第八章荧光免疫技术.docx

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第八章荧光免疫技术

第八章荧光免疫技术

FluoreSCenCeImmunoaSay

第一部分目的要求和教学内容

一、目的要求

掌握：

荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：

荧光免疫技术的技术要点；了解：

荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。

二、教学内容

1．荧光标记物的制备：

荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。

2．荧光免疫显微技术：

基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。

3．荧光免疫测定技术：

时间分辨荧光免疫测定（基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用）；荧光偏振免疫测定（基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用）。

第二部分测试题一、选择题

（一）单项选择题（A型题）

1.如下有关荧光免疫技术正确的提法A．直观性检测抗原和抗体B．直观性检测抗原C．直观性检测抗体

D．间接检测抗原或抗体

E．间接检测抗原和抗体

2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度A．10～15℃B．15～20℃C．20～25℃

D．25～30℃E．30～35℃

3．荧光抗体保存3～4年，应选择A．小量分装、4℃B．瓶分装、4℃C．瓶分装、-10℃

D．瓶分装,-20℃E．小量分装、-20℃

4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是A．光源B．聚光器C．目镜

D．物镜E．滤光片

5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型

A．直接法B．夹心法C．间接法

D．补体法E．双标记法

6．荧光抗体染色标本的观察时间

A．当天B.第二天C．第三天

D．1周内E．5天

7．荧光抗体闭接法应标记

A．抗原B．抗体C．补体

D．抗抗体E．抗体及补体

8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是

A．直接法

B．间接法C．双抗体夹心法

D．补体法E．双标记法

9．荧光抗体间接法可检测

A．抗原B．抗体C.补体

D．蛋白质E．抗原和抗体

lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是

A．抗原荧光染色B．抗体荧光染色C．补体荧光染色

D．特异性荧光染色E．非特异性荧光染色

11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术

A．荧光偏振免疫测定B．荧光免疫显微技术

12．临床药物浓度检测的首选方法

A．时间分辨荧光免疫测定

B．荧光偏振免疫测定C．荧光免疫显微技术D．流式荧光免疫技术E．底物标记荧光免疫测定

13．最适合于时间分辨荧光免疫测定的荧光物质

A．异硫氰酸荧光素B．四乙基罗丹明C．四甲基异硫氰酸罗丹明D．藻红蛋白E．镧系稀土元素（Eu）

14．去除过度标记的荧光抗体最好用

A.搅拌法B.透析法C.盐析法

D.凝胶过滤法E.离子交换层析法

15．目前使用最广泛的荧光色素为A.FITCB.RB200C.TRITC

D.R-REE.Eu3+

16．免疫标记技术中发展最早的技术是

A.酶免疫技术

B.同位素标记的免疫技术C.化学发光免疫技术D.荧光免疫技术E.免疫金银技术

17．作为荧光抗体标记的荧光物质必须具备的条件中，与提高观察效果有关的是

A.必须有活性化学基团B.性质稳定C.荧光效率高

D.不影响蛋白质的活性E.标记方法简便快速

18．决定荧光效率的因素主要是

A.物质本身的物理特性B.激发光的波长C.激发光的强度D.溶剂pHE.溶剂极性

19．荧光显微镜光路形式为

A衍射光、落射光B.折射光、透射光

C.透射光、落射光D.折射光、衍射光E.散射光、衍射光

20．RB200产生的荧光色泽为

A.橘红色B.黄绿色C.蓝紫色

D.天青色E.褐黑色

21．落射式荧光显微镜的吸收滤片应安装在

A.激发滤片与分色镜之间B.分色镜与目镜之间C.物镜与分色镜之间D.物镜与载玻片之间E.光源与激发滤片之间

22．能用于抗原定位检测的实验为

A.直接法荧光抗体染色B.TRFIAC.荧光偏振免疫分析

D.ELISAE.免疫比浊分析

23．间接法荧光抗体染色与直接法相比,优点为

A.非特异性荧光染色少B.操作更简便

C.可用于抗原的定位检测D.可用于抗原定性检测

E.检测不同的抗原,只需制备一种荧光抗体24．荧光免疫技术中,应用最广泛的金属元素为A.TbB.CeC.EuD.AuE.Zn

25．关于直接法荧光抗体染色的特点,错误的是

A.简单易行,特异性高B.敏感度偏低

C.非特异性荧光染色因素少D.可检测抗原及抗体

E.每检测一种抗原需制备一种相应的荧光抗体26．临床常用的荧光猝灭剂不包括

A.亚甲蓝B.甲基红C.碱性复红D.伊文思蓝

E.碘溶液

27．荧光显微镜观察时的注意事项错误的是

A.暗室内观察

B.染色后标本立即观察C.37℃观察,效果最好

D.不宜长时间观察一个视野E.宜用无荧光镜油

28．荧光显微镜与普通光学显微镜的不同之处错误的是

A.光源B.滤片C.聚光镜D.电源E.镜头

29.不宜用于荧光抗体染色的标本是

A.血涂片B.肝印片

C.肿瘤切除物切片D.细菌涂片E.尿液

30.下述物质不是荧光色素的是

A.异硫氰酸荧光素B.四乙基罗丹明

C.四甲基异硫氰酸罗丹明D.四甲基伞酮-β-D半乳糖苷

E.藻红蛋白

（二）多项选择题（某型题）

1．对荧光标记物影响的因素有A．pH、温度

B．溴化物、碘化物等杂质C．荧光素的浓度

D．细胞固定剂E．化合物

2．常用的荧光素是指

A．异硫氰酸荧光素B．四乙基罗丹明C．四甲基异硫氰酸罗丹明D．藻红蛋白E．镧系稀土元素（Eu2+）

3．有关荧光显微技术中制作组织标本过程要求

A．尽量保持抗原完整性B．切片尽量薄

C．用丙酮或乙醇固定D．制好的标本尽快染色

E．制好的标本无法及时染色，应置-20℃下低温干燥保存

4．荧光免疫显微技术在临床可用于

A．血清中自身抗体的检测B．各种微生物的快速检查和鉴定C．寄生虫感染的诊断D．白细胞分化抗原的检测E．HLA分型检测

5．荧光显微技术在组织学检查中具有如下优点

A．抗原或抗体的定位B．抗原或抗体的定性检查

C．抗原抗体反应的高度特异性D．荧光标本能持久保存

E．能在荧光显微镜下清晰地显示其形态，直观性强6．间接荧光免疫法的优点是

A．敏感性高于直接法

B．制备一种荧光抗体即可检测多种抗原或抗体C．操作时间较短D．不易出现非特异荧光E．反应参与的因素多

二、填空题

1．荧光免疫技术的主要类型包括（）和（）。

2．荧光物质有（）和（）。

3．荧光抗体染色技术可分为（）和（）。

4．镧系稀土元素标记物制备的螯合剂有（）、（）、（）和（）

5．荧光免疫测定根据抗原抗体反应后是否需要分离结合的与游离的荧光标记物而分为（）和（）两种类型。

6．非均相荧光免疫测定法包括（）和（）。

7．均相荧光免疫测定法包括（）和（）。

8．荧光素标记抗体的方法有（）和（）。

三、名词解释

6．荧光抗体（fluorecentantibody）

7．非均相荧光免疫测定法（anevenphaefluoroimmunoaay）8．均相荧光免疫测定法（evenphaefluoroimmunoaay）

四、问答题

1．试述用于标记的荧光素应具备什么条件2．试述荧光免疫显微技术基本原理。

3．试述荧光免疫显微技术的临床应用。

4．试述荧光偏振免疫测定基本原理。

5．时间分辨荧光免疫测定法具有哪些优点6.简述荧光显微镜的滤片系统。

7.目前临床检验中常用的荧光物质有哪些？

8.简述荧光抗体的制备及纯化方法。

六、论述题

1.荧光抗体技术有哪些优缺点，在临床上有哪些应用？

第三部分参考答案与题解

一、选择题

（一）单项选择题（A型题）

1．A2．B3．E4．D5．B6．A7．D8．B9．E10．E11．C12．B13.E14．E15A16D17C18A19C20A21B22A23E24C25D26B27C28D29E30D

（二）多项选择题（某型题）

1．ABCDE2．ABCD、3．ABCDE4．ABCDE5．ABCE6．AB二、填空题

4．多羧基酸类螯合剂B-二酮体类螯合剂BCPDA，菲洛林5．均相,非均相

6．时间分辨荧光免疫测定荧光酶免疫测定7．荧光偏振免疫测定底物标记荧光免疫测定8．搅拌标记法透析标记法三、名词解释

1．荧光免疫技术：

是将抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性

结合起来的一种免疫分析技术。

2．荧光效率：

是指荧光物质将吸收的光能转变成为荧光的百分率。

3．荧光寿命：

指荧光物质被一瞬时光脉冲激发后产生的荧光随时间而衰减到一定程度时所用的时间。

4．荧光的淬灭：

指荧光分子在某些理化因素作用下、荧光分子的辐射能力受到激发光较长时间的照射后会减弱的现象。

5．荧光素：

是能产生荧光并能作为染料使用的有机化合物。

6．荧光抗体：

荧光素与特异性抗体以化学共价键的方式结合而成，是免疫荧光技术的关键试剂。

7．非均相荧光免疫测定法：

在抗原抗体反应后，先把Ab某Ag与Ab某分离，然后测定

Ab某Ag或Ab某中的标记物的量，从而推算出标本中的Ag量，该方法称非均相荧光免疫测定法。

8．均相荧光免疫测定法：

在抗原抗体反应后Ab某Ag中的标记物失去荧光特性，则不需进行Ab某Ag与Ab某的分离，可以直接测定游离的Ab某量，从而推算出标本中的Ag量，

该方法称为均相荧光免疫测定法。

9．时间分辨荧光免疫测定：

时间分辨荧光免疫测定是用镧系稀土元素螯合物（如

螯合物）标记抗体或抗原，检测标本中的相应抗原或抗体的荧光免疫测定技术。

四、问答题

1．用于标记的荧光素应符合以下要求：

①应具有能与蛋白质分子形成共价键的化学基团，结合后不易解离，而未结合者易清除；②荧光效率高，与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率；③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明；④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫学性质；⑤标记方法简单、安全无毒；⑥与蛋白质的结合物稳定，易于保存。

2．荧光免疫显微技术是以荧光显微镜为检测工具，用荧光素标记特异性抗体或抗抗体，检测固定组织细胞上的抗原或血清中的抗体，常用于定性和定位检查的一门技术。

3．临床常应用于：

①血清中自身抗体的检测；②各种微生物的快速检查和鉴定；⑧寄生虫感染的诊断；④白细胞分化抗原的检测。

4．荧光偏振免疫测定基本原理：

荧光偏振免疫测定是利用荧光素经偏振光照射而跃

入激发态，在回复至基态后可释出光子，经偏振仪形成偏振荧光，荧光偏振强度与荧光分子的大小成正比的关系而建立的免疫分析技术。

5．时间分辨荧光免疫测定法具有特异性强，灵敏度高，标准曲线范围宽，分析速度快，标记物制备较简便、有效使用期长，无放射性污染等优点，因此是很有发展前途的超微量物质免疫分析技术。

6.荧光显微镜的滤片系统有：

⑴激发滤片（e某citerfilter）：

位于光源和物镜之间，作用是使

短光波的光通过吸收长波长的光；⑵吸收滤片（barrierfilter）：

位于物镜和目镜之间，作用

是使荧光通过而阻断荧光以外的其它光。

保护眼睛；⑶隔热滤片：

位于灯室聚光器前，作用：

阻拦红外线。

7.目前临床检验中常用的荧光物质有：

四乙基罗丹明、异硫氰酸荧光素、四甲基异硫氰酸罗丹明、Eu3+的螯合物等。

8.荧光抗体的制备方法纯化方法有透析法、凝胶过滤法、有撑搅拌法及透析法。

六、论述题

1.荧光抗体技术有哪些优缺点，在临床上有哪些应用？

荧光抗体技术的优点：

（1）能做到快速、敏感、定位。

（2）Ag和Ab的特异性与形态的检查结合在一起；

缺点：

⑴对组织细胞进行微细结构的观察做不到；⑵标本不能永久

保存，荧光有自然消退现象，需及时观察及对照相；⑶有非特异性荧光的干扰。

荧光抗体技术的应用：

⑴病毒学方面：

病毒鉴定和病毒在感染cell内的定位；⑵寄生虫学方面：

用于寄生虫的诊断（鉴定、分型）；⑶免疫学方面：

研究、用于自身免疫病的诊断；⑷细菌学方面：

菌种鉴定和Ag结构的研究。