分离小片段样本，通常减少脉冲时间；分离大片段样本，通常增大脉冲时间。

此外，脉冲时间的变换有线性和非线性之分，其中线性是指脉冲时间在一定的电泳时间内是均匀变换；二非线性变换可以使一定的脉冲时间相对集中，从而使得相应大小的片段得到更好的分离。

图四所示为不同脉冲时间对带型的影响。

图四.不同脉冲时间对带型的影响

3）电场强度：

以V/cm表示，通常CHEF型脉冲场凝胶电泳胶区的长度为33cm，所以200V电压实际为6V/cm。

使用较大的电场强度可以分离较大的DNA片段。

大部分基于CHEF脉冲场凝胶电泳系统的操作手册使用的电场强度为6V/cm。

4）琼脂糖：

脉冲场凝胶电泳系统中使用的琼脂糖应具备以下特点，机械强度大，利于实验操作；纯度高，顶用分辨率高；熔点低，包埋细菌时凝胶的温度不宜过高（本实验中不涉及样品包埋）。

低熔点琼脂糖是经过羟乙基化修饰的琼脂糖，30℃左右成胶，熔点为65℃。

熔化温度低于大多数双链DNA熔点，这种性质可以从凝胶中回收天然形式DNA。

1%琼脂糖最大可以分离3MbDNA，0.5%~0.9%可分离更大的DNA片段，但条带弥散。

5）Buffer的种类和浓度：

Buffer离子浓度越低，电泳跑得越快。

脉冲场电泳常用的Buffer类型为0.5×TBE，有时可用1×TAE替代。

其中1×TAE场用于MB级的DNA片段分离（＞3MB），而0.5×TBE常用语＜1M的片段分离。

6）温度：

脉冲场电泳通过冷凝和循环系统实现对电泳缓冲液的温度控制。

温度越低，电泳跑的越慢，得到条带越细致，结果越理想。

目前认为14℃可得到最理想的电泳带型，常用范围12℃-15℃。

实验表明，温度过高（＞20℃）或者温度不能稳定维持低温，可能导致条带无法分开，拖尾严重。

8.试剂配制

在实际操作中，我们使用的Buffer为0.5×TBE。

TEB溶液长期贮存或者浓度过高（最高为10×）硼酸（Borate）会出现沉淀，为避免此缺点，室温下贮存5×TBE溶液，使用时稀释10倍即可。

具体配制方法见表4：

表4.脉冲场凝胶电泳相关试剂配制

名称

组分

配制方法

5×TBE

Tris-硼酸45mM

以配制1L体积为例：

称量Tris碱54g，硼酸27.5g，0.5MEDTA（PH8.0）20mL，加入900mL去离子水，搅拌直至完全溶解，最后用容量瓶定容至1L即可。

EDTA1mM

0.5MEDTA母液（PH8.0）

EDTA

以配制200mL体积为例：

称量EDTA37.2g，加入150mL去离子水，在磁力搅拌器上溶解，并用5MNaOH调节PH，最后用容量瓶定容至200mL。

5MNaOH

NaOH

以配制100m体积为例：

称量20gNaOH固体，加入90mL去离子水，搅拌溶解，最后用容量瓶定容至100mL即可。