技术室操作规范.docx
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技术室操作规范
4.17.5.1常规病理制片应按照相应的规范，有质量控制措施和记录。
【C】
1.有对蜡块、切片、取材工作记录单三相核对的规定与程度。
（1）针对不同组织（如小活检、骨组织、淋巴结等），优化制片、染色流程、保证切片质量。
（2）制片过程中如出现异常，应立即与有关的病理医师联系，并报告科主任，查清事实，采取相应的补救措施。
常规制片应在取材后1-2个工作日内完成。
2.内镜小的活检、穿刺等需连续切片不少于6片。
常规切片的优良率应≥90%。
【A】符合“C”，并
1.有完整资料证实上述规定和程序得到有效执行。
2.常规切片的优良率≥95%。
【A】符合“B”，并
常规切片的优良率应≥98%。
苏木精-伊红（HE）染色程序
常规石蜡切片HE染色
（1）二甲苯Ⅰ：
10min；
（2）二甲苯Ⅱ：
10min；
（3）无水乙醇Ⅰ:
1-3min；
（4）无水乙醇Ⅱ:
1-3min；
（5）95%乙醇Ⅰ：
1-3min；
（6）95%乙醇Ⅱ：
1-3min；
（7）80%乙醇：
1min；
（8）蒸馏水：
1min；
（9）苏木精液染色：
10min;
（10）流水冲洗去苏木精液：
1min；
（11）1%盐酸-乙醇：
1-3s（显微镜下观察效果）；
（12）稍水洗：
1-2s；
（13）返蓝（用温水或1%氨水等）：
5-10s；
（14）流水冲洗：
1-2min；
（15）蒸馏水洗：
1-2min；
（16）0.5%伊红液染色：
1-3min；
（17）蒸馏水稍洗：
1-2s；
（18）80%乙醇：
1-2s；
（19）95%乙醇Ⅰ：
2-3min；
（20）95%乙醇Ⅱ：
2-3min；
（21）无水乙醇Ⅰ：
3-5min；
（22）无水乙醇Ⅱ：
3-5min；
（23）二甲苯Ⅰ：
3-5min；
（24）二甲苯Ⅱ：
3-5min；
（25）中性树胶封固。
常规组织石蜡切片制备的基本要求及质量的基本标准
1.组织制片过程中,应确保切片号与蜡块号一致。
2.制片工作一般应在取材后2个工作日内完成（不含需要脱钙、脱脂等特殊处理的标本）。
3.制片完成后，技术人员应检查制片质量，并加贴标有本病理科病理号的标签。
常规石蜡包埋-HE染色片的优良率（甲、乙级切片所占的比例）≥90%，优级率（甲级切片所占的比例）≥35%。
不合格切片应立即重做。
切片质量的基本标准如下：
优质标准
满分（分）
质量缺陷减分
组织切片完整，内镜咬检、穿刺标本切面数不少于6块
10
组织稍不完整：
减1-3；不完整：
减4-10分；未达到到规定面数：
减5分
切片薄（3-5μm），厚薄均匀
10
切片厚（细胞重叠），影响诊断：
减6-10分；厚薄不均匀：
减3-5分
切片无刀痕、裂隙、颤痕
10
有刀痕、裂隙、颤痕，尚不影响诊断：
减2分；有刀痕、裂隙、颤痕，影响诊断：
减5分
切片平坦，无皱褶、折叠
10
有皱褶或折叠，尚不影响诊断：
各减2分；有皱褶或折叠，影响诊断：
各减5分
切片无污染
10
有污染物：
减10分
无气泡（切片与载玻片间/盖玻片与切片、载玻片间），盖玻片周围无胶液外溢
10
有气泡：
减3分；胶液外溢：
减3分
透明度好
10
透明度差：
减1-3；组织结构模糊：
减5-7分
细胞核与细胞质染色对比清晰
10
细胞核着色灰蓝或过蓝;减5分；红（细胞质）与蓝（细胞核）对比不清晰：
减5分
切片无松散，裱贴位置适当
10
切片松散：
减5分；切片裱贴位置不当：
减5分
切片整洁，标签端正粘牢，编号清晰
10
切片不整洁：
减3分；标签粘贴不牢：
减3分；编号不清晰;减4分
合计
100
注：
切片质量分级标准：
①甲级片：
≥90分（优）；②乙级片：
75-89（良）；③丙级片：
60-74分（基本合格）；④丁级片：
≤59分（不合格）
4.制片过程发生意外情况时，有关技术人员和技术室负责人应及时向病理科主任报告，并积极设法予以补救。
5.制片完成后，技术人员应将所制切片与其相应的活检申请单/活检记录单、取材工作单等进行认真核对，确认无误后，将切片连同相关的活检申请单/活检记录单、取材工作单等一并移交给病理医师。
双方经核对无误后，办理移交签字手续。
4.17.5.2有制度保证术中快速病理（含快速石蜡）诊断的规范、准确。
【C】
1.有保证术中决速病理诊断合理使用指征的规定与程序.
2.有单件标本的冰冻切片制片应在15分钟内完成的规定与程序.
3.有病理诊断报告在30分钟内完成的规定与程序.
4.术中快速病理诊断准确率应≥90%。
5.有术中快速病理诊断的操作规定与程序.
（1）在术前向患者或近亲属告知术中快速病理诊断的局限性，签署术中快速病理诊断知情同意书。
（2）对于难以明确诊断、交界性病变、送检组织不适宜等状况，病理医师可以不作出明确诊断、等待石蜡切片报告。
（3）术中快速病理诊断报告必须采用书面形式（可传真或网络传输），为防止误听和误传，严禁采用口头或电话报告的形式。
（4）从标本接收到发出报告的时间，应在病理申请单上注明，术中快速病理诊断报告书应由病理医师签署全名。
【B】符合“C”，并
1.有完整资料证实上述制度得到有效执行。
2.术中快速病理诊断准确率≥95%。
3.抽查相关人员能按规定流程操作。
【A】符合“B”，并
有临床科室和病理科的沟通协调机制，保证冰冻切片诊断的及时性和准确性。
冰冻切片的制备
1.完成冰冻HE染色切片制备的时间通常为15-20min；
2.恒冷箱切片机制片：
至少应于切片前1小时开机预冷，冷室温度一般为零下15-20℃，常规开展冷冻切片快速病理学诊断的病理科，恒冷箱切片机宜处于24小时恒温待机状态。
3.需经行冰冻切片的组织不能做任何固定，应尽快送至病理科，认真核对交接后，由负责当天病理诊断的医生进行取材，切取适宜大小（厚度＜2mm）的可疑病变组织，并尽快置于冰冻组织切片机上制备切片。
4.调节冷冻程度，试切合适时便迅速切片。
冷冻不足时无法切片，冷冻过度时切片易碎。
5.切取好的冰冻切片应立即投入专用固定液中经行固定。
6.冰冻切片HE染色
（1）冰冻切片固定：
1-2min；
（2）稍水洗：
1-2s；
（3）苏木精液染色（60℃）30-60s；
其余同石蜡切片。
7..制片完成后，技术人员应将所制该例病人的所有冰冻切片与其相应的冰冻申请单/活检记录单、取材工作单等进行认真核对，确认无误后，将切片连同相关的冰冻申请单/活检记录单、取材工作单等一并移交给病理医师。
双方经核对无误后，办理移交签字手续。
4.17.6.7有制度保证特殊染色操作规范
【C】
1.有特殊染色技术员经过专门培训与授权的规定与程序。
（1）每一批次的特殊染色必须设阳性对照及阴性对照，可利用组织中的内对照。
（2）每种特殊染色，必须有本实验室的操作规范和技术规范。
（3）染色液必须充分掩盖组织。
（4）使用过程中瓶盖及滴管不能混淆。
（5）一般的特染试剂做避光及4℃冰箱保存。
（6）更换新的染色试剂后，必须使用染色阳性和阴性组织进行验证，并有相应的文字记录和染色切片档案，相关档案保留2年。
（7）特殊染色时所产生的有毒的污染性液体应专门回收，严禁随处倾倒。
（8）特殊染色结果不能作为最终诊断，必须有病理医师结合形态学综合诊断。
（9）特殊染色质量达到室间质评的合格标准，有相关操作规定与流程。
【B】符合“C”，并
1.有完整资料证实上述制度得到有效执行。
2.通过实验室室内质控与室间质控，提高特殊染色的质量
【A】符合“B”，并
根据医学新进展，及时改进特殊染色技术，提高特殊染色质量。
Masson三色染色规范
1、染色步骤
1）切片脱蜡至水；
2）苏木素精染色液染色3-5min，水洗返蓝；
3）滴入masson改良三色染料（丽春红、酸性品红、桔黄G液）染色5-10min，水洗至无染料脱落；
4）0.2%醋酸溶液洗30-60s；
5）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
2、染色结果
胶原纤维、粘液、软骨呈绿色或蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质纤维呈红色，胞核呈蓝黑色。
糖原染色操作规范
1．染色步骤
1）切片脱蜡至水；
2）滴入高碘酸染色5min，蒸馏水洗；
3）滴入schiff氏试剂染色5-10min（背景过深时，可用亚硫酸氢钠液分化或缩短染色时间）；
4）流水冲洗10min；
5）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
2．染色结果
糖原、中性粘液物质呈红色。
网状纤维染色操作规范
1．操作步骤
1）切片脱蜡至水，蒸馏水洗；
2）滴入0.5%高锰酸钾氧化1min，流水洗涤1-2min；
3）滴入2%草酸漂白至切片无色，流水洗涤1-2min；
4）滴入2%硫酸铁铵媒染2min，流水洗涤再蒸馏水洗，组织边缘用滤纸吸干；
5）将促染液注入等量银氨液中混合均匀后，滴入切片，在湿盒中，温度25-37℃，反应8min；
6）不能直接倾去反应液，应用蒸馏水从边缘注入速洗一次，冲去银膜即可；
7）滴入10%甲醛还原1min至组织变成棕黑色，流水冲洗数分钟；
8）用氯化金调色液调色20-30s，充分水洗；
9）过梯度酒精，二甲苯透明，中性树胶封固。
2．染色结果
网状纤维呈黑色，胶原纤维呈深黄色-浅褐色，胞核呈灰黑色
粘液染色操作规范
1、染色步骤
1）切片脱蜡至水；
2）滴入爱先蓝染液（PH2.5）染色5-10min，流水冲洗至无染料脱落；
3）滴入0.5%高碘酸氧化5min，蒸馏水洗；
4）于暗处，滴加schiff氏试剂加盖染色5-10min，流水冲洗10min，（背景过深时，可用硫酸氢钠液分化或缩短染色时间）；
5）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
2、染色结果
酸性粘液呈蓝色，中性粘液呈红色，混合粘液呈紫红色。
淀粉样物质染色操作规范
1、染色步骤
1）切片脱蜡至水；
2）甲醇刚果红液染10min，倾去余液；
3）用碱性乙醇急速分化数秒，镜下控制；
4）流水冲洗5min；
5）苏木素液浅染细胞核，必要时用盐酸酒精分化数秒；
6）流水冲洗10min；
7）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
2、染色结果
淀粉样物质、红细胞呈粉红色或红色，细胞核呈蓝色，基底无色。
抗酸杆菌染色操作规范
1、染色步骤
1）切片脱蜡至水；
2）将石碳酸品红液滴入切片上（切片上覆盖吸水纸）后加热，使之冒蒸气（不能沸腾）约5min，使之冷却；
3）入1%盐酸酒精20s至1min，脱色至无红色出现为止；
4）入甲烯蓝进行对比染色数秒；
5）水洗后矣干，然后进行透明和封固。
2、染色结果
抗酸杆菌为红色，其他细菌为蓝色。
六胺银染色操作规范
1、染色步骤
1）切片脱蜡至水；
2）1%过碘酸水溶液染10min；
3）自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗；
4）浸入加热至55-60℃的六胺银溶液于温箱水孵育30min-2h，至切片呈棕黑色，用滤纸擦去组织周围银液，用蒸馏水洗；
5）0.2%氯化金水溶液调色；
6）蒸馏水洗；
7）HE复染；
8）梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。
2、染色结果
基底膜、网状纤维和Ⅳ型胶原呈黑色，细胞核蓝黑色，背景粉红色。
4.17.5.3有制度保证免疫组织化学染色操作的规范和准确
【C】
1.免疫组化技术员经过专门培训与考核授权的相关规定和程序。
2.有相关操作规定与程序文件。
（1）每一批次的免疫组化染色必须设阳性对照及阴性对照，可利用组织中的内对照。
（2）必须建立本实验室每种免疫组化染色的操作规程，并及时更新。
（3）更换抗体后，需要有用阳性和阴性组织进行有效性验证，并有相应的文字记录和染色切片档案，相关档案保留2年。
（4）免疫组化染色过程中产生的有毒液体（如DAB）应专门回收，严禁随处倾倒。
（5）病理医师必须熟悉各种抗体染色结果，阳性信号表达部位，其诊断应用范围，以期做到正确的结果判读。
（6）单纯的免疫组化染色结果不能作为最终诊断，必须由病理医师结合形态学综合判断。
3.免疫组化染色的质量要达到室间质评的合格标准。
【B】符合“C”，并
1.有完整资料证实上述制度得到有效执行。
2.通过实验室室内质控与室间质控，提高免疫组化染色的质量。
【A】符合“B”，并
【B】根据医学新进展，及时改进特殊染色技术，提高免疫组化染色质量。
免疫组织化学技术
一、免疫组织化学染色前的准备事项
（一）组织切片的制备
常规切片脱蜡至水（组织固定需用10%中性甲醛）
（二）抗体的选择、稀释和保存
1.选择抗体应先了解其反应谱和适用条件〔包括适用切片（石蜡切片抑或冷冻切片）、稀释度和温育时间等〕。
2.对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材（已知阳性切片/涂片）进行预试验;根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度。
3.抗体的原液应于分装后置于一20℃冷室中保存，切勿反复冻存（以免效价降低）。
4.抗体的工作液可置于4℃冰箱中保存。
5.抗体的稀释。
（1）一般用0.01MPBS（生理盐水磷酸盐缓冲液），pH值7.2。
（2）或用0.05MTBS（生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液），pH值7.6。
（3）必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。
（三）被检测组织内抗原的修复
1.经4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。
进行免疫组织化学染色前，对于组织切片进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。
有的抗体不需要进行抗原修复。
应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。
2.抗原修复缓冲液。
（l）一般为0.01M柠檬酸缓冲液（2.1g柠檬酸溶于100ml蒸馏水中，用2M
NaOH调节pH值至6.0）。
（2）有些抗体需要特殊修复缓冲液，如高PH值的EDTA（50mMTris.，10mMEDTA，pH9.0），或商品化的该高pH修复液等。
3.抗原修复的常用方法。
（l）胰蛋白酶消化法:
①组织切片脱蜡、水化。
②滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。
③37℃下温育20~40min（温育时间取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原）。
④蒸馏水冲洗，终止反应。
⑤阻断内源性过氧化物酶。
⑥进行免疫组织化学染色。
〔配制0.1%胰蛋白酶液时，应将0.1g胰蛋白酶溶于0.1%无水氯化钙水溶液（pH值7.8）中。
〕
（2）胃蛋白酶消化法:
①组织切片脱蜡、水化.
②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。
③37℃下温育10一30min（一般为10min，可延至30min，取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短）.
④浸人蒸馏水，终止反应。
⑤进行免疫组织化学染色。
用1%胰蛋白酶液37℃下处理20min。
（应以0.IMHCI配制胃蛋白酶工作液。
过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片脱落。
）
（3）微波修复抗原法:
①组织切片脱蜡、水化（硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片）。
②将组织切片置于容器（塑料盒或玻璃缸）中，并向其中加人抗原修复液200ml，盖上具有小孔的盖子。
③将该容器置于微波炉（705一800W）中央加热（95℃）5min，2次（于两次之间，应向容器中添加蒸馏水50ml，严防组织切片干燥）。
④将该容器移出微波炉，置于室温下冷却15一20min。
⑤蒸馏水冲洗。
⑥阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。
⑦用TBS或PBS液冲洗。
⑧进行免疫组织化学染色。
（4）热水浴法:
①组织切片脱蜡、水化（硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片）。
②向装组织切片的容器加人足量（例如200ml）抗原缓冲液，置于水浴锅中，加热至95一99℃（不沸腾）预热。
③将组织切片插人已预热的容器内，温育20~40min。
④将该容器由微波炉移出，置于室温下冷却20min。
⑤室温下，用TBS、PBS或水洗。
⑥蒸馏水冲洗。
⑦阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。
⑧用TBS或PBS液冲洗。
⑨进行免疫组织化学染色。
（5）压力锅法:
①组织切片脱蜡、水化（硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片）。
②向4~5.5L的不锈钢压力锅中加人抗原修复缓冲液（约为锅容积的2/3），不加阀情况下加热至沸腾。
③将组织切片插放于金属切片架上，并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。
④加阀情况下，将组织切片加压2min。
⑤压力锅自行冷却或以流水冷却减压后，持续20min。
⑥将冷却后的切片取出，蒸馏水冲洗后，置于TBS或PBS液中（以免组织切片干燥）。
⑦蒸馏水冲洗。
⑧阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。
⑨用TBs或PBS液冲洗。
⑩进行免疫组织化学染色。
（四）组织切片中内源性酶的阻断
1.内源性过氧化物酶主要存在于红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞了嗜酸性粒细胞和组织内。
阻断方法:
最常用0.3%~0.5%H2O2-甲醇液，作用15~30min，阻断液必须使用时新鲜配制。
由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变性（使特异性着色减弱），而大部分组织不含有内源性过氧化物酶，所以阻断内源性过氧化物酶一般不必作为常规步骤。
必须阻断内源性过氧化物酶时，可安排在第一抗体反应后进行，以减少抗原的破坏。
2.内源性碱性磷酸酶主要存在于嗜中性粒细胞和内皮细胞。
阻断方法:
应用1M左旋咪唑，作用15~30min。
3.内源性生物素肝、胰、肾等的细胞内含有多量生物素或类生物素物质。
阻断方法:
先将切片浸于卵白素（0.5μg/ml）中15min，以缓冲液洗净后，移浸于生物素饱和溶液中15min，再用缓冲液洗去多余的生物素饱和液;也可应用商供的阻断试剂盒（按说明书操作）。
（五）正常血清保护
作为检测试剂的抗体蛋白带有一定的负电荷，免疫组织化学染色时，易与带有正电荷的组织〔特别是纤维组织、变性和（或）坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等〕发生静电吸引而导致非特异性染色。
去除这种非特异性染色最有效的方法是，在滴加第一抗体前，先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或是滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，浓度为1：
5~1：
20;必要时可滴加2%~5%牛血清清蛋白。
正常血清保护作用时间10一20min。
用于阻断非特异性结合的血清不能有明显的溶血。
（六）缓冲液
用于稀释抗体，洗涤切片的缓冲液主要有两种。
1.TBS（0.05M，pH7.6），
Tris一HCl缓冲液（0.SM，pH7.6）100ml
8.5%NaClI00ml
蒸馏水加至1000ml
’Tris一HCI缓冲液（0.5M，pH7.6）
三经甲基氨基甲烷（Tris）61g
HCl37ml_
蒸馏水加至1000ml
2.PBS（0.IM，pH7.6）
Na2HPO4·12H2O229g
NaH2PO4·2H2O3g
NaCl85g
蒸馏水加至1000ml
使用时用蒸馏水稀释10倍即成0·0lM。
二、免疫组织化学染色常用方法
（一）直接法
1.脱蜡和水化。
2.3%过氧化氢或0.5%过氧化氢甲醇液，5min。
3.TBS或PBS缓冲液洗涤。
4.抗原修复。
5.无关动物正常血清（适当稀释）20~30min。
6.甩去正常动物血清，滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记抗体，或增强的酶标多聚物一步法（EnhancedPolymerOne-stepStaining，EPOS）抗体于切片上，20一60min。
7.TBS或PBS缓冲液洗涤。
8.0.04%一0.05%DAB（二氨基联苯胺四盐酸）H2O2液显色5一10min，镜下观察控制显色时间。
底物配法:
DAB40-50mg，0.05MTBS（pH7.6）l00ml，3%H2O2100一200ml。
9.缓冲液洗，流水洗涤。
10.苏木精淡染细胞核。
11.脱水，透明，封片。
（二）间接法
l一5步同“直接法”。
6.滴加第一抗体于切片上，湿盒内温育30一60min。
7.TBS或PBS缓冲液洗涤。
8.HRP标记抗体或用增强的酶标记多聚物（EnhancedLabeled一PolymerSys-tem，ELPS）抗体滴加切片上，湿盒内温育30min。
9一14步同“直接法”的7一11步。
（三）过氧化物酶一抗过氧化物酶（PAP）法
1一5步同直接法。
6.适当稀释的第一抗体，湿盒内温育30~60min。
7.缓冲液洗涤。
8.第二抗体，湿盒内温育30min。
9.缓冲液洗涤。
10.滴加PAP，湿盒内温育30rnin。
11~15步同“直接法”的7~11步。
双PAP法:
上述操作进行到第10步后，再重复7~10步1次，然后继续11~15步。
（四）葡萄球菌A蛋白（SPA）免疫酶法
1一5步同“直接法”。
6.第一抗体，湿盒温育30~60min。
7.缓冲液洗涤。
8.酶联SPA，湿盒温育30min。
9.缓冲液洗涤。
10~13步同“直接法”的8一11步。
（五）ABC法和SABC法
ABC法是卵白素一生物素一酶复合物（Avidin--Biotin--PeroxidaseComplex）法的简称。
SABC法是链霉卵白素一生物素一酶复合物（Streptavidin一Biotin一peroxidaseComplex）法的简称。
l一5步同“直接法”。
6.第一抗体，湿盒温育30~60min.
7.缓冲液洗涤。
8.生物素化的第二抗体，30min。
9.缓冲液洗涤。
10.ABC复合物或SABC复合物（皆于使用前新鲜配制），30~60min。
11~15步同“直接法”7~11步。
（六）LSAB（SP）法
LSAB（SP）法，是标记的链酶卵白素一生物素（LabeledStreptavidin--Biotin）法的简称，操作步骤同“ABC法”，只是以LSAB复合物替代ABC复合物。
（七）CSA法
CSA法是催化信号放大（CatalyzedSignalAmplifieation）法的简称。
1~5步同“直接法”。
6.第一抗体，15~30min。
7.缓冲液洗涤。
8.生物素标记的第二抗体，15一30min。
9.缓冲液洗涤。
10.链霉卵白素一生物素一HRP复合物（用前新鲜配制），15min。
11.缓冲液洗涤。
12.放大液，15min。
13.缓冲液洗涤。
14.HRP一StrePtavidin，15min。
15~19步同“直接法”的7一11步。
（八）二步法EnvisionSystem
Envision是通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体。
1一5步同“直接法”。
6.第一抗体，30~60min。
7.缓冲液洗涤。
8.En
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