药敏试验.docx

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药敏试验

药敏试验

药敏试验根据美国临床标准委员会（NCCLS）推荐的K-B琼脂法进行，药敏纸片选择中国生物制品鉴定所药敏纸片，试验所选择药物必须包括下列抗生素：

氨苄西林（AMP），阿莫西林/克拉维酸（AMC），头孢噻吩（CFT），头孢噻肟（CTX），庆大霉素（GEN），萘啶酸（NAL），环丙沙星（CIP），四环素（TBT），利福平（RFA），复方新诺明（SMZ）。

药敏结果判定标准按照NCCLs手册2005版。

1.操作方法：

（1）将待检菌接种于普通营养琼脂平板，37℃培养16～18小时，然后挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，悬于3ml生理盐水中，混匀后与菌液比浊管比浊。

以有黑字的白纸为背景，调整浊度与比浊管（0.5麦氏单位）相同。

（2）用无菌棉拭子蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌液。

用棉拭子涂布整个M-H培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60度，最后沿周边绕两圈，保证涂均匀。

（3）待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴纸片。

用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。

每个平板贴5张纸片，每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。

在菌接种后15分钟内贴完纸片。

（4）将平板反转，

孵育18～24小时后取出，用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录（附表6）。

抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。

有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。

结果判断依据鉴定所药敏纸片判定标准。

（5）每次药敏试验必须用ATCC25922大肠杆菌做质控。

只有当质控菌株的抑菌圈直径在允许范围内测试菌株的结果才可以报告。

ATCC25922的结果必须与测试菌株同时记录和报告在附表6中。

0.5麦氏比浊管配制方法：

0.048MBaCL2（1.17%W/VBaCL2.2H2O）0.5ml

0.36NH2SO4（1%,V/V）99.5ml

将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。

用前混匀。

有效期为6个月。

2.注意事项：

（1）制备MH琼脂平板应用直径90mm平皿，在水平的实验台上倾注。

琼脂厚为4±0.5mm（约25-30ml培养基），琼脂凝固后塑料包装放4℃保存，在5日内用完，使用前应在37℃培养箱烤干平皿表面水滴。

倾注平皿前应用pH计测pH值是否正确（pH应为7.3）。

pH过低会导致氨基糖苷类，大环内酯类失效，而青霉素活力增强。

（2）药敏纸片长期储存应于－20℃，日常使用的小量纸片可放在4℃，但应至于含干燥剂的密封容器内。

使用时从低温取出后,放置平衡到室温后才可打开，用完后应立即将纸片放回冰箱内的密封容器内。

 过期纸片不能使用,应弃去。

（3）不稳定药物如亚胺培南,头孢克洛,克拉维酸复合药等,应冷冻保存,最好在-40℃以下。

（4）保证质控菌株不变异的简便方法，将新得到的冻干菌株接种含血的M-H平板复活。

然后每株细菌接种10支高层琼脂管，放置冰箱保存。

每月取出一支，传出细菌供常规用。

待用剩至最后一支，可传种在M-H平板上，再接种一批高层琼脂管备用。

如此可保证原始菌种永不接触抗菌素。

3.质量控制

质量控制方法是用与常规实验相同的操作方法，测定质控菌株的抑菌环。

应使用新鲜传代的菌种。

接种菌液的涂布方法等均同常规操作，测定的抗菌素种类也应与常规测定的种类相同。

兽医临床中的药敏试验

目前由各种细菌所引起的疾病给畜禽养殖业带来严重经济损失，阻碍了养殖业的快速发展，所以使用抗菌药预防和治疗细菌性疾病成了畜禽养殖过程中的一项重要工作。

但由于养殖过程中不科学的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。

由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。

这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且耐药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。

因此，临床上应合理应用抗菌药，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药疗效，并尽可能减少其不良影响。

一、什么是药敏试验？

抗菌药物敏感性试验（antimicrobialsusceptibilitytest，AST），简称药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验性治疗选药。

药敏试验是兽医临床工作中的一项基本技能，也是使用抗菌药物治疗前必不可少的一道环节。

二、药敏试验的意义

1、可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药。

因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。

是一种既经济又有效的方法。

2、可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行。

因为随着新型致病菌的不断出现，各种致病菌对不同的抗菌药的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药的敏感性也有差异。

进行有效的药敏试验可以及时掌握各种新型菌种和菌株的耐药性，对流行病学调查建立监控，同时采取相应的措施也就可以控制和预防耐药菌株的流行。

3、为临床用药提供参考依据。

因为一个正确的药敏试验结果，可作为临床兽医和畜禽养殖者选用有效抗菌药的参考。

长期以来，由于各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药药效下降或消失。

不能很好的掌握药物对细菌的敏感程度，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。

近十几年，在肉鸡生产中，为了控制大肠杆菌及某些细菌感染，一些抗菌药物的盲目使用，导致耐药菌株越来越多。

根据已进行的大量药敏试验结果，大肠杆菌、沙门氏菌对曾经敏感的氨基糖苷类、氟喹诺酮类等，均产生了不同程度的耐药性，经常发现对十几种常用抗菌药都不敏感的菌株。

这是一个非常危险的信号。

所以在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。

三、常用的药敏试验方法

兽医临床常用的药敏试验方法主要有两种，即扩散法和稀释法。

其中扩散法属手工测试方法，通过测试药物纸片或者牛津杯在固体培养基上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。

稀释法包括试管稀释法和微量稀释法，通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断其最低抑菌浓度（MIC）。

由于扩散法操作简单，成本低，已经被大多数实验室和基层单位所采用。

扩散法又包括纸片法、牛津杯法和打孔法，目前牛津杯法和打孔法在兽医临床已较少应用。

以下简单介绍纸片法。

1、药敏纸片的制作

纸片法中使用的药敏纸片目前市场上已有较多厂家的产品销售。

但也可根据需要自制，具体自制的方法如下：

取质量较好的定性滤纸，用普通的打孔器打成直径6mm的圆形小纸片。

取圆纸片50片放入清洁干燥的小瓶或小平皿中，以单层牛皮纸扎口或包扎。

经15磅15-20分钟高压灭菌后，置于37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

按每张纸片饱和吸水量为0.01ml计，在上述含有50片纸片的小瓶内加入药液0.5ml，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡30分钟即可。

同时记录药物名称，于37℃温箱过夜。

在温箱或烘箱中的时间不宜过长，以免某些抗生素失效。

青霉素、金霉素宜在低温下真空干燥。

干燥后即密封。

切勿受潮，置阴暗干燥处或家用冰箱中保存，有效期4-6个月。

2、药液的制备

自制药敏纸片时还需自行配制抗菌药液。

抗菌药的稀释剂通常用蒸馏水。

一般可按商品药使用说明书上的配料或饮水浓度，按1g需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。

如10g药物可配50kg饲料，其换算方法为：

1g本品加5000ml蒸馏水。

此溶液液即为用于做药敏试验的药液。

3、试验操作方法

在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将菌液均匀涂布到平皿中的固体培养基表面。

然后用无菌镊子将纸片放于固体培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。

为了能准确观察结果，要求药敏纸片均匀分布于培养基上，位置安排适中，防止出现抑制圈重叠。

一般各纸片中心相距应大于24mm，可在平皿中央贴一片，外周等距离贴5－6片。

记住每种药敏纸片的名称。

贴完纸片的平皿15分钟后再置于37℃温箱中培养16－24小时，观察记录结果。

以药敏纸片周围没有肉眼可见生长物区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。

药敏试验结果判定标准

抑菌圈直径（毫米）敏感性

＞20极敏感

15-20高敏感

10-14中敏感

＜10低敏感

0不敏感

实践证明，利用自制药敏纸片进行药敏试验，可以灵活选药，与某病菌相关的药物均可随时制作药敏纸片用于治疗。

可在本场药品范围内或本地区容易买到的药品中选出最敏感的药物。

还可在短时间内选择最佳药品和最佳剂量，既能缩短病程，又能避免盲目用药，减少浪费。

四、根据药敏试验选药原则

完成药敏试验后，应根据结果选择敏感性较高，同时价廉、易得、安全的药物进行治疗，以减少耐药菌株，同时还应注意以下原则：

1、在选择高敏药物时还应考虑药物的吸收途径。

因为药敏试验是药液直接和细菌接触，而在给畜禽用药时，必须通过机体的吸收才能使药物发挥疗效，所以在给畜禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，并予以足够剂量、足够疗程，才会取得好的治疗效果。

2、药敏试验结果仅为临床选择高敏药物的参考。

因动物机体及环境等因素影响，药物的药敏试验与临床治疗效果的符合率一般为70－80%，所以也不能过分地依赖药敏试验。

如发现疗效不显著应及时换药。

3、药敏试验确定的首选药物不是一成不变。

随着药物使用频率的增加及新特药的不断出现，细菌对原先的高敏感药物可能不再敏感。

因此，定期进行药敏试验了解本场细菌对抗菌药的敏感性情况是很有必要的。

4、窄谱抗生素能解决的问题不选广谱抗生素，一种抗生素可达到治疗作用时，不要用两种药物联合应用。

必须应用两种抗生素时，应选择联合应用具有协同作用的药物。

5、避开已经使用过的药物或其同类药物，发病期间已用过的药物或同类药物一般不用。

四、影响药敏试验结果的因素

在以纸片法进行药敏试验时，以下几方面因素可影响试验的结果：

1、培养基：

首先应根据试验菌的营养需要选择适宜的培养基。

培养基的成分的不同，不仅影响敏感菌株的生长繁殖并可影响到抑制圈的直径。

一般细菌，如大肠杆菌及葡萄球菌可使用普通营养琼脂；做磺胺类药物敏感试验时应选用无蛋白胨平板；链球菌和巴氏杆菌可用绵羊血琼脂平板。

其次，倾注平板时，厚度应合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。

培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。

2、细菌接种量：

细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

3、药物浓度：

药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。

商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

4、培养时间：

一般细菌培养温度和时间为37℃12-24小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好药敏纸片的培养基先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较明显的抑菌圈。

五、药敏试验存在的问题

当前进行药敏试验仍然存在一些问题，主要包括以下几方面：

1、方法学不统一，没有标准化。

2、市场提供的药敏试验的培养基、药敏纸片等缺乏严格质控，质量难以保证。

所以还是建议按要求自制药敏纸片。

3、因需要先进行细菌的分离培养，所以药敏试验报告出结果时间长，检验与临床缺乏沟通，对于基层兽医站或养殖场，药敏结果不能满足临床治疗要求，容易延误治疗时机。

但根据有关报道，也可进行简易的药敏试验，方法如下：

无菌取病死畜禽的部分肝、脾等组织，按1：

5加生理盐水研磨制成悬液，静置5分钟，用无菌吸管吸悬液，加两滴于营养琼脂板上，涂布均匀，5分钟后贴上药敏试纸，培养、观察抑菌圈大小。

4、对于部分营养需求较高的细菌或微生物，如链球菌和支原体，临床上较难培养，限制了药敏试验的应用。

5、部分养殖场或基层兽医站缺乏做细菌分离培养和药敏试验的意识。

绝大多数养殖者或技术人员是在没有明确微生物学诊断的情况下使用抗菌药物，养殖场规模越小，细菌培养和药敏试验做的越少，有的养殖场轮翻使用多种抗菌药物而不做细菌培养和药敏试验，致使疗效不佳，治疗时机延误和药品的浪费。

一些病例用药前不做药敏试验，而是在大量使用多种抗菌药物疗效不明显时才想起做细菌培养和药敏试验，而此时细菌已对多种抗菌药产生耐药性。