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作物育种信息

作物育种信息

第11期

总第175期2008年11月

主办单位：

四川省农作物育种攻关办公室

四川省科技厅农村科技处

主编：

蔡红

副主编：

郑林用雷波

本期责任编辑：

谢国禄

编辑出版：

四川省农科院信息所

《作物育种信息》编辑部

地址：

成都市净居寺路20号

邮编：

610066

电话：

（028）84504194

E-mail：

pbding@

要目

●常用DNA标记的评述及在花生上的应用

●不同甜高粱种质的SSR多态性分析

●利用分子标记鉴定玉米籽粒中控制类胡萝素含量的两个主要位点

●将玉米线粒体DNA插入核中产生广泛的插入位点变异

●在育种群体育成的小麦近等基因系中镶孢菌穗疫病抗性Fhb1QTL的确认

●温敏雄性不育两系水稻杂种产量和产量构成的配合力和杂种优势

●陆地棉种质中的肾形肾脏线虫抗性

●欧洲小麦条锈菌幼苗和成株抗性资源研究

●拜耳作物科学在印度启动其全球第一个抗白叶枯病的杂交水稻品种

●跨国公司和正在崛起的中国种子帝国

目录

【专题综述】

常用DNA标记的评述及在花生上的应用1

【前沿科技】

源于EST的微卫星作为燕麦分子标记的富集资源5

CP基因遗传转化甘蔗品种Badila与福农91-4621的抗病性差异分析5

不同甜高粱种质的SSR多态性分析6

甘蔗蔗糖合成酶基因的克隆6

几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶基因导入甘蔗7

大豆高蛋白基因分子标记及其在大豆育种中的应用7

普通菜豆抗炭疽病基因的分子标记与定位研究8

崖城系列甘蔗亲本遗传多样性的AFLP标记分析8

应用AFLP技术分析甘蔗引进品种的遗传多样性9

发芽玉米中的D4;1和D5细胞周期素蛋白：

相关激酶活性和植物激素调控9

利用CAPSTAO1902诊断控制番茄维管束萎蔫菌2号小种抗性的I-2基因10

利用分子标记鉴定玉米籽粒中控制类胡萝素含量的两个主要位点10

在斑豆×蚕豆杂交中ICABunsi蚕豆衍生的白霉菌抗性的QTL分析10

将玉米线粒体DNA插入核中产生广泛的插入位点变异11

在育种群体育成的小麦近等基因系中镰孢菌穗疫病抗性Fhb1QTL的确认11

采用无凝胶PCR-ELISA对含有小麦—黑麦易位的小麦基因型进行分子鉴定11

【技术与方法】

回交育种分析花生脂肪酸含量的变化12

温敏雄性不育两系水稻杂种产量和产量构成的配合力和杂种优势12

在Arina和NK93604杂交衍生的六倍体小麦群体中控制镰孢菌穗疫病抗性和低含量脱氧瓜萎镰菌醇的数量性状位点12

陆地棉种质中的肾形肾脏线虫抗性13

日本梨树和榅桲树早期花序发育的比较13

种植杂交玉米4轮时玉米根区的植物有益微生物的富集及其多样性13

向日葵黑茎病部分抗性的遗传分析14

大麦水涝耐性的配合力14

强化玉米营养的番茄红素环化酶的自然遗传变异14

利用联合收割机上近红外线光谱法评价油菜品质15

A3CMS在甜高粱育种中的可行性研究15

矮杆和半矮杆大豆突变体植株生长对外源GA3的响应15

不同高油花生品种（系）油分积累特性的模拟研究16

菜豆炭疽菌生理小种鉴定及普通菜豆种质的抗性评价16

大豆生物量积累、收获指数及产量间的相关与QTL分析17

大豆重组自交系JinfF10抗大豆孢囊线虫4号生理小种抗性的分析研究17

栽培高粱、甜高粱和拟高粱前中期染色体DAPI显带核型18

大豆菌核病拮抗菌株的筛选18

【材料与品种】

牛尾草地方群体和品种表型变异——利用野生资源改良品种的潜力19

欧洲小麦条锈菌幼苗和成株抗性资源研究19

拜耳作物科学在印度启动其全球第一个抗白叶枯病的杂交水稻品种19

大豆疫霉根腐病3号生理小种20

菜豆种质资源对枯萎病菌的抗性研究20

甘蔗栽培原种对蔗茅柄锈菌的抗性鉴定21

值得在旱地蔗区推广的甘蔗优良新品种21

能源用甜高粱杂交种辽甜3号选育21

野生花生种质的SSR遗传多样性22

中国花生核心种质的建立及与ICRISAT花生微核心种质的比较22

【科技纵横】

20多粒花生沉睡2100年23

温室栽培中早熟温州蜜柑的产量和影响产量波动的因素24

跨国公司和正在崛起的中国种子帝国24

高度表达合成Bacillusthuringiensiscry1A转基因的大豆特性25

甘露糖对甘蔗外植体再生的影响25

大豆雄性不育及杂种优势利用研究进展26

甲醇和抗坏血酸对蚕豆生长及丙二醛含量的影响26

再论中国粒用高粱育种方向与策略26

专题综述

常用DNA标记的评述及在花生上的应用

花生是世界性的油料与经济作物，是一种重要的植物性食用油和蛋白质来源，具有较高的经济价值。

基于花生在国民经济和人民生活中所占的重要地位，其遗传育种研究一直受到广泛重视。

由于花生染色体小、数目多，依靠形态标记、细胞学标记和生化标记建立遗传图谱难度很大。

DNA分子标记的兴起为花生研究注入了活力，它对花生新品种保护、良种保纯、杂种鉴定、种质资源研究、基因定位和标记辅助育种均具有重要意义。

相比其它遗传标记，分子标记具有以下突出优点：

（1）不受环境条件的影响，直接以遗传物质DNA的形式表现；

（2）遍布整个基因组；（3）多态性高；（4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达；（5）可鉴别纯合与杂合基因型，提供较完整的遗传信息；（6）分子标记可提前选择，加速了育种进程。

因此，分子标记一经出现，就被广泛用于植物遗传图谱的构建、基因定位、系统发育关系的分析、种质资源分类鉴定以及辅助选择育种等方面。

本文就分子标记在花生研究上的应用作一简要综述。

一、DNA分子标记类型

遗传研究中使用的分子标记很多，目前应用在花生种质资源及辅助育种的分子标记技术主要有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、SNP和TRAP等技术。

1.限制性片段长度多态性（RFLP）产生RFLP（restrictionfragmentlengthpolymor-

phism）的分子基础是DNA中特定的限制性酶切位点上碱基对的改变及酶切位点之间的分子重排事件（如缺失、易位、倒位等）。

用特定的限制性内切酶消化后，不同遗传组成个体间的DNA可产生大小不同的片段。

通过与克隆的特定DNA片段（探针）杂交和放射自显影等步骤可以检测到RFLP的存在。

该标记实验结果稳定可靠，在遗传上呈共显性。

缺点是所需DNA量较大（5～10g）,实验操作复杂，且探针具有种属特异性,目前尚难在育种中广泛应用。

2.随机扩增多态性DNA（RAPD）RAPD（randomamplifiedpolymorphicDNA）以人工合成的随机寡聚核苷序列为引物，以基因组总DNA为模板，利用PCR技术随机扩增得到一系列的多态性DNA片段，通过凝胶电泳将长短不同的DNA片段分开。

其操作简便快速，所需DNA量少（15～25ng）。

缺点是扩增产物易受反应条件的影响，实验结果重复性较差，而且一般在遗传上呈显性。

3.扩增片段长度多态性（RFLP）这是以PCR为基础的RFLP（amplifiedfragmentle-

ngthpolymorphism）技术。

基因组DNA经两个限制性内切酶酶切后，与特定接头相连接，然后用已标记的专用引物选择性地扩增限制性酶切片段，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，放射自显影检测DNA多态性。

AFLP兼具RAPD和RFLP的优点，快速高效，且结果稳定可靠，重复性好。

目前，该技术受专利保护，成本较高。

4.单核苷酸多态性标记（SNP）人类群体有很大的遗传多样性，在大多数基因位点上都会有若干个等位型；对每一个核苷酸来说，其突变率大约为10-9左右，这就意味着，每一个核苷酸在任何一代人群中大约每109个个体就会发生一次变异。

由这种方式产生的单碱基变异就形成许多双等位型标记SNP（singlenucleotidepolymorphism），这种标记在人类基因组中可达到300万个，平均约每1000个碱基对就会有一个。

因此，3～4个相邻的这种标记构成的单倍型（haplotype）就会有8～16种，相当于一个微卫星标记形成的多态性。

但是由于这种标记数目多，覆盖密度大，因而在基因定位的研究中就有着其它标记系统不可比拟的优越性和潜力。

这种标记的开发和应用摒弃了遗传标记分析技术的“瓶颈”凝胶电泳，为DNA芯片技术应用于遗传作图提供了基础。

5.微卫星DNA（SSR）真核生物的基因组中存在许多串联短的DNA重复序列，它分布于整个基因组的不同位置上，其重复长度有高度的变异性，但微卫星DNA两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。

根据两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术，可扩增两个位点之间的微卫星DNA序列，然后用电泳分析核心序列的长度多态性。

SSR（simplesequencerepeats）标记的多态性丰富，重复性好，遗传上呈共显性。

此外，植物中常用的分子标记还有ISH（insituDNAhybridization,DNA原位杂交）、STS（sequencetaggedsite,序列标签位点）、SCAR（sequencecharacterizedamplifiedregion,序列特异扩增区域）等。

6.目标区域扩增多态性（TRAP）这是一种新的基于PCR的植物基因型标记技术，具有简单、稳定、效率高的特点。

借助日益增长的庞大的生物序列信息，TRAP（targetregionamplificationpolymorphism）利用生物信息工具和EST数据库信息，产生目标候选基因区多态性标记。

TRAP技术采用两个18核苷酸引物产生标记。

一个为固定引物，依据EST序列设计；另一个为随机引物，针对外显子和内含子的特点，设计为分别富含GC或AT核心区的任意序列。

通过对目标区域PCR扩增，产生围绕目标候选基因序列的多态性标记。

作为一种新型的植物基因分型技术，TRAP不但有RAPD技术易于操作的特点，还有AFLP技术强大功能的优势，这将使它在种质资源的基因鉴定和作物的理想农艺性状基因标记上很有帮助。

二、分子标记在花生上的应用研究

花生DNA分子标记研究始于RFLP和RAPD研究，近年来SSR、AFLP等标记技术逐步得以应用。

1.花生属内种质进化研究花生属的起源和进化已有许多学者从形态学、细胞学等方面进行了广泛深入的研究，初步明确了一些种的进化。

分子标记技术的产生和发展为花生种质进化研究又增添了一项新的手段。

花生属在植物分类学上分为9个亚属，共有69个经过描述的种。

唐荣华等（2004）选出16个可在多粒型花生品种DNA中扩增出多态性片段的SSR引物，每个SSR引物能扩增出1～7个DNA片段，在24个花生品种中能扩增出1～23条多态性片段。

根据SSR分子标记计算出品种间遗传距离0.09～0.82，平均为0.59。

聚类分析结果说明所分析的24个花生种质可分为不同的品种群。

Dwivedi等（2001）用RAPD技术在26个花生品种中筛选出8个引物，其遗传相似性由59.0%到98.8%，平均为86.2%。

贺梁琼等（2005）对44份材料进行SSR分析，40对SSR引物中有3对引物能在部分杂交后代中稳定的扩增出野生亲本的特异谱带，表明这些材料整合了野生亲本的遗传物质。

2.研究花生的遗传多样性对花生育种工作者而言，种质资源的遗传多样性及其亲缘关系信息是至关重要的，这是育种工作的基础。

利用分子标记技术对骨干品种进行分类研究，通过聚类分析，估算遗传距离，建立树状图，对研究种质资源多样性，指导科学地配置杂交组合具有重要的作用。

He等（1996，2005）通过DAF和AFLP技术对花生栽培种作DNA标记多态性鉴定。

在559个DAF引物中有17个检出多态性，其中15个引物为UBC10聚体引物，平均每个基因型的每个引物产生近18条带，其中3.7条具多态性。

64对AFLP引物中有28对可检测出DNA多态性，总共检测出111个多态性位点，每对引物平均检测出57.8条带，每对引物有3.96条带具多态性。

Hopkins等（1999）以标记的串联重复序列为探针筛选花生基因组DNA文库，获得多态性SSR引物6个；SSR引物在栽培花生中揭示的多态性高，19份被鉴定的栽培花生种质出现17条特征基因型。

叶冰莹等（1999）用RAPD技术分析了12个花生品种的遗传多样性，从80个随机引物中筛选出20个进行扩增，共扩增出132条具有多态性的条带。

韩柱强等（2003）利用11对SSR引物对24个栽培花生种（包括4大类型）进行PCR扩增分析，其中4对检测到明显的多态性。

根据扩增结果可以将21个品种相互区分。

姜慧芳和任小平（2002）利用RAPD技术对7个不同植物学类型的花生种质资源进行了分析，在所用的83个随机引物中，13个引物的扩增产物显示出不同品种间的多态性，15.7%的引物能显示花生品种间DNA多态性；这13个引物共扩增出26条具多态性的片段。

陈强等（2003）对32个来源于中国不同产地的花生品种进行了AFLP指纹图谱及相似性聚类分析，结果表明，所有供试花生品种的遗传相似性为35%，在45%的相似性水平上分为3个群，表明中国花生品种存在遗传多态性。

3.花生分子标记图谱构建利用花生品种间的DNA多态性，构建分子标记图谱，可为生产上品种真实性和纯度鉴定以及品种知识产权的保护，在分子水平上提供依据。

李双铃等（2006）在对10个花生品种的AFLP分析中，利用MseⅠ和EcoRⅠ酶切和9对引物组合共扩增产生169条带，其中55条为多态性的，其多态性带比率为32.54%。

Herselman（2003）对21个花生栽培品种进行了AFLP分析，EcoRⅠ/MseⅠ和64对引物组合共扩增出2053条带，其中63条为多态性带；而MluⅠ/MseⅠ和16对引物组合扩增出1188条带，其中27条为多态性带。

因此，用AFLP技术进行品种鉴定和指纹图谱绘制时应选择扩增谱带多态性强，数目多的引物组合。

翁跃进等（1999）利用AFLP技术对9份花生抗旱品种绘制指纹图谱，通过引物E-ACA和与相应的M-CAG和M-CAT，在300～6000bp的范围内共获得1577条AFLP扩增产物，每个品种有主带和次带至少71条之多，其中10条为多态性的带纹。

Cacia等（1996）利用A.stenosperma×A.car-

denasii的杂交后代与A.stenosperma回交群体构建了基于RAPD的基因图谱，并将与对线虫抗性有关的RAPD标记绘于图谱上。

Halward等（1993;1994）利用二倍体野生种种间杂交（A.stenosperma×A.cardenasii）后代群体，构建出花生的RFLP图谱，定位了分布在11个连锁群上的117个RFLP标记，其中编码脂肪生物合成酶的基因的3个cDNA克隆已被定位在图谱上。

4.分子标记辅助育种选择是育种中最重要的环节之一。

传统的基于表型的选择方法存在许多缺点，效率较低。

分子标记为实现对基因型的直接选择提供了可能。

利用与目标性状紧密连锁的分子标记可在生育早期阶段进行选择，从而大大提高育种效率，加快育种进程。

吴兰荣等（2003）利用花生野生种A.cardenasii与铁岭四粒红杂交，并以染色体加倍获得栽野杂种后代，经多代自交选择，获得具有早熟、抗病、农艺性状较好的新种质材料8126。

应用RAPD分子标记技术鉴定8126，从76个引物中筛选出3个特异引物OPE2、OPF8、OPF20，能在8126中稳定地扩增出野生亲本的特异谱带，表明8126整合了野生亲本的遗传物质。

RAPD特异谱带可以作为8126中野生亲本A.cardenasii的特异遗传标记。

5.花生根瘤菌研究分子标记技术在花生根瘤菌的分类和多态性研究中得到广泛应用。

Van-Rossum（1995）结合RAPD分析结果对17个Bradyrhizobiumsp和1个Azorhizobium菌株作了比较。

研究表明17个Bradyrhizobium菌株仅有2个rDNA同源组，与Rhodopseud-

omonaspalustris、Nitrobactersp、Afipiasp和Blastobacterdenitrificans相似性很高，而与α-Proteobacteria和Rhizobiaceae相似性较低。

杨江科等（2002）对花生根瘤菌的系统发育和遗传多样性进行了RAPD和RFLP研究分析；研究表明花生根瘤菌的遗传多样性及其在系统发育中的地位主要受地域因素的影响，即总体上从平原腹地到外缘地区，根瘤菌地理分隔作用逐渐明显，并且根瘤菌的多样性最为丰富出现在平原外缘的交接地带。

Urtz和Elkan（1996）研究了与花生共生的Bradyrhizobium的遗传多样性；用RFLP分析发现来自南非的分离菌变异性丰富，其中一些分离菌nif和nod基因RFLP图谱相似，表明其共生基因具有一定相关性。

RFLP和DNA同源分析结果说明，花生根瘤菌具丰富的遗传多样性，但16SrRNA基因测序结果则表现出多样性不明显。

陈强等（1999，2003a）对21株慢生型花生根瘤菌和6株参比菌进行了16SrDNAPCR-RFLP分析；结果证实了慢生型花生根瘤菌同慢生型大豆根瘤菌高度的遗传相似性外，还发现一些菌株同有较高的遗传相似性，证明中国的花生根瘤菌之间具有种水平的多样性。

6.研究花生青枯菌花生青枯病抗性在遗传上受寡基因控制，如珍珠豆型花生的抗性受2对主效基因控制，花生青枯病简单抗性遗传基础为分子标记的建立和基因的克隆提供了可能。

Liao等（1998）研究证明花生对青枯菌潜伏侵染反应特性存在遗传分化。

2000年起中国与国际半干旱研究所合作开展了花生青枯病抗性的分子标记及辅助选择技术研究，发现了不同花生抗病基因型间的AFLP和SSR多态性，建立了青枯病抗性的重组近交系（RI）群体。

Taghvi等（1994）根据16个菌株16SrRNA序列分析数据得到两组特异PCR引物。

一组可分离属于RFLPDivisionⅠ（生物型3、4）的青枯菌；一组可分离RFLPDivisisonⅡ

（生物型1、2、N2）的青枯菌菌株。

Seal和Mehan（1994）通过P.solanacearum16SrRNA序列分析和基因组减法实验，分析出花生青枯菌特异性DNA序列，据此设计PCR引物，建立了迅速鉴定生物型3、4或5的PCR方法。

姜惠芳等（2003）以抗青枯病品种“9102”与感病品种“中花5号”杂交，构建了青枯病抗性重组近交系群体（RILs），用164对SSR引物鉴定亲本DNA多态性及其最佳反应体系和反应条件，获得能检测RIU群体多态性的引物11对及其最佳反应体系和反应条件。

7.花生线虫病研究标记辅助选择（MAS）是在花生栽培种中找到对线虫抗性的一种办法。

郑经武和李德葆（1998）用RAPD技术筛选出具北方根结线虫鉴定特征的特异性扩增条带，经克隆测序，设计了特异引物。

通过PCR可将北方根结线虫幼虫DNA鉴定出来。

Cacia等（1996）从高抗品系GA6中鉴定出与抗线虫有关的RAPD标记。

该标记定位于回交图谱上A.cardenasii种质渗入区，可将其转换为SCAR标记。

Burow等（1996）利用抗线虫野生种A.batizocoi、A.cardenasii、A.diogoi与栽培种杂交育成品系T×AG-7，从而构成了BC4F2抗性分离群体，并采用BSA法获得了3个与抗线虫有关的RAPD标记。

8.花生抗黄曲霉研究花生对黄曲霉菌侵染的抗性是以种皮的特殊生化成分及种皮的完整性抵御黄曲霉菌的侵染与定殖，从而减低或避免花生中的黄曲霉毒素污染。

培育和利用抗黄曲霉的花生品种是控制毒素污染最理想的途径，分子标记在这个过程中起到了积极作用。

雷永等（2005）利用抗、感黄曲霉侵染的花生品种为亲本配制杂交组合“中花5号×J11”，以其F2分离群体为研究材料，采用AFLP技术和BSA分析方法，获得了与花生黄曲霉菌侵染抗性连锁的2个分子标记，标记与抗性间的遗传距离分别为8.8cM和6.6cM；利用获得的分子标记对抗、感黄曲霉的花生种质资源进行了分子鉴定，结果表明分子标记与抗性鉴定结果具有较高的一致性，证实了两标记应用于研究群体之外的育种潜力。

该抗侵染分子标记的建立为开展花生抗黄曲霉侵染辅助选择育种提供了有效的筛选技术，该技术较Rania等（2001）的方法更优。

三、展望

从国际范围看，花生DNA分子标记的研究明显落后于其他作物，在国内有关研究也刚刚起步。

花生栽培种形态学性状变异丰富，而DNA多态性贫乏。

其原因可能是有限数目主基因和若干修饰基因改变导致形态学性状改变，DNA水平差异大的不常见，而碱基替换作用通过RFLP、RAPD不易检出所致。

研究发现，SSR较RFLP、RAPD可揭示出更丰富的多态性，应在图谱构建中加以利用。

但目前开发的SSR引物还很少，且尚未定位，难以满足花生遗传育种上的需求。

设计、开发大量多态性好的分子标记相当必要。

随着分子标记技术的日益完善,将分子标记和其他遗传标记以及传统育种相结合，我们将发现和利用越来越多蕴藏于花生种质资源中的遗传多样性。

可以相信，在结构和功能基因组以及生物信息学迅猛发展的背景下,分子标记技术必将在花生遗传改良和育种研究中发挥越来越重要的作用。

（分子植物育种2008年第1期，刘峰等）

前沿科技

源于EST的微卫星作为燕麦分子标记的富集资源

因为基于PCR的微卫星标记具有其显性遗传的特点和适用于高通量分析，所以它是一种有价值的分子育种工具。

因为在燕麦中的数量有限，所以要显著增加其数量来覆盖整个基因组。

因此，对7031个近来发表的EST进行了筛选。

接着的芯片分析建立了AME（源于燕麦EST的微卫星位点）的216对引物。

采用一组12个燕麦品系作样本，分析表明195个功能引物中107个具有多态性。

标记变异为平均每个位点3个等位基因且多态信息含量值为0.42，该变异说明它们适合燕麦分子育种的目的。

有51个AME位点位于已知的‘Kanota’בOgle’参考图谱中，该图谱以前仅含12个微卫星位点。

因此，可以显著提高燕麦图谱微卫星位点总数量。

向平摘译自PlantBreeding126（3）：

274-278，2007

CP基因遗传转化甘蔗品种Badila与福农91-4621的抗病性差异分析

植物病毒主要依赖于寄主自身复制转录体系完成繁殖和侵染,故干扰病毒的复制和转录即能延迟或减轻病毒病害。

自1986年,美国Beachy研究小组首次将烟草花叶病毒（tabacomosaicvirus,TMV）的外壳蛋白基因转入烟草获得抗病毒植株以来,植物抗病毒基因工程技术发展迅速。

外壳蛋白（coatprotein,CP）是目前研究得最为透彻的病毒蛋白之一,除了把病毒RNA包装成病毒粒子起保护作用外,还具有影响病毒系统侵染、蚜传活动、病毒在细胞间的运动及症状诱导等功能。

Potyvirus属CP的N端变异很大,即使同一个病毒的分离物在长度和组成上变化也很大,对病毒的运动起辅助作用,因为N-末端发生突变后使病毒的细胞间扩展变慢。

在蚜传的病毒CP蛋白N端存在一个特殊保守基序DAG（Asp-Ala-Gly）,DAG的突变能产生非蚜传株系。

大部分有关丧失全部或部分蚜传能力的研究表明,蚜传能力丧失与病毒外壳蛋白变化有关,其主要原因是DAG区域突变后C