引物设计常见问题与解答.docx
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引物设计常见问题与解答
引物设计常见问题与解答
先看一下Tm的定义：
Tm=Temperatureatwhich50%ofagivenoligonucleotideishybridizedtoitscomplementarystrand.Intheabsenceofdestabilizingagents,likeformamideorurea,Tmwilldependon3majorparameters:
Thesequence:
aGC-richsequencehasahighermeltingtemperature.Thestrandconcentration:
higholigonucleotideconcentrationsfavorhybridformation,whichresultsinahighermeltingtemperature. Thesaltconcentration:
highionicstrengthresultsinahigherTmascationsstabilizetheDNAduplexes.
引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：
Tm=4℃（G+C）+2℃（A+T）
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm=81.5+16.6xLog10[Na+]+0.41（%GC）–600/size
公式中，Size=引物长度。
Tm叫溶解温度（meltingtemperature,Tm），即是DNA双链溶解所需的温度。
大家可以理解，这个温度是由互补的DNA区域决定的，而不互补的区域对DNA的溶解是没有作用的。
因此，对于引物的Tm，只有和模板互补的区域对Tm才有贡献。
计算Tm时，只计算互补的区域（除非你的酶切位点也与模板互补）。
不少战友设计的引物都Tm过低，是因为他们误把保护碱基和酶切位点都计算到Tm里了，最后的结果是导致了PCR反应的诸多困难。
所以，设计引物的时候，先不管5'端的修饰序列，把互补区的Tm控制在55度以上（我喜欢控制在58以上，具体根据PCR的具体情况，对于困难的PCR，需要适当提高Tm），再加上酶切位点和保护碱基，这样的引物通常都是可用的，即使有小的问题，也可以挽回。
Tm温度高的引物就比较容易克服3‘发卡、二聚体及3'非特异结合等问题。
简单的计算公式可以用2+4的公式。
若你计算的Tm值达到了快90，不包括酶切位点。
引物公司给你发的单子是包括酶切位点的。
自己可以再估计一下。
如你设计了带酶切位点的引物，总长分别为29、33个碱基，去掉酶切位点和保护碱基，分别为17、21个碱基。
引物公司给的单子是70多度，实际用的只有50度，用55度扩的结果也差不多。
其它关于Tm值的计算，有用PP5.0进行评价的，需要考虑的参数包括：
basenumber、GC%、Tm、hairpin、dimer、falsepriming、crossdimer。
一般退火温度为Tm-5度，退火温度的计算可以不把加入的酶切位点及保护碱基考虑进去，如上所言，PCR几个循环后，引物外侧的序列已经参入了扩增片断中，所以你可以在预变性后多加几步，温度比你Tm值低些（这样可能会增加非特异性），Tm值是你包括酶切位点及保护碱基的Primer计算出来的。
1.一般在5'端加保护碱基,如果你扩增后把目的条带做胶回收转入T-ECTOR或者其它的载体的话,酶切时可以不需加保护碱基2.有人的经验加入酶切位点的引物可以和未加入时使用相同的退火温度,结果也还是令人满意
上面是我以前在园子里看到的精彩的帖子，所以收藏了一下.上面说的比较明白.如果加上酶切位点和保护碱基,计算出来的Tm一般教高,而我们设的退火温度原则是Tm-5,一般都是用55度左右，所以我坚持我的观点.不要算进去。
1.引物是如何合成的？
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种,主要都是由ABI/PE公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman1000M和PE8909DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。
亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。
亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的，相邻的核苷酸通过3'→5'磷酸二酯键连接。
第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT，获得游离的5'-羟基；
第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3'端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。
第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应（少于2%），用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。
第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。
经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。
再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT，重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。
合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。
通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC,PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩,脱盐，沉淀。
沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。
2.引物纯化方式有哪些，如何选择？
◆ C18柱脱盐：
有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。
它不能有效去除比目的片段短的小片段。
实际上，它是一种脱盐的作用。
这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。
对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。
◆ OPC纯化：
OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。
OPC法纯化的DNA纯度大于95%。
适用于40mer以下引物的纯化。
◆ PAGE纯：
PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。
PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%，对长链OligoDNA（大于50mer）的纯化特别有效。
◆ HPLC纯化：
HPLC纯化是使用高效液相色谱的原理，对DNA片段进行纯化。
纯度可以大于99%。
主要用于短链和修饰引物的纯化。
该法的弱点是成本较高，批量生产效率不高。
3.引物的OD数如何定量？
答：
引物合成引物OD数是这样测定的：
用紫外分光光度计，波长260nm，石英比色杯，光程为1厘米，测定溶液的光密度。
测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-1.0之间。
DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，用1ml水稀释测OD值。
需要根据稀释倍数换算出母液的OD值。
4.投诉定量不准是怎么回事儿？
答：
我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有
（1）生产人员定量错误。
这种可能性有，但是不大，因为我们的生产人员都是经过严格的培训，程序化规范操作和换算。
公司内部的考核机制也使得分装人员没有必要故意少给用户OD数，因为无论OD数是否达到定单要求，我们都统计为工作量，没有达到OD数的，分装人员将清单及时报到序列录入部门安排重合就可以了。
合成产量的高低是序列录入部门人员的考核指标之一。
一般情况下，引物都有留样。
接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题。
（2）分装没有问题，但引物抽干或收样过程中，引物干粉可能意外丢失。
这种情况很少见。
（3）系统误差，我们认为10%左右为允许误差。
使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差不影响实验。
（4）用户没有能够正确理解引物OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用户没有将OD读数，正确地转换成母液中OD数。
这种情况比较常见。
（5）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。
例如，验证标2OD引物量是否准确，简单的做法是：
加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul,加入900ul水，用光径为1cm的石英比色杯，波长260nm,此时光吸收的读数为0.2。
5.需要什么级别的引物？
答：
引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。
根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用
引物长度要求
纯度级别要求
一般PCR扩增
<45base
OPC
>45base
PAGE
诊断PCR扩增
<40base
OPC,PAGE
DNA测序
20base左右
OPC
亚克隆，点突变等
根据实验要求定
OPC,PAGE，HPLC
基因构建（全基因合成）
根据实验要求定
PAGE
反义核酸
根据实验要求定
PAGE
修饰引物
根据实验要求定
PAGE,HPLC
6.最长可以合成多长的引物？
答：
引物越长，出现问题的概率就越大。
我们合成过120base的引物，但是产率很低。
除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
7.需要合成多少OD数？
答：
根据实验目的确定。
一般PCR扩增，2OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。
如果是做基因拼接或退火后做连接，1OD就足够了。
但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10OD。
做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。
片段越长,最后全长得率就越低，出错的几率就越大。
超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
8.如何检测引物的纯度？
答：
实验室方便的作法是用PAGE方法。
使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。
取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性（95℃,2mins）。
加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。
600V电压进行电泳，一定时间后（约2-3小时），剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。
如果条件许可，也可以用EB染色或银染方式染色。
9.如何计算引物的浓度？
答：
引物保存在高浓度的状况下比较稳定。
引物一般配制成10-50pmol/ul。
溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。
如果不一致，请和我们联系。
我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：
V（微升）=OD数*（乘）33*（乘）*（乘）20000/（除） 引物的分子量。
引物的分子量可以从合成报告单上获得。
如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：
1OD260=33ug/ml.
10.如何计算引物的Tm值？
答：
引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：
Tm =4℃（G+C）+2℃（A+T）
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm=81.5+16.6xLog10[Na+]+0.41（%GC）–600/size
公式中，Size=引物长度。
Tm的定义：
Tm=Temperatureatwhich50%ofagivenoligonucleotideishybridizedtoitscomplementarystrand.Intheabsenceofdestabilizingagents,likeformamideorurea,Tmwilldependon3majorparameters:
Thesequence:
aGC-richsequencehasahighermeltingtemperature.Thestrandconcentration:
higholigonucleotideconcentrationsfavorhybridformation,whichresultsinahighermeltingtemperature. Thesaltconcentration:
highionicstrengthresultsinahigherTmascationsstabilizetheDNAduplexes.
11.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？
答：
非修饰的引物的MolecularWeight在随引物提供的报告单上都有明确的标示。
如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数x碱基的平均分子量。
或按下列公式计算MW=（NA*WA）+（NC*WC）+（NG*WG）+（NT*WT）+（Nmod*Wmod）＋（Nx*Wx）+（Ni*Wi）+16*Ns–62.
NA,NG,NC,NT,Ni分别为引物中碱基A或G或C或T或I的数量，WA,WC,WG,W,Wi分别为引物中碱基A或G或C或T或I的分子量，Nmod，Wmod分别为修饰基团的数目和分子量。
对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如G+A混合的分子量为（313.21+329.21）/2=321.21。
Ns为硫代数目，硫代每个位置增加分子量16。
常规碱基分子量
Base
MolecularWeight
A
313.21
C
289.18
G
329.21
T
304.19
I
314.2
U
290.17
常规修饰基团分子量
5’-Biotin
405.45
3’-TAMARA
623.60
5’-（6FAM）
537.46
3’-Dabsyl
498.49
5’-HEX
744.13
3’-（6FAM）
569.46
5’-TET
675.24
3’-AminoModifierC3
153.07
5’-Cy5
533.63
3’-AminoModifierC7
209.18
5’-Cy3
507.59
3’-ThiolModifierC3
154.12
12.如何溶解引物？
答：
干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。
根据计算出的体积加入去离子无菌水或10mMTrispH7.5缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。
溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的pH值比较低（pH4-5）,引物在这种条件下不稳定。
13.如何保存引物？
答：
引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。
引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。
溶解后的引物-20度可以长期保存。
如果对实验的重复性要求较高，合成的OD数较大，建议分装，避免反复冻融。
修饰荧光引物需要避光保存。
14.合成的引物5’端是否有磷酸化
答：
合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。
如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5'端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5'或3'端进行磷酸化，需要另外收费。
15.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。
如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。
磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。
SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
16.测序发现引物有突变是怎么回事？
答：
测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物,发生的概率不大，但是肯定也会发生。
用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多。
我们有一套控制办法，预防碱基输入错误。
发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。
引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。
引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是99%，副产品不可以避免。
引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。
至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽（capping）反应不彻底造成的，Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。
被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。
对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。
置换突变通常发生在G转换成其它碱基。
碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体（脱嘌呤），2,6diaminopurine,DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6diaminopurine看作碱基A，测序就会发现碱基G-A置换。
脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。
脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基G或A的缺失。
引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。
17.长链引物为什么出错的几率非常高？
答：
引物合成时，每一步反应效率都不能达到100%，产生碱基插入，缺失，置换突变的因素客观条件都有一直存在。
引物链越长，突变的频率累加起来就越高。
研究人员总希望合成的引物万无一失，这种心情可以理解。
但是犹如PCR扩增，不可能绝对保证扩增产物中没有突变，引物合成也不可能保证100%正确。
要知道，引物合成中发生错误（非人为因素）的频率，比任何高保真高温聚合酶PCR扩增过程所产生的频率都要高。
做引物合成，长链引物合成，您要有引物中部分引物可能有突变的思想准备。
18.如果测序发现突变，该如何处理？
答：
对您遇到的困惑，我们表示同情。
遇到这种情况，首先和我们取得联系，我们的生产人员会检查生产的原始记录，主要是核对合成序列是否和定单一致，我们在电脑中保留所有原始数据。
如果确认引物合成序列没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。
根据我们经验，40个碱基以下的引物，测1-2个克隆就可以了；40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。
一般情况下，每个克隆突变的位点都不一样，提示正确的总是有的，就是如何找到它。
您也可以要求我们将引物免费重合一次，不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。
基因拼接过程中，如果发现一段区域突变点不多，就多测几个，否则就重合一下引物。
19.如果测序发现引物突变，是否有补偿？
答：
没有。
我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担其他连带责任。
原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到100%。
您选择了化学合成引物，合成过程中一些副产品所带来的后果就可能不可避免的遇到。
20.引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？
答：
理论上分析型PAGE变性电泳，可以区分引物之间一个碱基的差别。
但是制备PAGE电泳，上样量都是非常大，电泳时的条带非常宽，带与带之间有重叠，分辨率已下降，电泳后割带回收目的引物时，很难说不割到差别仅几个碱基的引物。
国内有一个不好的现象，PAGE纯化的引物，特别是长引物要的量都比较高，导致割的条带有时可能比较宽。
建议：
您如果减少OD数，引物遇到的问题可能就会少一些。
21.为什么OPC或PAGE纯化的引物，再用HPLC鉴定纯度不高？
答：
有些用户引物需要纯度特别高的引物，在使用前会将HPLC鉴定引物的纯度，常常发现引物的纯度一般在70%左右。
问题来了，还有那30%是什么？
引物纯化PAGE,需要电泳，用缓冲液将引物浸泡出来，然后用C18浓缩，乙醇沉淀。
沉淀得到的核酸物质基本引物了，除此以外，还有其他一些非核酸类物质，他们一般不会干扰引物的使用。
OPC纯化也类似的情况。
即使是HPLC纯化的引物，如果对成品进行分析，一般也难达到很高的纯度，引物您得到的纯品都是由制备柱过来，洗脱峰经过浓缩抽干，部分非核酸物质被富集。
22.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高?
答：
主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。
修饰引物通常需要PAGE或HPLC纯化，纯化过程损失大。
修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品的价格自然高。
23. TaqMan 探针设计的基本原则是什么？
答：
下列原则供您参考。
◆TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。
◆长度一般为18-40mer。
◆G-C含量控制在40-80%左右。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆在引物的5’端避免使用G。
◆选用比较多的碱基C。
◆退火温度Tm控制在68-70C左右。
有用的荧光染料参数
Name
Name
吸收波长
发射波长
colors
6-FAM
6-carboxy-fluorescein
494nm
518nm
Green
TET
5-tetrachloro-fluorescein
521nm
538nm
Orange
HEX
5-hexachloro-fluorescein
535nm
553nm
Pink
TAMRA
tetramethyl-6-carboxyrhodamine
560nm
582nm
Rose
ROX
6-carboxy-x-rhodamine
587nm
607nm
Red
Cy3
Indodicarbocyanine
552nm
570nm
Red
Cy5
Indodicarbocyanine
643nm
667nm
Violet
24.Primer设计的基本原则是什么？
答：
引物设计的下列原则供您参考。
◆引物长度一般在18-35mer。
◆G-C含量控制在40-60%左右。
◆避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
◆如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。
◆如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
◆退
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