生物工艺学.docx

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生物工艺学

生物工艺学（Biotechnology）是一门利用生物代谢过程并借助于对代谢过程的控制来高效获得生物产物和以高效分离目标产物形成产品过程的组装技术为研究对象的应用学科。

生物技术建立时期的技术和理论基础:

重要的技术基础：

显微镜的发明

重要的理论基础：

细胞学说和生物酶催化理论

乳酸菌:

由糖类生成乳酸的一类细菌。

同型乳酸发酵:

葡萄糖通过EMP途经，并且只单纯产生两分子乳酸的发酵；

异型乳酸发酵：

葡萄糖经HMP途径发酵后除主要产生乳酸外还产生乙醇、乙酸、二氧化碳等多种产物的发酵。

微生物育种的几种常规方式：

1.自然育种

微生物可遗传的特性发生变化称为变异，又称突变，是微生物产生变种的根源，同时也是育种的基础。

自然突变是指在自然条件下出现的基因变化。

从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤：

（1）采样

（2）增殖培养

（3）纯种分离

（4）生产性能的测定

一般采用两步法，即初筛和复筛，初筛通常采用较为简单直观的方法，比如透明圈法、抑菌圈法等。

2.诱变育种

诱变育种是通过人工处理微生物，使之发生突变，并运用合理的筛选程序和方法，把适合人类需要的伏良菌株选育出来的过程。

人工诱变与自发突变相比可大大提高微生物的突变率，使人们可以简便、快速地筛选出各种类型的突变株，供生产和研究之用。

诱变育种基本程序：

（1）出发菌株的挑选

（2）敏感菌和适合对象的选择（3）诱变剂的选择：

选择原则是使用的方便性和有效性（4）诱变剂量的选择（5）初筛（粗筛）最常用的有透明圈法、抑菌圈法和颜色变化等方法。

（6）复筛（精细筛选）通常选用液体摇瓶培养方法，直接检测所需的产物量。

营养缺陷型的筛选:

（1）营养缺陷型

是指某一菌株在诱变后丧失了合成某种营养成分的能力，主要是指合成维生素、氨基酸及嘌呤、嘧啶的能力，使其在基本培养基中不能正常生长，而必须在此培养基中加入相应物质才能生长的突变株。

（2）筛选过程

在诱变后通常通过中间培养、淘汰野生型、营养缺陷型检出、营养缺陷型鉴定等步骤，最终筛选出营养缺陷型。

（3）杂交育种

杂交育种一般是指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。

杂交育种主要有常规的杂交育种和原生质体融合这两种方法。

原生质体融合技术及育种步骤：

1.原生质体的制备

2.原生质体融合主要有：

生物助融（病毒聚合剂）、物理助融（离心沉淀）、化学助融（PEG和Ca2+）。

3.原生质体再生

4.融合子的检出与鉴定

5.融合子的检出常用的两种方法是：

直接检出法和间接检出法。

DNA重组过程：

1．目的基因的获得

2．基因分离

3．ＤＮＡ分子的切割与连接

4．载体

5．引入宿主细胞

6．重组体的选择和鉴定

7．外源基因的表达

优良种子应具备的条件：

（1）菌种细胞的生长活力强，转种到发酵罐后能迅速生长，延迟期短。

（2）菌种生理状态稳定，菌丝形态、菌丝生长速率和种子培养液的特征等符合要求。

（3）菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量要求。

（4）无杂菌污染，能保证纯种发酵。

（5）菌种的适应性强，能保持稳定的生产能力。

孢子制备：

种子制备：

种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。

（1）摇瓶种子制备某些孢子发芽和菌丝分裂速度缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进入种子罐，这就是摇瓶种子。

（2）种子罐种子制备种子罐种子制备一般可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。

种子制备的目的是要形成一定数量和质量的菌体。

影响种子质量的因素及其控制：

种子质量主要受孢子质量、培养基、培养条件、种龄和接种量等因素的影响。

摇瓶种子的质量主要以外观颜色、效价、菌丝浓度或粘度以及糖氮代谢、pH值变化等为指标，符合要求方可进罐。

种子质量判断：

（1）细胞或菌体:

菌体形态、菌体浓度以及培养液的外观，是种子质量的重要指标。

菌体的生长量也是种子质量的重要指标，生产上常用离心沉淀法、光密度法和细胞计数法等进行测定。

种子液外观如颜色、粘度等也可以作为种子质量的粗略指标。

（2）生化指标:

种子液的糖、氮、磷含量的变化和pH值变化是菌体生长繁殖、物质代谢的反映，不少产品的种子液质量是以这些物质的利用情况及变化为指标。

（3）产物生成量:

种子液中产物的生成量是多种发酵产品发酵中考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少是种子生产能力和成熟程度的反映。

（4）酶活力:

测定种子液中某种酶的活力，作为种子质量的标准，是一种较新的方法。

此外，种子应确保无任何杂菌污染。

菌种退化：

菌种退化是指群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象。

常表现为，在形态上的分生孢子减少或颜色改变，甚至变形，在生理上常指产量的下降。

造成菌种退化的原因主要有：

（1）自然突变　

（2）环境条件　　　

菌种的复壮：

常用方法是单细胞分离、纯化、扩大培养。

也可用高剂量紫外线和低剂量化学诱变剂联合处理，或用低温处理等，通过淘汰衰退个体而达到复壮的目的。

菌种保藏的任务：

使其稳定地保存、保持原有的特性、不死亡、不污染。

原理：

人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。

主要从低温、干燥、缺氧三方面设计。

（1）冷冻干燥保藏法

（2）液氮保藏法

（3）斜面保藏法

（4）液体石蜡覆盖保藏法

（5）载体保藏法

（6）悬液保藏法

（7）其他保藏方法

微生物的次级代谢:

主要涉及合成过程，其终产物、次级代谢物对菌的生长不是必需的，对其生命活动可能具有某种意义，在生长后期开始形成。

微生物的次级代谢产物有抗生素、色素、生物碱和毒素等。

微生物的次级代谢物的特征：

1.一种微生物所含有的次级代谢物往往是一组结构相似的化合物。

2.一种微生物的不同菌株可以产生分子结构迥异不同的次级代谢物，不同的微生物亦能产生同一种次级代谢物。

3.次级代谢产物的合成对环境的敏感性比生长强

4.次级代谢在其一个系列当中与一个酶相对应的底物和产物也可以成为其他酶的底物

代谢物流常规控制法:

反馈抑制，协调效应，酶的共价修怖、酶合成控制。

前体是指加入到发酵培养基中的某些化合物能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化，且具有促进产物合成的作用。

微生物次级代谢物大多数源自初级代谢的中间体，可作为次级代谢物的前体。

前体来源:

1.中枢途径的中间体

2.芳香中间体

3.经修饰的糖前体

4.甲基的来源

前体的作用:

1.起初级代谢产物的建筑材料2.具有调节作用

工业培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。

一般设计适宜于工业大规模发酵的培养基就要遵循以下原则：

①必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。

②有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转化率。

③有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。

④有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。

⑤尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。

⑥原料价格低廉，质量稳定，取材容易。

⑦所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。

⑧有利于产品的分离纯化，并尽可能减少“三废”物质的产生。

工业培养基的成分及来源:

1.碳源

2.能源

3.氮源

主要功能：

提供细胞原生质和其他结构物质中的氮素，一般不作为能源使用。

但化能自养细菌中的亚硝化细菌和硝化细菌能从NH3和NO2－等还原态无机含氮化合物的氧化过程中获得其生命活动所需的能量。

对于硝化细菌来说，NH3和NO2－是兼有氮源与能源功能的双功能营养物质。

对于异养微生物来说，含有C、H、O、N的有机化合物是具有碳、能源和氮源三重功能的营养物。

4.无机盐及微量元素

生理功能：

1）提供微生物细胞化学组成中（除C和N外）的重要元素；

2）参与并稳定微生物细胞的结构；

3）与酶的组成和活力有关；

4）调节和维持微生物生长过程中诸如渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位等生长条件；

5）用作某些化能自养细菌物能源物质；

6）用作呼吸链末端的氢受体。

5.生长调节物质

生长因子的主要功能是提供微生物细胞重要化学物质（蛋白质、核酸和脂质）、辅因子（辅酶和辅基）的组分和参与代谢。

6.水

1）水是微生物细胞的主要化学组成；

2）水是营养物质和代谢产物的良好溶剂；

3）水是细胞中各种生物化学反应得以进行的介质，并参与许多生物化学反应；水的比热高，汽化热高，又是热的良好导体，保证了细胞内的温度不会因代谢过程中释放的能量骤然上升；

4）水还有利于生物大分子结构的稳定。

制备培养基的基本原则:

1.目标明确

2.营养协调

3.经济合理

4.条件适宜

5.PH

最适pH：

细菌7.0～8.0，放线菌7.5～8.5，酵母菌3.8～6.0，霉菌4.0～5.8。

6.渗透压及其它

培养基的种类及其应用

Ø根据所培养微生物的类群与营养类型区分

™细菌培养基

™放细菌培养基

™酵母菌培养基

™霉菌培养基

™自养微生物培养基

™异养微生物培养基

Ø根据对培养基成分的了解程度区分

™天然培养基（化学成分不确定）

™合成培养基（化学成分确定）

™半合成培养基（化学成分部分确定）

Ø根据制备后培养基的物理状态区分：

固体培养基、半固体培养基、液体培养基

Ø根据培养基的功能区分：

选择培养基、鉴别培养基、选择压力培养基

培养基的设计原理：

1）菌体的同化能力

2）培养基对菌体代谢的阻遏与诱导影响

葡萄糖效应，亦“葡萄糖分解阻遏作用”，是指当菌种利用葡萄糖时产生的分解代谢物会阻遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活性的作用。

3）碳氮比对菌体代谢调节的重要性

碳氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。

碳源过多则容易形成较低的pH；若碳源不足则容易引起菌体的衰老和自溶。

一般来讲，因为碳源既作为碳骨架参与菌体和产物的合成又作为生命过程中的能源，所以比例要求比氮源高。

4）pH值对不同菌体代谢的影响

确定发酵培养基的思路步骤：

首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生长规律、生理生化特性和一般的营养要求。

其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构，提取方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。

最好先以一种较好的化学合成培养基为基础，先做一些摇瓶试验，然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要营养物质，在合成培养基上得出一定结果后，再做复合培养基试验；最后通过试验确定各种发酵条件和培养基的关系。

常用的优化设计方法

1）正交试验

2）响应曲面法

培养基设计时注意的一些相关问题

•原料及设备的预处理

•原材料的质量

•发酵特性的影响

•灭菌

培养基灭菌的目的：

杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。

培养基灭菌的要求：

达到要求的无菌程度（10-3），尽量减少营养成分的破坏。

灭菌的方法：

1.化学法

2.物理法

——干热灭菌法

——湿热灭菌法

——射线灭菌法

致死温度：

杀死微生物的极限温度。

致死时间：

在致死温度下，杀死全部微生物所需的时间。

微生物的热阻：

是指微生物在某一特定条件下致死时间。

相对热阻：

指某一微生物在某条件下的致死时间与另一微生物在相同条件下的致死时间的比值。