大连海洋大学微生物上课讲义第六章.docx

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大连海洋大学微生物上课讲义第六章

第六章微生物的生长及其控制

　　一个微生物细胞在适宜的环境条件下，会不断地吸收营养物质，并按照自己的代谢方式不断进行新陈代谢。

如果同化作用的速度超过了异化作用，则其原生质的总量（重量、体积、大小）就不断增加，于是出现了个体细胞的生长；如果这是一种平衡生长，即各种细胞组分是按恰当比例增长时，则达到一定程度后就会引起个体数目的增加，对单细胞微生物来说，这就是繁殖，不久原有的个体已发展成一个群体。

随着群体中各个个体的进一步生长繁殖，就引起了这一群体的生长。

群体的生长可用其重量、体积、个体密度等指标来测定。

微生物学中的生长一般是指群体生长

第一节　测定生长繁殖的方法

一、测生长量

（一）直接法

　　1.测体积

　　2.称干重微生物的干重一般为其湿重的10%～20%

　　优点：

可适用于一切微生物；缺点，无法区分活菌和死菌

（二）间接法

　　1.比浊法细菌培养物在其生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高。

在一定波长下（一般选用450nm～650nm波段），测定细菌培养物的光密度，以光密度（opticaldensity,即OD）表示菌量。

实验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确

　　优点：

比较准确

　　2.测含氮量大多数细菌的含氮量为其干重的12.5%，酵母菌为7.5%，霉菌为6.5%。

根据其含氮量再乘以6.25，即可测得其粗蛋白的含量

二、计繁殖数

（一）直接法

　　采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（样品计数室都是由400个小格组成,体积为1mm2×0.1mm）

　　每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10000×稀释倍数

　　优点：

简便、快速、直观

缺点：

不能区分死菌与活菌，不适于对运动细菌的计数，需要相对高的细菌浓度，个体小的细菌在显微镜下难以观察图

AODC法见《青岛海洋大学学报》，1992年第22卷第3期

（二）间接法

　　1.平板菌落计数法（图示）

　　采用平板菌落计数法要求操作熟练、准确，否则难以得到正确的结果

（1）样品充分混匀

（2）每支移液管及涂布棒只能接触一个稀释度的菌液

　　（3）同一稀释度三个以上重复,取平均值

　　（4）每个平板上的菌落数目合适，便于准确计数

　　一个菌落可能是多个细胞一起形成，所以在科研中一般用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示，而不是直接表示为细胞数

　　优点：

可以获得活菌的信息

　　缺点：

操作较繁需要培养一段时间才能取得，易受多种因素的影响图

　　2.液体稀释法（Themostprobablenumbermethod，最大可能数法）

　　主要适用于只能进行液体培养的微生物，或采用液体鉴别培养基进行直接鉴定并计数的微生物

　　根据活菌在液体培养基中会使其变混浊。

对未知菌样作连续的10倍系列稀释，然后根据估算取多个连续的稀释度平行接种多支试管（3～5管），经培养后，记录每个稀释度生长的管数，然后查MPN表，再根据样品的稀释倍数就可计算出其中的活菌含量

　　优点：

可计算活菌数，较准确

　　缺点：

比较繁琐

　　3.滤膜法

　　样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器，然后将膜转到相应的培养基上进行培养，对形成的菌落进行统计

　　4.DVC法见《青岛海洋大学学报，1992年第22卷第3期

　　5.厌氧菌的菌落计数法

　　亨盖特滚管培养法（参见第四节）

　　半固体深层琼脂法见《微生物学报》，1997年第37卷第1期

 第二节微生物的生长规律

一、细菌的个体生长和同步生长

　　同步培养技术：

设法使某一群体中的所有个体细胞都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后通过分析此群体在各个阶段的生物化学特性变化，来了解单个细胞的相应变化规律

　　同步生长：

通过同步培养技术而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的状态

　　获得微生物同步生长的方法

　　1.环境条件诱导法

（1）温度控制：

低温→最适温度

（2）培养基成分控制：

营养不足→营养丰富

　　（3）用氯霉素抑制细菌蛋白质合成：

抑制生长→完全培养基

　　（4）光照控制：

黑暗→光照

　　（5）细菌芽孢诱导发芽：

热处理芽孢菌培养物→芽孢加入新鲜培养

　　2.机械筛选法

　　过滤法、密度梯度离心法、硝酸纤维素滤膜法图

　　由于细胞的个体差异，同步生长往往只能维持2～3个世代，随后又逐渐转变为随机生长

二、单细胞微生物的典型生长曲线

　　定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线。

当少量纯种单细胞微生物接种到恒定容积的液体培养基后，在适宜的温度通气等条件下，它们的群体就会有规律地生长起来。

如果以细胞数目的对数值为纵坐标，以培养时间为横坐标，就可画出一条有规律的曲线，这就是微生物的典型生长曲线。

根据微生物的生长速率常数，即每小时分裂次数（R）的不同，可把典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期

（一）延滞期

　　指少量微生物接种到新鲜培养基后，在开始的一段时间细胞数目不立即增加或增加很少的时期

　　特点：

　　①生长速率常数接近于零

　　②细胞形态变大或增长

　　③细胞内RNA含量增高，原生质呈嗜碱性

　　④合成代谢活跃，易产生诱导酶

　　⑤对外界不良条件反应敏感

　　细胞处于活跃生长中，只是分裂迟缓。

在此阶段后期，少数细胞开始分裂，曲线略有上升

　　产生的原因：

微生物接种到新的环境，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶和辅酶，或是缺乏充足的中间代谢物

　　影响延滞期长短的因素：

　　①菌种

　　②接种龄

　　③接种量

　　④培养基成分

　　缩短延滞期的措施：

　　①通过遗传学方法改变种的遗传特性

　　②利用指数生长期的细胞作为种子

　　③适当扩大接种量

　　④尽量使接种前后所使用的培养基组成不要相差太大

（二）指数期

　　指在生长曲线中，紧接着延滞期的一个细胞以几何级数速度分裂的一段时期

　　特点：

　　①生长速率常数最大，代时最短

　　②细胞进行平衡生长，菌体内各种成分最为均匀

　　③酶系活跃，代谢旺盛

　　三个重要参数：

繁殖代数（n），生长速率常数（R），代时（G）-每繁殖一代所需要的时间

　　n=3.322（lgx2-lgx1）

　　R=3.322（lgx2-lgx1）/t2-t1

　　G=t2-t1/3.322（lgx2-lgx1）

　　影响指数期微生物代时长短的因素很多，主要是：

　　①菌种

　　②营养成分

　　③营养物浓度，凡处于低浓度范围内可影响生长速率和菌体产量的某营养物，称为生长限制因子

　　④培养温度

　　指数期的微生物因其具有整个群体的生理特性较一致，细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点，故是发酵工业中用作种子的最佳材料，是增殖噬菌体的最适宿主，是发酵工业中用作种子的最佳材料

　　（三）稳定期

　　特点：

　　①生长速率常数等于零

　　②菌体产量达到最高点，生长产量常数Y

　　③细胞开始贮存贮藏物

　　④多数芽孢菌开始形成芽孢

　　⑤有的微生物开始合成抗生素等次生代谢产物

　　稳定期产生的原因主要是：

　　①营养物尤其是生长限制因子的耗尽

　　②营养物的比例失调

　　③酸、醇、毒素或H2O2等有害代谢产物的积累

　　④pH、氧化还原势等物化条件越来越不适宜，等等

　　稳定期的生长规律对生产实战的指导意义：

对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物（SCP、乳酸等）为目的的某些发酵生产来说，稳定期是最佳收获期；对维生素、碱基、氨基酸等物质进行生物测定来说，稳定期是最佳测定时期；此外，对稳定期到来的原因的研究，促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建

　　（四）衰亡期

　　特点：

　　①群体呈现负生长

　　②细胞形态多样

　　③有的菌发生自溶

　　④有的菌产生或释放次生代谢产物

　　⑤芽孢释放

　　衰亡期产生的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体死亡

　　由于采用活菌计数比较麻烦，并要求严格进行操作，否则不易得到准确的结果，重复性也差，因此在实际工作中多采用分光光度计测定OD值的方法绘制细菌的生长曲线Flash

三、微生物的连续培养

连续培养：

在微生物的整个培养期间，通过一定的方式使微生物能以恒定的比生长速率生长并能持续生长下去的一种培养方法图

　　培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物是实现微生物连续培养的基本原则

　　按控制方式，连续培养器分两种类型，恒浊器和恒化器

　　恒浊器：

是一种根据培养器内微生物的生长密度，并借光电控制系统来控制培养液流速，以取得菌体密度高、生长速度恒定的微生物细胞的连续培养器

　　恒化器：

是一种设法使培养液的流速保持不变，并使微生物始终在低于其最高生长速率的条件下进行生长繁殖的连续培养装置。

这是一种通过控制某一营养物的浓度（碳源、氮源、无机盐、生长因子），使其始终成为生长限制因子的条件下达到的Flash

　　连续培养如用于生产实战，就称为连续发酵

　　优点：

　　①高效，节约，减少非生产时间，提高设备利用率

　　②自动化控制

　　③产量、质量稳定

　　缺点：

　　①菌种退化，连续时间有限

　　②设备要求高

　　③营养物质的利用率低

四、微生物的高密度培养

　　概念：

指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术

　　进行高密度培养时，应综合考虑和运用以下规律，以达到最佳效果

　　1.选取最佳培养基成分和各成分的含量

　　2.补料

　　3.提高溶解氧的浓度

　　4.防止有害代谢产物的生成

第三节影响微生物生长的主要因素

一、温度

　　温度的变化都会对每种类型微生物的代谢过程产生影响，通过改变它们的生长速率，以适应温度的变化而生存

　　生长温度的三个基点：

最低生长温度；最适生长温度；最高生长温度。

　　最适生长温度（最适温度）：

某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度

　　对同一种微生物来说，最适生长温度并非一切生理过程的最适温度，也就是说，最适温度并不等于生长得率最高时的培养温度，也不等于发酵速率或积累代谢产物最高时的培养温度，更不等于积累某一代谢产物最高时的培养温度。

　　温度对微生物生长的影响具体体现在：

　　1.对酶活性的影响

　　2.影响细胞质膜组分的流动性

　　3.影响物质的溶解度

二、氧气

　　根据氧和微生物生长的关系，可将微生物分为专性好氧菌、微好氧菌、耐氧菌、兼性厌氧菌和专性厌氧菌

　　1.专性好氧菌必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。

如醋杆菌属、固氮菌属等

　　2.兼性厌氧菌在有氧或无氧条件下均能生长，但在有氧的条件下生长的更好；在有氧时靠呼吸产能，无氧时靠发酵和无氧呼吸产能；细胞含SOD和过氧化氢酶。

如酿酒酵母、大肠杆菌等

　　3.微好氧菌当有少量氧存在时能生长，也是通过呼吸链并以氧作为最终氢受体而产能；细胞含SOD和过氧化氢酶。

如霍乱弧菌等

　　4.耐氧菌可在分子氧存在下进行发酵性厌氧生活的厌氧菌；生长不需要氧，但分子氧对它们也无害；不具呼吸链，靠发酵和底物水平磷酸化产能；细胞含SOD和过氧化物酶。

如乳酸乳杆菌、肠膜名串珠菌等

　　5.专性厌氧菌分子氧对其有毒，即使短暂接触空气，也会抑制其生长甚至致死，无法在固体或半固体培养基表面生长，只能在其深层无氧或在低氧化还原电势的环境下才能生长；通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵获得能量；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。

如梭菌属、产甲烷菌等图

氧对厌氧菌的毒害机制：

生物体内极易产生的超氧阴离子自由基，可破坏各种重要的生物大分子和膜结构，还可形成其他活性氧化物，故对生物体极其有害。

厌氧菌因为不能合成SOD，所以根本无法是超氧阴离子自由基歧化成过氧化氢，因此，在有氧存在时，它们体内形成的超氧阴离子自由基就使自身受到毒害图

三、pH值

　　几乎所有的微生物在pH＝4.0～9.0之间都可以生长。

但不同的微生物都有其最适宜的生长pH值和一定的生长pH范围。

细菌、藻类、原生动物最适pH＝6.5～7.5，但pH＝4.0～10也可以生长。

特殊的硫化菌在pH＝1.0～2.0下生长，硝化菌在pH11生长

　　放线菌最适pH＝7.5～8.0,pH＝5.0～10也可以生长。

霉菌、酵母最适pH＝5.0～6.0,pH＝1.5～10都可生长。

　　pH值影响微生物生长的主要作用在于：

　　1.引起细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物质的吸收

　　2.影响代谢过程中酶的活性

　　3.改变生长环境中营养物质的可给性以及有害物质的毒性

　　正如温度对微生物的影响一样，微生物生长繁殖的最适pH与其合成某种代谢产物的pH通常是不一样的

　　虽然微生物外环境的pH变化很大，但细胞内的pH相当稳定，近中性

微生物的生命活动也会能动地改变外界环境的pH表

调节措施：

培养基变酸时，加氢氧化钠、碳酸钠等碱中和或加适量氮源，提高通气量；变碱时，加硫酸、盐酸等中和，或加适当碳源，降低通气量表

第四节微生物培养法概论

　　良好微生物培养装置的基本条件：

按微生物的生长规律进行科学的设计，能在提供丰富而均匀营养物质的基础上，保证微生物获得适宜的温度和良好的通气条件（厌氧菌例外），此外，还要为微生物提供一个适宜的物化条件和严防杂菌的污染等

　　微生物培养装置的类型和发展规律：

　　①从少量培养到大规模培养

　　②从浅层培养到厚层（固体制曲）或深层（液体搅拌）培养　　

　　③以固体技术培养为主到以液体培养技术为主

　　④从静止式液体培养发展到通气搅拌式的液体培养

　　⑤从单批培养发展到连续培养以至多级连续培养

　　⑥从利用分散的微生物细胞发展到利用固定化细胞

　　⑦从单纯利用微生物细胞到利用动物、植物细胞进行大规模培养

　　⑧从利用野生型菌种发展到利用变异株直至遗传工程菌株

　　⑨从单菌发酵发展到混菌发酵

　　⑩从低密度培养发展到高密度培养

　　⑾从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐

一、实验室培养法

（一）固体培养法

　　1.好氧菌的固体培养

　　试管斜面、培养皿琼脂平板、克氏扁瓶和茄子瓶等平板

　　2.厌氧菌的固体培养

（1）高层琼脂柱

（2）厌氧培养皿

　　Brewer皿、Bray皿、Spray皿图

　　（3）亨盖特滚管技术

　　利用除氧铜柱制备高纯度的氮，并用高纯氮驱除小环境中的空气，使培养基的配置、分装、灭菌和贮存，以及菌种的接种、培养、观察、分离、移种和保藏等过程始终处于高度无氧条件下，从而保证严格厌氧菌的存活

　　用严格厌氧方法配置、分装、灭菌后的厌氧培养基称为预还原无氧灭菌培养基即PRAS培养基图

　　（4）厌氧罐技术图

　　（5）厌氧手套箱技术图

表

（二）液体培养法

　　1.好氧菌的液体培养

（1）试管液体培养

（2）三角瓶浅层液体培养

　　（3）摇瓶培养

　　（4）台式发酵罐

　　2.厌氧菌的液体培养

二、生产实战中培养微生物的装置

（一）固态培养法

　　1.好氧菌的曲法培养

　　曲的构成和功能表

　　瓶曲、袋曲、通风曲等图

　　2.厌氧菌的堆积培养法

（二）液体培养法

　　1.好氧菌的培养

（1）浅盘培养

（2）深层液体通气培养

　　发酵罐也可叫做生物反应器，一般是一钢质圆筒形直立容器，其底和盖为扁球形，高与直径之比一般为1∶2～2.5，在其内外装配着各种各样的管道、阀门和仪表

　　发酵罐的主要作用是要为微生物提供丰富、均匀的养料，良好的通气和搅拌，适宜的温度和pH，并能消除泡沫和确保防止杂菌的污染等。

为此，除了罐体有相应的各种结构外，还需要配备与它相适应的设备或系统，如培养基配制罐、储液罐、菌种扩大培养系统、无菌空气供应系统、动力系统、后处理设备等图

　　2.厌氧菌的大规模培养

　　厌氧菌大型发酵罐与好氧发酵罐相比则较为简单，因为省去无菌空气供应的装置和系统及搅拌设备

 第五节有害微生物的控制

一、几个基本概念

　　1.灭　菌

　　采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。

分杀菌和溶菌两种

　　2.消　毒

　　采用较温和的理化因素，今杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌，而对被消毒的物体基本无害的措施

　　3.防　腐

　　利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。

防腐的措施很多，主要有：

　　①低温②缺氧③干燥④高渗⑤高酸度⑥高醇度　⑦加防腐剂

　　4.化疗

利用具有高选择毒力即对病原菌具有高度毒力而对宿主基本无毒的化学物质来抑制宿主体内病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该宿主传染病的一种措施。

用于化学治疗目的的化学物质称为化学治疗剂表

二、物理灭菌因素的代表-高温

（一）高温灭菌的种类

　　原理：

高温的致死作用，主要是它可引起蛋白质、核酸和脂类等重要生物高分子发生降解或改变其空间结构等，从而变性或破坏

　　1.干热灭菌法

（1）火燃灼烧法接种针、接种环的灭菌

（2）烘箱内热空气灭菌法150～170℃维持1～2h；140℃，4h；160℃，2h；170℃，1h。

　　金属器械、玻璃器皿的灭菌

　　2.湿热灭菌法

（1）常压法

　　①巴氏消毒法指对牛奶、啤酒、果酒或酱油等不能进行高温灭菌的液体进行的一种消毒方法，其目的是杀死其中无芽孢的病原菌，而又不影响它们的风味。

70～72℃，15分；65℃；30分。

现在牛奶135～150℃，2～6秒（超高温消毒法）

　　②煮沸消毒法100℃数分钟。

饮用水的消毒。

　　③间歇灭菌法适用于不耐热培养基的灭菌。

将待灭菌的培养基在100℃下蒸煮30min，再置于室温或37℃下保温过夜，如此重复3天，即可在较低温度下达到彻底灭菌的效果

（2）加压法

　　①高压蒸汽灭菌法121℃维持15～20min。

含糖培养基115℃维持35min。

培养基、多种器材和物料的灭菌

　　②连续加压蒸汽灭菌法发酵行业称“连消法”，用于大型发酵厂大批培养基的灭菌。

135～140℃维持5～15s。

培养基在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却，然后流进发酵罐

　　利用温度进行杀菌的定量指标有两种：

　　热死时间：

指在某一温度下，杀死某微生物的水悬浮液群体所需的最短时间。

如，大肠杆菌在60℃下为0min

　　热死温度：

指在一定时间内（一般为10min），杀死某微生物的悬浮液群体所需的最低温度

（二）影响加压蒸汽灭菌效果的因素

　　1.灭菌物体的含菌量

　　2.灭菌锅空气的排除程度

　　3.灭菌对象的pH值

　　4.灭菌对象的体积

　　5.加热与散热的速度

　　（三）高温对培养基成分的有害影响及其防止

　　1.有害影响

产生褐变的机制：

主要是由氨基化合物与羰基化合物间发生复杂的梅拉特反应所引起表

　　2.防止法

（1）采用特殊的加热灭菌法

（2）过滤除菌法

　　（3）其他方法

三、化学杀菌剂、消毒剂和治疗剂

（一）表面消毒剂

　　表面消毒剂：

指对一切活细胞都有毒性，不能做活细胞或机体内治疗用的化学药剂

　　石炭酸系数：

指在一定时间内（10min）被试药剂能杀死全部供试菌（伤寒沙门氏菌）的最高稀释度与达到同效的石炭酸的最高稀释度之比

　　①苯酚及其衍生物：

5%苯酚；来苏儿（2%煤酚皂）

　　②卤素：

氯气，漂白粉等

　　③醇类：

70-75%乙醇

　　④氧化剂：

O3，H2O2，高锰酸钾

　　⑤甲醛：

37%甲醛（福尔马林）

　　常用无菌室灭菌:

4M3空间，35ml福尔马林+17.5mg高锰酸钾，熏蒸，密闭过夜参见书P179表6～10

　　化学物质的抗微生物能力的测定：

　　• 液体培养法：

最低抑制浓度[minimuminhibitoryconcentration（MIC）]实验图

　　• 平板培养法：

抑菌圈（zoneofinhibition）试验图

（二）抗代谢药物的代表-磺胺类药物

　　抗代谢药物：

指一类在化学结构上与细胞内必要的代谢物结构相似，并可干扰正常代谢活动的化学物质

　　磺胺类药物，对-氨基苯磺酰胺

　　磺胺的作用机制：

对-氨基苯甲酸是微生物细胞中合成叶酸的底物,叶酸作为辅酶，携带一碳单位，用来合成嘧啶、嘌呤和某些氨基酸（Met，Ser）。

磺胺类药物被微生物吸收后取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸的合成，抑制了转甲基反应，导致代谢的紊乱，从而抑制生长图

　　（三）抗生素

　　抗生素：

是一类由微生物或其他生物生命活动过程中合成的次生代谢产物或人工衍生物，它们在很低的浓度时就能抑制或干扰它种生物的生命活动，因而可用作优良的化学治疗剂

　　抗生素的作用机制：

　　1.抑制细胞壁合成

　　2.破坏细胞膜

　　3.作用于呼吸链

　　4.抑制蛋白质和核酸的合成　　参见P183表6～11

　　抗菌谱：

　　由于不同微生物之间的细胞化学结构和代谢的差异，不同的抗生素的抗菌谱各异

　　微生物的抗药性：

（1）产生一种能使药物失去活性的酶

（2）把药物作用的靶位加以修饰和改变

　　（3）形成“救护途径”

　　（4）使药物不能透过细胞膜

　　（5）通过主动外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞外