技术室操作规范.docx

1、技术室操作规范4.17.5.1 常规病理制片应按照相应的规范，有质量控制措施和记录。【C】1. 有对蜡块、切片、取材工作记录单三相核对的规定与程度。（1） 针对不同组织（如小活检、骨组织、淋巴结等），优化制片、染色流程、保证切片质量。（2） 制片过程中如出现异常，应立即与有关的病理医师联系，并报告科主任，查清事实，采取相应的补救措施。常规制片应在取材后1-2个工作日内完成。2. 内镜小的活检、穿刺等需连续切片不少于6片。常规切片的优良率应90%。【A】 符合“C”，并1. 有完整资料证实上述规定和程序得到有效执行。2. 常规切片的优良率95%。【A】 符合“B”，并常规切片的优良率应98%。苏

2、木精-伊红（HE）染色程序 常规石蜡切片HE染色（1）二甲苯：10min；（2）二甲苯：10min；（3）无水乙醇:1-3min；（4）无水乙醇:1-3min；（5）95%乙醇：1-3min；（6）95%乙醇：1-3min；（7）80%乙醇：1min；（8）蒸馏水：1min；（9）苏木精液染色：10min;（10）流水冲洗去苏木精液：1min；（11）1%盐酸-乙醇：1-3s（显微镜下观察效果）；（12）稍水洗：1-2s；（13）返蓝（用温水或1%氨水等）：5-10s；（14）流水冲洗：1-2min；（15）蒸馏水洗：1-2min；（16）0.5%伊红液染色：1-3min；（17）蒸馏水稍洗：

3、1-2s；（18）80%乙醇：1-2s；（19）95%乙醇：2-3min；（20）95%乙醇：2-3min；（21）无水乙醇：3-5min；（22）无水乙醇：3-5min；（23）二甲苯：3-5min；（24）二甲苯：3-5min；（25）中性树胶封固。 常规组织石蜡切片制备的基本要求及质量的基本标准1.组织制片过程中,应确保切片号与蜡块号一致。2.制片工作一般应在取材后2个工作日内完成（不含需要脱钙、脱脂等特殊处理的标本）。3.制片完成后，技术人员应检查制片质量，并加贴标有本病理科病理号的标签。常规石蜡包埋-HE染色片的优良率（甲、乙级切片所占的比例）90%，优级率（甲级切片所占的比例）35

4、%。不合格切片应立即重做。切片质量的基本标准如下： 优质标准满分（分） 质量缺陷减分组织切片完整，内镜咬检、穿刺标本切面数不少于6块10组织稍不完整：减1-3；不完整：减4-10分；未达到到规定面数：减5分切片薄（3-5m），厚薄均匀10 切片厚（细胞重叠），影响诊断：减6-10分；厚薄不 均匀：减3-5分切片无刀痕、裂隙、颤痕10 有刀痕、裂隙、颤痕，尚不影响诊断：减2分；有刀 痕 、裂隙、颤痕，影响诊断：减5分切片平坦，无皱褶、折叠 10有皱褶或折叠，尚不影响诊断：各减2分；有皱褶或折叠，影响诊断：各减5分切片无污染10 有污染物：减10分无气泡（切片与载玻片间/盖玻片与切片、载玻片间），

5、盖玻片周围无胶液外溢10 有气泡：减3分；胶液外溢：减3分透明度好10 透明度差：减1-3；组织结构模糊：减5-7分细胞核与细胞质染色对比清晰10细胞核着色灰蓝或过蓝;减5分；红（细胞质）与蓝（ 细胞核）对比不清晰：减5分切片无松散，裱贴位置适当 10 切片松散：减5分；切片裱贴位置不当：减5分切片整洁，标签端正粘牢，编号清晰10 切片不整洁：减3分；标签粘贴不牢：减3分；编号不 清晰 ;减4分合计100 注：切片质量分级标准：甲级片：90分（优）；乙级片：75-89（良）；丙级片：60-74分（基本合格）；丁级片：59分（不合格）4.制片过程发生意外情况时，有关技术人员和技术室负责人应及时向

6、病理科主任报告，并积极设法予以补救。5.制片完成后，技术人员应将所制切片与其相应的活检申请单/活检记录单、取材工作单等进行认真核对，确认无误后，将切片连同相关的活检申请单/活检记录单、取材工作单等一并移交给病理医师。双方经核对无误后，办理移交签字手续。 4.17.5.2 有制度保证术中快速病 理(含快速石蜡)诊断的 规范、准确。【C】 1. 有保证术中决速病理诊断合理使用指征的规定与程序.2. 有单件标本的冰冻切片制片应在15分钟内完成的规定与程序. 3. 有病理诊断报告在30分钟内完成的规定与程序. 4. 术中快速病理诊断准确率应90%。 5. 有术中快速病理诊断的操作规定与程序.（1） 在

7、术前向患者或近亲属告知术中快速病理诊断的局限性，签署术中快速病理诊断知情同意书。（2） 对于难以明确诊断、交界性病变、送检组织不适宜等状况，病理医师可以不作出明确诊断、等待石蜡切片报告。（3） 术中快速病理诊断报告必须采用书面形式（可传真或网络传输），为防止误听和误传，严禁采用口头或电话报告的形式。（4） 从标本接收到发出报告的时间，应在病理申请单上注明，术中快速病理诊断报告书应由病理医师签署全名。【B】 符合“C”，并1. 有完整资料证实上述制度得到有效执行。2. 术中快速病理诊断准确率95%。3. 抽查相关人员能按规定流程操作。【A】 符合“B”，并有临床科室和病理科的沟通协调机制，保证冰

8、冻切片诊断的及时性和准确性。 冰冻切片的制备1.完成冰冻HE染色切片制备的时间通常为15-20min；2.恒冷箱切片机制片：至少应于切片前1小时开机预冷，冷室温度一般为零下15-20，常规开展冷冻切片快速病理学诊断的病理科，恒冷箱切片机宜处于24小时恒温待机状态。3.需经行冰冻切片的组织不能做任何固定，应尽快送至病理科，认真核对交接后，由负责当天病理诊断的医生进行取材，切取适宜大小（厚度2mm）的可疑病变组织，并尽快置于冰冻组织切片机上制备切片。4.调节冷冻程度，试切合适时便迅速切片。冷冻不足时无法切片，冷冻过度时切片易碎。5.切取好的冰冻切片应立即投入专用固定液中经行固定。6.冰冻切片HE染

9、色（1）冰冻切片固定：1-2min；（2）稍水洗：1-2s；（3）苏木精液染色（60）30-60s；其余同石蜡切片。7.制片完成后，技术人员应将所制该例病人的所有冰冻切片与其相应的冰冻申请单/活检记录单、取材工作单等进行认真核对，确认无误后，将切片连同相关的冰冻申请单/活检记录单、取材工作单等一并移交给病理医师。双方经核对无误后，办理移交签字手续。4.17.6.7 有制度保证特殊染色操作规范【C】1. 有特殊染色技术员经过专门培训与授权的规定与程序。（1） 每一批次的特殊染色必须设阳性对照及阴性对照，可利用组织中的内对照。（2） 每种特殊染色，必须有本实验室的操作规范和技术规范。（3） 染色液

10、必须充分掩盖组织。（4） 使用过程中瓶盖及滴管不能混淆。（5） 一般的特染试剂做避光及4冰箱保存。（6） 更换新的染色试剂后，必须使用染色阳性和阴性组织进行验证，并有相应的文字记录和染色切片档案，相关档案保留2年。（7） 特殊染色时所产生的有毒的污染性液体应专门回收，严禁随处倾倒。（8） 特殊染色结果不能作为最终诊断，必须有病理医师结合形态学综合诊断。（9） 特殊染色质量达到室间质评的合格标准，有相关操作规定与流程。【B】 符合“C”，并1. 有完整资料证实上述制度得到有效执行。2. 通过实验室室内质控与室间质控，提高特殊染色的质量【A】 符合“B”，并根据医学新进展，及时改进特殊染色技术，提

11、高特殊染色质量。Masson三色染色规范1、染色步骤1）切片脱蜡至水；2）苏木素精染色液染色3-5min，水洗返蓝；3）滴入masson改良三色染料（丽春红、酸性品红、桔黄G液）染色5-10min，水洗至无染料脱落；4）0.2%醋酸溶液洗30-60s；5）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。2、染色结果胶原纤维、粘液、软骨呈绿色或蓝色，胞浆、肌肉、纤维素、神经胶质纤维呈红色，胞核呈蓝黑色。 糖原染色操作规范1染色步骤1）切片脱蜡至水；2）滴入高碘酸染色5min，蒸馏水洗；3）滴入schiff氏试剂染色5-10min（背景过深时，可用亚硫酸氢钠液分化或缩短染色时间）；4）流水冲洗10min；

12、5）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。2染色结果糖原、中性粘液物质呈红色。网状纤维染色操作规范1操作步骤1）切片脱蜡至水，蒸馏水洗；2）滴入0.5%高锰酸钾氧化1min，流水洗涤1-2min；3）滴入2%草酸漂白至切片无色，流水洗涤1-2min；4）滴入2%硫酸铁铵媒染2min，流水洗涤再蒸馏水洗，组织边缘用滤纸吸干；5）将促染液注入等量银氨液中混合均匀后，滴入切片，在湿盒中，温度25-37，反应8min；6）不能直接倾去反应液，应用蒸馏水从边缘注入速洗一次，冲去银膜即可；7）滴入10%甲醛还原1min至组织变成棕黑色，流水冲洗数分钟；8）用氯化金调色液调色20-30s，充分水洗；9）过

13、梯度酒精，二甲苯透明，中性树胶封固。2染色结果网状纤维呈黑色，胶原纤维呈深黄色-浅褐色，胞核呈灰黑色粘液染色操作规范1、染色步骤1）切片脱蜡至水；2）滴入爱先蓝染液（PH2.5）染色5-10min，流水冲洗至无染料脱落；3）滴入0.5%高碘酸氧化5min，蒸馏水洗；4）于暗处，滴加schiff氏试剂加盖染色5-10min，流水冲洗10min，（背景过深时，可用硫酸氢钠液分化或缩短染色时间）；5）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。2、染色结果酸性粘液呈蓝色，中性粘液呈红色，混合粘液呈紫红色。淀粉样物质染色操作规范1、染色步骤1）切片脱蜡至水；2）甲醇刚果红液染10min，倾去余液；3）用碱

14、性乙醇急速分化数秒，镜下控制；4）流水冲洗5min；5）苏木素液浅染细胞核，必要时用盐酸酒精分化数秒；6）流水冲洗10min；7）梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。2、染色结果淀粉样物质、红细胞呈粉红色或红色，细胞核呈蓝色，基底无色。抗酸杆菌染色操作规范1、染色步骤1）切片脱蜡至水；2）将石碳酸品红液滴入切片上（切片上覆盖吸水纸）后加热，使之冒蒸气（不能沸腾）约5min，使之冷却；3）入1%盐酸酒精20s至1min，脱色至无红色出现为止；4）入甲烯蓝进行对比染色数秒；5）水洗后矣干，然后进行透明和封固。2、染色结果抗酸杆菌为红色，其他细菌为蓝色。六胺银染色操作规范1、染色步骤1）切片脱蜡

15、至水；2）1%过碘酸水溶液染10min；3）自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗；4）浸入加热至55-60的六胺银溶液于温箱水孵育30min-2h，至切片呈棕黑色，用滤纸擦去组织周围银液，用蒸馏水洗；5）0.2%氯化金水溶液调色；6）蒸馏水洗；7）HE复染；8）梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。2、染色结果基底膜、网状纤维和型胶原呈黑色，细胞核蓝黑色，背景粉红色。4.17.5.3 有制度保证免疫组织化学染色操作的规范和准确【C】1. 免疫组化技术员经过专门培训与考核授权的相关规定和程序。2. 有相关操作规定与程序文件。（1） 每一批次的免疫组化染色必须设阳性对照及阴性对照，可利用组织中的内对照。（

16、2） 必须建立本实验室每种免疫组化染色的操作规程，并及时更新。（3） 更换抗体后，需要有用阳性和阴性组织进行有效性验证，并有相应的文字记录和染色切片档案，相关档案保留2年。（4） 免疫组化染色过程中产生的有毒液体（如DAB）应专门回收，严禁随处倾倒。（5） 病理医师必须熟悉各种抗体染色结果，阳性信号表达部位，其诊断应用范围，以期做到正确的结果判读。（6） 单纯的免疫组化染色结果不能作为最终诊断，必须由病理医师结合形态学综合判断。3. 免疫组化染色的质量要达到室间质评的合格标准。【B】 符合“C”，并1. 有完整资料证实上述制度得到有效执行。2. 通过实验室室内质控与室间质控，提高免疫组化染色的

17、质量。【A】 符合“B”，并【B】 根据医学新进展，及时改进特殊染色技术，提高免疫组化染色质量。 免疫组织化学技术 一、免疫组织化学染色前的准备事项(一)组织切片的制备常规切片脱蜡至水（组织固定需用10%中性甲醛） (二)抗体的选择、稀释和保存 1.选择抗体应先了解其反应谱和适用条件包括适用切片(石蜡切片抑或冷冻切片)、稀释度和温育时间等。 2.对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预试验;根据染色阳性表达的程度和检材 背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度。 3.抗体的原液应于分装后置于一20冷室中保存，切勿反复冻存(以免效价

18、降低)。 4.抗体的工作液可置于4冰箱中保存。 5.抗体的稀释。 (1)一般用0.01M PBS(生理盐水磷酸盐缓冲液)，pH值7.2。 (2)或用0.05M TBS(生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液)，pH值7.6。 (3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。 (三)被检测组织内抗原的修复 1.经4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，其切片中的抗原决定簇因 醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前，对 于组织切片进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了 大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体 试剂说明书的提示决定

19、是否进行被检测组织内的抗原修复。 2.抗原修复缓冲液。 (l)一般为0.01M柠檬酸缓冲液(2.1g柠檬酸溶于100ml蒸馏水中，用2M NaOH调节pH值至6.0)。 (2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，如高PH值的EDTA(50mM Tris.，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该高pH修复液等。 3.抗原修复的常用方法。 (l)胰蛋白酶消化法: 组织切片脱蜡、水化。 滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。 37下温育2040min(温育时间取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长 短和被检测抗原)。 蒸馏水冲洗，终止反应。 阻断内源性过氧化物酶。 进行免疫组织化学染色。配制0.1%

20、胰蛋白酶液时，应将0.1g胰蛋白酶 溶于0.1%无水氯化钙水溶液(pH值7.8)中。 （2)胃蛋白酶消化法: 组织切片脱蜡、水化. 滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。 37下温育10一30min(一般为10min，可延至30min，取决于组织经4%中 性甲醛固定时间的长短). 浸人蒸馏水，终止反应。 进行免疫组织化学染色。用1%胰蛋白酶液37下处理20min。(应以 0.IM HCI配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片 脱落。) （3)微波修复抗原法: 组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。 将组织切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修复液

21、200ml，盖上具有小孔的盖子。 将该容器置于微波炉(705一800W)中央加热(95)5min，2次(于两次之 间，应向容器中添加蒸馏水50ml，严防组织切片干燥)。将该容器移出微波炉，置于室温下冷却15一20min。 蒸馏水冲洗。 阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。 用TBS或 PBS液冲洗。 进行免疫组织化学染色。 (4)热水浴法: 组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。 向装组织切片的容器加人足量(例如200ml)抗原缓冲液，置于水浴锅中，加 热至95 一99(不沸腾)预热。 将组织切片插人已预热的容器内，温育2040min。 将该容器由微波炉移出，置于室温

22、下冷却20min。 室温下，用TBS、PBS或水洗。 蒸馏水冲洗。 阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。 用TBS或PBS液冲洗。 进行免疫组织化学染色。 （5)压力锅法: 组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。 向45.5L的不锈钢压力锅中加人抗原修复缓冲液(约为锅容积的2/3)， 不加阀情况 下加热至沸腾。 将组织切片插放于金属切片架上，并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。 加阀情况下，将组织切片加压2min。 压力锅自行冷却或以流水冷却减压后，持续20min。 将冷却后的切片取出，蒸馏水冲洗后，置于TBS或PBS液中(以免组织切 片干燥)。 蒸馏水冲洗。 阻断内源性过

23、氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。 用TBs或PBS液冲洗。 进行免疫组织化学染色。 (四)组织切片中内源性酶的阻断 1.内源性过氧化物酶 主要存在于红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞了嗜酸性 粒细胞和组织内。阻断方法:最常用0.3%0.5%H2O2-甲醇液，作用1530min， 阻断液必须使用时新鲜配制。由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变 性(使特异性着色减弱)，而大部分组织不含有内源性过氧化物酶，所以阻断内源性 过氧化物酶一般不必作为常规步骤。必须阻断内源性过氧化物酶时，可安排在第 一抗体反应后进行，以减少抗原的破坏。 2.内源性碱性磷酸酶 主要存在于嗜中性粒细胞和内皮细胞。阻断方法

24、:应 用1M左旋咪唑，作用1530min。 3.内源性生物素 肝、胰、肾等的细胞内含有多量生物素或类生物素物质。 阻断方法:先将切片浸于卵白素(0.5g/ml)中15min，以缓冲液洗净后，移浸于生 物素饱和溶液中15min，再用缓冲液洗去多余的生物素饱和液;也可应用商供的阻 断试剂盒(按说明书操作)。 (五)正常血清保护 作为检测试剂的抗体蛋白带有一定的负电荷，免疫组织化学染色时，易与带有 正电荷的组织特别是纤维组织、变性和(或)坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等发生静电吸引而导致非特异性染色。去除这种非特异性染色最有效的方法是，在滴加第 一抗体前，先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或是滴加除制

25、备第一抗体 动物以外的其他动物非免疫血清，浓度为1：51：20;必要时可滴加2%5%牛 血清清蛋白。正常血清保护作用时间10一20min。用于阻断非特异性结合的血清 不能有明显的溶血。 (六)缓冲液 用于稀释抗体，洗涤切片的缓冲液主要有两种。 1 .TBS(0.05M，pH7.6)， Tris一HCl缓冲液(0 .SM，pH 7.6)100ml 8 .5%NaCl I00ml 蒸馏水加至 1 000ml Tris一HCI缓冲液(0 .5M，pH7.6) 三经甲基氨基甲烷(Tris) 61g HCl 37ml_ 蒸馏水加至 1 000ml 2 .PBS(0 .IM，pH 7.6) Na2 HPO

26、4 12H2O2 29g NaH2PO4 2H2O 3g NaCl 85g 蒸馏水加至 1 000ml 使用时用蒸馏水稀释10倍即成00lM。 二、免疫组织化学染色常用方法 (一)直接法 1.脱蜡和水化。 2.3%过氧化氢或0.5%过氧化氢甲醇液，5min。 3.TBS或PBS缓冲液洗涤。 4.抗原修复。 5.无关动物正常血清(适当稀释)2030min。 6.甩去正常动物血清，滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记抗体，或增强的 酶标多聚物一步法(Enhanced Polymer One-step Staining，EPOS)抗体于切片上， 20一60min。 7.TBS或PBS缓冲液洗涤。 8.0

27、.04%一0.05%DAB(二氨基联苯胺四盐酸)H2O2液显色5一10min，镜下观察控制显色时间。底物配法:DAB 40-50mg，0.05M TBS(pH 7.6)l00ml，3% H2 O2 100一200ml。 9.缓冲液洗，流水洗涤。 10.苏木精淡染细胞核。 11.脱水，透明，封片。 (二)间接法 l一5步同“直接法”。 6.滴加第一抗体于切片上，湿盒内温育30一60min。 7.TBS或PBS缓冲液洗涤。 8.HRP标记抗体或用增强的酶标记多聚物(Enhanced Labeled一 Polymer Sys- tem，ELPS)抗体滴加切片上，湿盒内温育30min。 9一14步同“

28、直接法”的7一11步。 (三)过氧化物酶一抗过氧化物酶(PAP)法 1一5步同直接法。 6.适当稀释的第一抗体，湿盒内温育3060min。 7.缓冲液洗涤。 8.第二抗体，湿盒内温育30min。 9.缓冲液洗涤。 10.滴加PAP，湿盒内温育30rnin。 1115步同“直接法”的711步。 双PAP法:上述操作进行到第10步后，再重复710步1次，然后继续1115步。 (四)葡萄球菌A蛋白(SPA)免疫酶法 1一5步同“直接法”。 6.第一抗体，湿盒温育3060min。 7.缓冲液洗涤。 8.酶联SPA，湿盒温育30min。 9.缓冲液洗涤。 1013步同“直接法”的8一11步。 (五)AB

29、C法和SABC法 ABC法是卵白素一生物素一酶复合物(Avidin-Biotin-Peroxidase Complex)法的简称。SABC法是链霉卵白素一生物素一酶复合物(Streptavidin一Biotin一peroxidase Complex)法的简称。 l一5步同“直接法”。6.第一抗体，湿盒温育3060min. 7.缓冲液洗涤。 8.生物素化的第二抗体，30min。 9.缓冲液洗涤。 10.ABC复合物或SABC复合物(皆于使用前新鲜配制)，3060min。 1115步同“直接法”711步。 (六)LSAB(SP)法 LSAB(SP)法，是标记的链酶卵白素一生物素(Labeled S

30、treptavidin-Biotin)法 的简称，操作步骤同“ABC法”，只是以LSAB复合物替代ABC复合物。 (七)CSA法 CSA法是催化信号放大(Catalyzed Signal Amplifieation)法的简称。 15步同“直接法”。 6.第一抗体，1530min。 7.缓冲液洗涤。 8.生物素标记的第二抗体，15一30min。 9.缓冲液洗涤。 10.链霉卵白素一生物素一HRP复合物(用前新鲜配制)，15min。 11.缓冲液洗涤。 12.放大液，15min。 13.缓冲液洗涤。 14.HRP一StrePtavidin， 15min。 1519步同“直接法”的7一11步。 (八)二步法Envision System Envision是通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体。 1一5步同“直接法”。 6.第一抗体，3060min。 7.缓冲液洗涤。 8 .En