SOPSciex Quad5500液质联用仪标准操作规程.docx

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SOPSciexQuad5500液质联用仪标准操作规程

颁发部门:

理化部第1页共19页

制定人审核人批准人RD-SOP-

姓名版本号：

A0

签名生效日期

日期

文件名称：

SciexQuad5500液质联用仪标准操作规程

内部资料不得外传原件（）；复印件（）

分发部门：

理化部（）；

1.目的：

为SciexQuad5500液质联用仪的操作制定一个标准操作程序，确保仪器操作正确，结果准确可靠。

2.范围：

适用于本院所有SciexQuad5500液质联用仪的操作。

3.职责：

理化部负责制定文件并培训相关人员，并保证其正确使用。

4.内容：

4.1仪器的组成：

本仪器由液相色谱、质谱主机、工作站、氮气、机械真空泵、不间断稳压电源和打印机组成。

见图1和图2。

图1

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图2

4.2开机

4.2.1检查瓶装气是否充足。

瓶内气压不得低于1.0MPa。

打开气瓶开关阀，调节减压阀使输出压力为如图3（氮气）。

建议调节好压力后，减压阀就固体不动了，以后都只开关气瓶的开关阀即可。

图3

4.2.2打开质谱主机左后侧面板上的电源开关；机械真空泵将在30秒后启动运行；

4.2.3打开工作站，进入Analyst软件；如有必要，可以打开液相色谱电源；

4.2.4重新启动（热启动）：

按下质谱主机左后侧面板上的Reset按钮约3秒钟。

4.3Analyst软件简介

Analyst软件是SCIEX公司LCMS系统常用的仪器控制、维护，方法优化、样品运行、数据采集和分析的基本软件。

其运行界面如图

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图4软件界面

4.3.1介绍

图中，左侧导航栏中的Configure（配置）用于硬件设置、安全和报告设置；TuneandCalibrate

（调谐与校准）用于校准仪器和方法优化；Acquire（采集）用于设置采集方法和批文件的建立；Explore

（浏览）用于浏览数据文件；Quantitate（定量）用于数据定量。

其中，Quantitate模块已基本不再使用，其定量功能已经被专门定量软件MultiQuant替代。

4.3.2计算分子量

点击Acquire→Tools→calculations；

4.4调谐及质量校准

4.4.1校准溶液

本仪器对应的校准溶液为POSPPG2E-7M（正离子模式），NEGPPG3e-5M（负离子模式），PPG稀释溶剂配方：

①称取15.4mg乙酸铵固体，溶于49.9ml去离子水中；

②量取49.9ml甲醇，加入0.1ml甲酸和0.1ml乙腈；

③将上述两溶液混合，得到PPG稀释溶剂；

4.4.2调谐主要流程

A.双击HardwareConfiguration，选中MassOnly，点击DeactivateProfile，激活质谱;

B.点击TuneandCalibrate→Manualtuning，在项目文件APIInstrument或Installation中选择校准方法，正离子Q1PosPPGs.dam、Q3PosPPGs.dam，负离子Q1NegPPGs.dam、Q3NegPPGs.dam；

C.选择合适的质量校准溶液吸入针筒，连接管路；

D.在质谱参数设置及运行窗口，点击StartSyringePump按钮开针泵进行连续进样，观察并确定总离子流信号稳定；

E.不管正负离子均采用ScanRate为10、200Da/s进行调谐，不同扫描速度对应不同MCA设定值。

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F.右下侧的质谱图区域内点击右键，弹出菜单中选择Openfile，在Tools菜单中选择CalibrateFromSpectrum→MassCalibrationOpt窗io口n中，选择正确的校准标准Standard，正离子选择PPGsPOS，负离子选择PPGsNEG；点击Start开始；

G.得到的计算结果如图5，其中，上栏显示此次校准与理论值的质量偏差MassShift，各点应位于上下虚线表示的±0.1Da范围内；中栏显示所有PPG校准峰的半峰宽高度FHWM，各点应位于上下虚线表示的0.6~0.8Da范围内；下栏显示此次校准与上次校准相比，所有PPG校准点峰强度变化的百分比；需要指出的是，PPG离子信号受浓度、温度、气体和喷雾针位置影响极为敏感。

因此，下栏内校准点响应值变化并不能作为判断仪器灵敏度变化的唯一依据。

H.使用标准溶液，采集Q1、Q3正离子模式，Q1、Q3负离子模式在各扫描速度下的数据，并进行校准；

图5

4.4.3手动调整分辨率（半峰高峰宽）

正常状态下，上图所得的中栏里，各点应位于上下虚线表示的0.6~0.8Da范围内，这表示质谱峰分辨率正常；如果某些PPG峰宽超出正常范围，应进行手动调整。

A.上栏偏离后，点击UpdateMassCalibration（仅更新偏离的质量点的电场参数，其余不变）；

B.中栏偏离后，在质谱参数设置及运行窗口，点击Resolution标签，点击Advance按钮，出现ResolutionTable含有校正的PPG离子质量数和相应的DCOffset值，对Offset值进行细微调整，变化0.005，其规律是，Offset值增加，分辨率增加，半峰宽变小，Offset值减小，分辨率变差，半峰宽变大，改变后按Apply钮，并在开始采集数据时按Yes确认要保存这些修改。

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图6

C.偏离校准后，点击Acquire，最后采集一针，命名校准文件，比如“Q1PPGPOS10Da20200630”。

4.5质谱参数优化及LCMS方法建立

通常情况下，推荐使用针泵连续进样标准溶液，在ManualTuning窗口下进行质谱参数优化。

首先进行一级质谱扫面（Q1Scan），获得目标化合物的信息，比如分子式、结构式、分子量，甚至参考的质谱方法等。

其次，使用碎片离子扫描（ProductIonScan）获得目标化合物的子离子信息。

据此获得多反应监测（MRM）离子对信息，随后进行其他电参数的最优化，以获得最终的质谱方法。

之后，通过连接液相色谱，经过适当的调整后获得可以进行日常数据采集的LCMS方法。

4.5.1配置溶液：

推荐用50%甲醇或乙腈溶解，多肽或蛋白质加酸（如0.1%甲酸）；推荐浓度50~100ng/ml，培训教材推荐50~100ng/ml；

4.5.2新建Project

在Analyst软件选中TuneandCalibrate，Tools菜单中选择Project→CreateProject，在弹出窗口中，在Projectname项下输入新建的Project名称，点击OK，确认新建Project。

4.5.3寻找合适的母离子（Q1Scan）

在Analyst软件界面下，双击导航栏内HardwareConfiguration，在弹出窗口中选择MassOnly，点击ActiveProfile，激活MassOnly（只连接质谱主机）；

在导航栏内单击TuneandCalibrate，进入调谐模式，点击上方工具条中的T钮，此时，应注意到主机有“扑”声音，表明进入调谐状态。

此时，右下角质谱状态显示绿色。

双击ManualTuning，进入质谱参数设置及运行窗口。

使用玻璃进样针吸取适当的溶液，置于针座上，在图中质谱参数设定和运行窗口中，点击MSMethod下拉菜单，选择SyringePumpMethod。

设置针内径SyringeDiameter为4.61mm，针泵流速为7uL/min。

点击StartSyringePump按钮开针泵进样，注意：

在质谱方法优化的整个过程中，保持针泵在进样状态。

返回MSMethod，选择扫描模式ScanType为Q1MS，设定扫描速度ScanRate为200Da/s。

设定扫描范围为100~化合物分子量（MW）+50Da；点击Start开始采集数据，运行稳定后，注意观察是否

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有预期的母离子出现，并控制其响应值在1E6~3E6之间，如有必要，可以点击Acquire保存采集到的数据，点击stop停止采集数据；记录母离子质荷比m/z，精确到小数点第一位；

注：

如若响应值不够，①在Source/Gas项下，Temperature（TEM）设置为200，IonSourceGas2

（GS2）设置为20；②在Compound项下更改DeclusteringPotential（DP）去簇电压，去簇电压跟分子量相关，分子量越大电压应该相应增大，去簇电压范围为0~300，小分子一般在80~120之间，氨基酸在40~60之间；③增加浓度；

4.5.4寻找合适的母离子（ProductIonScan）

在图中，设定ScanType为产物离子扫描ProductIon（MS2），设定扫描范围Start~Stop为50~化合物分子量（MW）+5Da；“Productof”下填写选中的母离子，精确到小数点后一位；点击Compound标签，设定CollisionEnergy（CE）为5；点击Start开始采集数据，运行稳定后，注意观察是否有预期母离子出现，手动调节CE，以5eV为步长，逐次增加，每次增加后稍作等待，直至目标化合物的子离子都能清晰的看到，通常，此时最强离子（基峰）响应值约为母离子的3~4倍。

选择响应值最强的2~3个或几个离子作为候选者，记录m/z，注意尽量避免使用m/z与母离子相差小于20Da的子离子；点击Stop停止采集数据；

4.5.5建立合适的MRM离子对通道

在图中，设定ScanType为MRM，设定参数表格中的Q1Mass对应找到的母离子，Q3Mass对应找到的候选子离子，Time（ms）为100；

4.5.6优化并获得最佳DP和CE电压

点击图中的EditRamp，在弹出的窗口中，Parameter项下选择DeclusteringPotential，点击OK。

点击Start采集数据，信号最强的即为DP电压（DP电压与母离子有关，与子离子无关），所以不管有几个子离子，DP电压是固定；

点击图中的EditRamp，在弹出的窗口中，Parameter项下选择CollisionEnergy，点击OK。

观察图中的Duration（采集时间），通过调整图中的Step使得Duration为1分钟左右，点击Start开始采集数据，记录每个离子通道的最佳CE电压，可以右键点击右下角数据图的标题栏，在不同的MRM通道间切换显示；在参数设定表中，右键点击，在弹出菜单中选择CollisionEnergyCE，调出表格中的CE列，输入每个通道的最佳CE电压值，精确至个位数；为方便方法和数据浏览，建议在MRM参数设定中的“ID”列内，输入MRM通道名称，如“[化合物名]空格[序号]”。

完成后选择菜单File\Save保存质谱方法，[文件名].dam。

4.5.7APCI电离模式的质谱条件优化

大多数情况下，目标有机化合物既可以通过ESI电离也可以通过APCI电离，因此，可以在ESI电离模式下优化质谱参数，将化合物的离子对信息、最优化DP和CE电压等参数移植到APCI模式下中，后期仅需要按照APCI的要求设定离子源参数即可；

4.5.8LC-MS联用方法建立

4.5.8.1准备工作

4.5.8.1.1激活液相

打开液相各部分开关后，在Analyst窗口中的导航栏内双击HardwareConfiguration，如图弹出的窗口中，选择LCMS配置文件，点击ActiveProfile，如有必要，先点击DeactivateProfile，灭活其他硬件配置文件。

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4.5.8.1.2ESI离子源参数设定

点击菜单File\Open，打开保存的质谱方法，如图，点击质谱参数区域内的EditParameters，如图，在弹出窗口中按图推荐值设定离子源参数。

注意：

在正常情况下，参数适合大多数应用，对某些特定，如热敏，易分解化合物，须针对其进行优化。

4.5.8.1.3APCI源参数设定

确认质谱主机已安装APCI源，点击菜单File\Open，打开保存的质谱方法，如图，点击质谱参数区域内的EditParameters，如图，在弹出窗口中按图推荐值设定源参数。

图7-1

图7-2

4.5.8.2液相色谱方法设定

4.5.8.2.1在数据采集方法中添加液相模块

点击菜单File\Open，打开4.5.6保存的质谱方法，右键点击AcquisitionMethod，在弹出菜单中选择Add/RemoveDeviceMethod，如图液相模块已添加；

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图8

4.5.8.2.2液相条件设定

设置流速、流动相比例、进样量、柱温等，最大柱压60MPa，自动进样器有控温模块，建议≥室温-12℃，一般设置15℃，清洗模式应为进样前后均清洗；

4.5.8.2.3其他参数设定

驻留参数（Dwell）设定

Dwell即测定某个MRM通道时，整个系统消耗的时间；

Cycletime和Totalscantime即所有MRM各工作一次所消耗的时间总和；

某一个通道的色谱峰，是由若干个数据点租成，定量色谱峰要求12个点，点数太多，扫描频率越高，就会产生毛刺峰；Dwelltime范围5~250ms，各离子对有5ms的切换时间；

图9

ScheduledMRM（简称sMRM）方法设定

若离子对数量较多，采用驻留参数设定时，峰形差，就可以采用ScheduledMRM设定，在质谱方法的MRM列表中点击ScheduledMRM的Enabled选项下，将设定的Dwell的列变为设定Time

（min），即保留时间，填入每个MRM对应化合物出峰时间。

将最窄色谱峰基峰宽的十二分之一，填入TargetScanTime，单位为秒。

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图10

4.5.8.3切换阀

A进质谱B进废液；

4.6数据采集

4.6.1准备工作

参照液相色谱使用方法，执行Purge程序，灌注流动相。

平衡液相色谱条件，点击Equilibrate

按钮，在弹出窗口中选择将要运行的LC-MS方法，设定平衡时间，比如10min，点击OK确定，系统将自动平衡，并执行制定的采样方法条件，平衡结束后，点右下角仪器状态标签显示为绿色。

图11

4.6.2序列进样

4.6.2.1编辑序列

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在图4中双击“BuildAcquisitionB为at新ch建”序列，在Batch文件编辑窗口中的Set输入名称，点击AddSet添加样品，MethodEditor中选择进样方法；

图12-1

图12-2

根据实际情况编辑Samplename、VialPosition、Datafile、Inj-Volume（进样体积若跟方法中设置不一致，优先序列中参数）。

4.6.2.2提交并运行样品

上图中点击Batch窗口中的Submit标签，进入样品提交界面。

可提交表中所有样品，也可选择若干个样品提交。

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图13

点击工具栏中显示。

4.6.2.3停止样本采集

按钮开始采样，进样队列可点击

在工具栏中，单击Stopsample，队列会在当前扫描完成对所选样本的扫描之后停止，窗口中样品的状态变化为Terminated，队列中随后的所有其他样本状态为Waiting；若要继续这个批次，点击StartSample；

注：

AbortSample跳过当前样品，从下个样品起重新开始采样，PauseSampleNow暂停当前样品；

4.6.2.4设置队列选项

所有样本都采集后，队列停止，质谱仪需进入Standby模式，可以在软件中更改参数以设置Standby时间；

在导航栏上，单击Configure→Tools→Setting→QueueOpti弹on出s的对话框中更改时间；

图14

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samples字段中，将样本数的最大值设置为大于将要提交队列的样本数；Max.IdleTime字段中，键入队列在采集完成后进入Standby之前将要等待的时间长度；Max.TuneIdleTime字段中，键入调谐完成后进入Standby之前将要等待的时间长度；

4.6.2.5仪器状态

图15

4.7数据浏览及处理

4.7.1数据浏览

在导航栏的Explore项下，双击OpenDataFile，在列表中找到要打开的数据文件，选择一个样本，然后点击OK。

打开数据文件后，单击Explore→showlistd，at如a下图

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图16

4.7.2数据处理

点击桌面图标，出现如图界面；

点击Configuration，出现如下界面，选择Projects；

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点击Analytics，在Projects下拉里，①选择存储的数据文件名；②点击ProjectsDefaultSettings，积分参数下拉菜单里选择MQ4或者Autopeak；

在Results下拉菜单里，点击NEW（新建）或OPEN（打开原有的），选择你的序列文件，如下图，选中你要处理的数据点击；

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在selectaprocessingmethod项下，选择新建处理方法；

在Workflow界面右侧任选一个数据文件；

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点击Compounds，表格中编辑信息；

点击Integration，编辑积分事件；

积分事件分为三部分，包括RetentionTime，Integration和Units＆CalibrationDefaults；如下图；每个离子均单独编辑积分事件；

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其中，一般SmoothWidth为1-2points，Noisepercentage为0~40%，BaselineSubtractWindow为峰宽；FlaggingRules编辑如下图；

编辑好后点击SAVE保存并命名，点击PROCESS开始处理；左侧会显示选中的Samples，ComponentsandGroups下可看到离子对；

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在表中More下拉菜单中选择ResultsTableDisplaySetting设置表格格式，可选择Ionratio离子比；

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4.8

关机操作

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A.在工作站中停止Analyst软件中所有正在运行的样品；

B.灭活HardwareConfiguration文件，退出Analyst软件，退出windows操作系统，关闭工作站电源；

C.按下质谱主机左后侧面板上的Vent按钮约3秒，分子涡轮泵将缓缓停下；

D.等待约15~30min，关闭质谱主机左后侧面板上的电源开关，机械真空泵将同时停止运行；

E.关闭氮气发生器电源开关；

F.如开液相，关闭液相色谱开关；

5.注意事项

5.1质谱未开启时，不得将液相流动相导入质谱内，否则易损坏质谱；

5.2液质联用的流动相不得含有非挥发性的磷酸盐，硫酸盐，钠盐，钾盐等；

5.3质谱仪和工作站电脑尽量保持常开，不关闭，春节长假除外；

5.4良好的真空状态可提高质谱仪灵敏度建议真空泵常开不关闭；

5.5为防止质谱仪质量轴发生偏移，需严格控制环境温度。

最佳温度范围18-22℃，不得超过25℃；检测过程中温度波动不得2℃/小时；

5.6冲柱时方法质谱仪切换阀选择进废液；

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