复习题3 细胞生物学研究方法.docx
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复习题3细胞生物学研究方法
第三章复习题：
基本概念：
1.分辨率resovingpower：
指人眼或显微镜在25cm明视距离处，能分辨被检物体细微结构最小距离的能力，其单位为长度单位，常用的有毫米、微米、纳米等。
2.冰冻蚀刻freezeetching电子显微镜技术：
是为配合透射电镜观察而设计的一种标本制作技术。
其原理及过程是用快速低温冷冻法将样品迅速冷冻，然后在低温下进行断裂。
这时，样品往往从其结构相对脆弱的部位（膜脂双分子层的疏水端）断裂，从而显示出镶嵌在膜脂中蛋白质颗粒。
由于冰在真空中少量升华，可进一步增强浮雕式的蚀刻效果。
用铂、金等金属进行倾斜喷镀，以形成对应于凹凸的电子反差，在经碳垂直于断面进行真空喷镀形成一个连续的碳膜，然后，用消化液把赝品本身消化掉，将剩下的碳膜及其构成图形的金属微粒移到载网上用电镜进行观察。
冰冻蚀刻技术主要用于观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构，图形富有立体感，样品不需包埋甚至也不需固定，同时能更好地保持样品的真实结构。
它是研究生物膜内部结构的一种有用技术。
3.细胞化学法：
是一类经典的细胞生物学实验方法，其特点是不依赖经验染色技术，而是基于已有的化学反应，在细胞原位上显示出细胞的化学成分以及在不同条件下的形态、成分和功能的综合变化，将结构和机能更紧密地联系在一起。
为了能在完好的结构上同时显示其化学物质，细胞化学技术必须满足下列要求：
保持细胞在生活状态下的结构；保持细胞内的生前化学成分及酶活性；进行的方法是已知的化学反应；具有高度特异性；反应产物是一种有色物质，能形成稳定的沉淀，定位精确，或者电子密度高以供电子显微镜观察用。
4.Schiff反应：
细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。
这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应：
可以特定显示DNA的分布，酸水解可以去除RNA，并去除DNA上嘌呤脱氧核糖核酸上的嘌呤，使脱氧核糖核酸的醛基曝露，自由的醛基与Schiff反应呈紫红色）。
5.显微放射自显影microautoradiography：
是将放射性分子引入机体或细胞,使其渗入生物大分子,或结合于一定部位.在利用放射性同位素的电离辐射对乳胶的感光作用显示样品中放射物质的所在.由此指示某种生物大分子质合成及部位,或特定物质的定位.
放射自显影术（radioautography；autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等，其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。
然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。
6.电子显微镜三维重构技术:
是电子显微术\电子衍射与计算机图像处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术.尤其适用于分析难以形成三维晶体的膜蛋白以及病毒和蛋白质核酸复合物等大的复合体的三维结构.其基本步骤是对生物样品在电镜中不同倾角下进行拍照,得到一系列电子显微镜图片后在经傅立叶变换等处理,从而展现出大分子及其复合物三维结构的电子密度图.
7.密度梯度离心densitygradientcentrifugation:
是细胞组分通过某些梯度密度溶液离心使得各个成分互相分开的技术.操作时应将要分离细胞组分小心地铺在含有密度不断增加的、形成密度梯度的高溶解性的惰性物质（如蔗糖）溶液的表面。
在这种条件下进行离心，不同组分以不同的沉降速率沉降，形成不同的沉淀带，而使不同的组分得以分离。
8.差速离心differentialcentrifugation:
是利用不同速度离心所产生的不同离心力将各亚细胞组分或各种颗粒分次沉淀的分离技术。
8.荧光原位杂交fluorescentinsituhybridization,FISH：
是在细胞保持基本形态的情况下将荧光探针注入细胞内与DNA或RNA杂交，通过观察荧光标记物的杂交位置来定位染色体或其他结构的标记技术。
根据所用探针种类和要检测核酸的不同可分为DNA-DNA、RNA–DNA、RNA-RNA杂交。
无论哪一种杂交，其基本程序都是适当处理是细胞通透性增加，探针进入细胞内与DNA或RNA杂交、洗脱等步骤。
9.细胞株cellstrain和细胞系cellline:
原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞生长出现停滞，大部分细胞衰老死亡，但有极少数细胞可渡过危机而存活下去。
这些存活的细胞一般可顺利地传40~50代次，并且仍然保持原来染色体的二倍体数量及接触抑制的行为。
很多学者把这种传代细胞称为细胞株。
一般情况下，当细胞株传至50代后又要出现危机，不能再传下去。
但如有部分细胞发生了遗传突变，产生癌细胞的特点，有可能在培养条件下无限制地传下去，这种传代细胞称为细胞系。
细胞系细胞的根本特点是染色体明显改变，一般呈现亚二倍体或非整倍体，失去接触抑制的细胞容易传代培养。
10.原代细胞培养：
是指直接从有机体中取得细胞或组织后立即进行的培养，严格的说是指成功继代之前的培养，此时细胞保持原有的基本性质，通常把第一代到第十代以内的培养细胞统称为元代细胞培养。
11.核酸的杂交：
通过互补的DNA或RNA探针与研究的DNA或RNA之间进行碱基配对，分离或鉴定特异的核酸片断。
也可用于比较两个核酸之间的相似性。
12.显微操作技术（micromanipulationtechnique）是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器（micrcmanipulator）进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。
显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。
13.分子杂交技术（molecularhybridization）是在研究DNA分子复性变化基础上发展起来的一种技术。
其原理是，具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。
这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。
14.细胞融合:
真核细胞通过介导和培养，两个或多个细胞合并成一个双核或多核细胞的过程称为细胞融合（cellfusion）.基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。
15、核酸的杂交：
通过互补的DNA或RNA探针与研究的DNA或RNA之间进行碱基配对，分离或鉴定特异的核酸片断。
也可用于比较两个核酸之间的相似性。
问答题：
1.简述细胞生物学的主要研究方法？
代表细胞生物学传统和发展方向的研究方法，可以分为四大方面。
（1）显微技术，这是进行细胞形态结构观察的方法，包括光学显微术、电子显微术和扫描隧道显微术等，目前的分辨本领已达到0.1nm的水平，可以直接观察到DNA、RNA和蛋白质等生物大分子及生物膜、病毒等结构。
（2）细胞组分的分析与原为检测技术，这类方法可对亚细胞结构和生物大分子进行分离和纯化，并可在细胞的原位上检测亚细胞结构和某些大分子的存在状况；（3）细胞培养和细胞工程技术，这是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究和生物工程中重要的实验技术，具有广泛的、重要的理论意义和实践价值；（4）分子生物学技术，如核酸和蛋白成分的分析和序列测定；核酸的杂交、PCR、基因的克隆与表达以及基因的剔除、RNA干扰技术等，这些都是当今细胞生物学研究中常常使用的实验方法。
而且一些物理、化学和信息处理技术也正在被用于细胞生物学的研究。
现代细胞生物学的方法及其多样和处于不断的发展当中。
2.简述动物转基因技术的过程。
转基因动物技术是一项复杂而且涉及内容广泛的技术，其制作过程如下：
（1）克隆目的基因；
（2）给目的基因接上适当的启动子元件；（3）外源基因的导入，即利用显微操作或其他方法将外源基因注射到动物早期胚胎中，再把胚胎植入动物子宫内；（4）外源基因整合与表达的检测。
转入基因一般是随机整合到宿主动物基因组，但并非所有的外源基因都能整合到动物基因组，而整合的基因也并非都能表达。
因此需要对转基因动物进行严格的检测和筛选。
在转基因动物制作中，基因转移是影响外源基因整合效率的关键步骤，也是技术难度最大的步骤。
3.在进行细胞组分的分离时，实验方案设计的一般原则是什么？
根据不同的细胞器或分子具有不同的体积与密度，通过离心力场的作用加以分离。
根据这两个主要因素可设计不同的离心方法：
速度离心、等密度离心等。
4．匹配题：
从下列20种方法中挑选一种最佳方法来探测下面的10个问题。
a.电子显微镜三维成像与X射线衍射及核磁共振技术；
b.southern杂交；
c.扫描电镜技术；
d.细胞显微分光光度法；
e.免疫荧光技术；
f.电子显微镜超薄技术；
g.Northern杂交；
h.放射自显影技术；
I.超离心技术；
j.DNA序列分析；
k.原位杂交技术；
l.Western杂交技术；
m.单克隆抗体技术；
n.电子显微镜复染技术；
o.细胞融合技术；
p.流式细胞术；
q.免疫电子显微镜技术；
r.冷冻蚀刻复型技术；
s.细胞培养技术；
t.显微操作技术。
问题：
1.高等动物克隆的制作（T）。
2.某种抗癌药物的作用机制是阻止肿瘤细胞的DNA复制还是阻止蛋白质合成（H）。
3.已克隆了鸡卵清蛋白的基因，如何证明在雏鸡的输卵管中该基因不转录而在产卵母鸡输卵管中活跃的转录（G）。
4.已克隆了人的rDNA，问rDNA分布在人的那几条染色体上（K）。
5.研究线粒体中F0-F1-ATP酶、泛素依赖性蛋白水解酶复合体的结构机作用机制（A）。
6.体外细胞培养，从G1期到S期，细胞表面形态结构的变化（C）。
7.研究表皮生长因子受体分布的部位及其合成、转运和降解的动态过程（Q）。
8.原代培养细胞长成致密蛋层，由于接触抑制作用DNA合成停止，如何证明（P）。
9.观察县病毒衣壳表面的亚单位-衣粒形态与排列方式（N）。
10.研究酵母菌在无氧和有氧条件下生长时，其线粒体形态结构的变化（F）。
katonglang@nkbbs.org
1. 超微结构是如何定义的?
也称为亚显微结构，指在电镜下所观察到的细胞结构，如细胞核、线粒体、高尔基体等细胞器的微细结构。
显微结构是指在光镜下所观察到样品的各种结构，如细胞大小、外部形态以及细胞核、线粒体等内部构成都属于显微结构。
2. 相差与微分干涉显微镜在用途上有何区别?
微分干涉差显微镜是在相差显微镜原理的基础上发明的。
相差显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。
微分干涉差显微镜与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。
微分干涉显微镜使细胞的结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。
目前像基因注入、核移植、转基因等的显微操作常在这种显微镜下进行。
相差显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。
微分干涉显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。
微分干涉显微镜利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：
偏振器（polarizer）、微分干涉显微镜棱镜、微分干涉显微镜滑行器和检偏器（analyzer）。
偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。
在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜，即微分干涉显微镜棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。
聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。
最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。
在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜，即微分干涉显微镜滑行器，它把两束光波合并成一束。
这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。
最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。
在光束形成目镜微分干涉显微镜影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。
检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。
x和y波的光程差决定着透光的多少。
光程差值为0时，没有光穿过检偏器；光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。
于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。
为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节微分干涉显微镜滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。
调节微分干涉显微镜滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。
细胞融合与细胞杂交有何区别?
细胞融合（cellfusion）又称细胞杂交（cellhybridization），是指两个或两个以上的细胞融合成一个细胞的现象。
没有什么区别只是叫法不一样。
4.所做习题中的第五项为何选C?
扫描电镜观察的不是已经死亡的细胞吗?
有动态变化?
第七项与第七项有何区别?
观察的不是已经死亡的细胞吗?
因为观察的是细胞表面形态结构的变化，题目中并没有给出观察活体细胞，观察表面的结构最好用扫描电镜。
第七项看的是线粒体的结构变化，必须用透射电镜。
用扫描电镜没法观察它的结构。
3.STM与（电子显微镜三维成像与X射线衍射技术及核磁共振技术）的用途是否等同?
若不同,区别是什么?
不等同。
各有各的用途。
STM适合观察细胞内质网膜系统和细胞骨架系统等细胞内的复杂网络。
也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。
三维重构技术适合分析不能形成三维晶体的膜蛋白以及病毒、蛋白质-核酸复合物等大的复合体的三维结构。
X衍射线衍射技术是能够根据X-射线通过结晶样品形成的衍射样式成像。
这一技术可用于在原子分辨的水平上推测分子的结构。
实际上X-射线衍射技术是目前在原子水平上分析蛋白质、核酸和其他生物分子的惟一方法。
核磁共振技术可以直接研究溶液或细胞中分子量较小的蛋白质、核酸以及其他的分子的结构。
电子显微镜三维成像（重构）理论运用的数学原理：
将一个密度函数进行三维傅立叶变换，密度函数就变为频率函数。
这样一个三维信息就压缩到一个二维平面上,这就是电镜照片的情况。
取一个中心截面,那么一个投影的富氏变换就相当于一个三维富氏变换的中心截面。
根据这样的原理，就可以根据投影得到的信息通过三维变换来算出分子在的结构。
比如,分子在溶液中不同的去向,分子直立或躺倒的状态，在电镜观察时，投影是不一样的，然后将投影进行傅立叶变换，理论上说,如果得到足够多的投影,就是得到分子在所有方向上的投影,然后进行傅氏变换,就可得到三维结构.这就是三维重构的具体原理。
根据样品台的特点，在实际操作中有不同的方法。
对于二维结构,怎么得到不同的截面呢？
可以从水平开始,倾斜不同角度,以得到投影。
这样的技术存在一个问题：
由于样品台倾斜角度的限制,只能在0-70度之间转动,不可能从0度倾斜到90度，所以70-90度之间没有信息,这就是一个视锥问题,分辨率只有3-5埃米.第二种情况就是对于在溶液中的分子,分子取向是随机分布的,所以只要分子数量足够多,所观察的现象就可得到在不同方向上的投影,也不必旋转载物台,不必倾斜角度.以上二维结构和溶液中分子的观察,都是叠加后取平均分布结果.还有一种情况就是对于大的物体,如细胞器,细胞,由于存在个体差异,不可能用平均分布,这时就要摄取一个细胞进行照相,进行不同角度倾斜,同样由于视锥问题,70-90度之间没有数据。
三维重构技术适合分析不能形成三维晶体的膜蛋白以及病毒、蛋白质-核酸复合物等大的复合体的三维结构。
X衍射线衍射技术是能够根据X-射线通过结晶样品形成的衍射样式成像。
这一技术可用于在原子分辨的水平上推测分子的结构。
实际上X-射线衍射技术是目前在原子水平上分析蛋白质、核酸和其他生物分子的惟一方法。
核磁共振技术可以直接研究溶液或细胞中分子量较小的蛋白质、核酸以及其他的分子的结构。
它的原理是，原子核有自旋运动，在恒定的磁场中，自旋的原子核将围绕外加磁场作回旋运动，也称进动，进动的频率与所加磁场的强度成正比。
如果在此基础上再加一个固定频率的电磁波，并调节外加磁场的强度，使进动频率与电磁波频率相同。
这时原子核的进动与电磁波产生共振，就称作核磁共振。
核磁共振时，原子核吸收电磁波的能量，记录下的吸收曲线就是核磁共振谱。
由于不同分子中原子核的化学环境不同，将会有不同的共振频率，产生不同的共振谱，记录这种波谱就可以判断该原子在分子中所处的位置及相对数目。
用以进行定量分析及分子质量的测定，并对有机化合物进行结构分析。
5.X衍射线衍射技术及核磁共振技术的用途是否一样？
X-衍射技术并不涉及显微镜，但是能够根据X-射线通过结晶样品形成的衍射样式成像。
这一技术可用于在原子分辨的水平上推测分子的结构。
实际上X-射线衍射技术是目前在原子水平上分析蛋白质、核酸和其他生物分子的惟一方法。
Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型的主要依据之一就是根据Franklin对DNA晶体衍射的结果.
X-射线晶体学技术，这是唯一能给出高分辨率的技术,他可以分辨到一个原子水平，这是X-射线晶体学的优点，现在测定一个大分子，最基础的根据就是X－射线晶体学；它的缺点是首先要拿到晶体,但是不是所有的生物大分子都能够获得晶体，有些大分子的复合物晶体获得比较困难,所以有些大分子达不到测定的要求；其次分子在晶体中往往是被锁定于某一状态,晶体培养的时间较长,所得到的晶体往往是分子处于基态,而分子功能的行使多发生在激发态,过渡态，X－射线晶体技术很难捕捉的分子的功能状态。
核磁共振衍射技术同样具有高分辨率的特点,仅次于X-射线晶体学技术,另外可以在溶液中操作,接近生理状态,缺点是所作样品的分子量要比较小,一般在50KD以下,而且分子量越大所测到的谱线就越多，有时各谱线很难分辨，所以有时波谱不容易分辨.当然随着超导磁铁的发展,有可能分子量向大分子挺进，但还是有一定限制。
另外核磁共振衍射技术的反应体系是溶液,这对不溶的蛋白比较困难,如膜蛋白,很难溶解，需要用去垢剂才可溶解,这就使研究复杂化。
在核磁共振衍射的观察中,去垢剂会造成很大的噪音和假相.
与前两种技术不同，以上两种方法都是间接观察,都是利用衍射谱.而先进的冷冻电子显微镜是直接观察生物大分子,是直接看到分子，因此这样的性质就决定分子越大反而越好，越利于观察,因此原则上来讲用冷冻电子显微镜观察分子，分子的大小没有上限,可用于复杂大分子,超分子体系。
另外由于这种技术的特点，它可以捕捉到活化的过渡状态，可以研究分子的功能状态.另外适于薄体系,二维平面。
冷冻电子显微镜最大的缺点是低分辨率,最高只达到3埃米,这是很难达到的,而X-射线晶体学技术分辨率是1埃米,核磁共振衍射技术分辨率是2埃米.
X-射线晶体学技术,核磁共振衍射技术能看到分子，但只能在体外观察,体内的状态无法观察。
冷冻电子显微镜可以直接观察。
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