玉米中SOD的分离提取及性质研究doc.docx
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玉米中SOD的分离提取及性质研究doc
玉米中SOD的分离提取及性质研究
学生姓名王旭
学号2013213827
专业班级生物工程13-01班
指导教师钱鑫华樊婷婷
院系名称生物与食品工程学院
组员王旭，崔洪源，戴琦泽，范立峰
一，前言
SOD广泛存在生物界，是防御氧毒害的关键酶。
SOD主要有CuZn-,Mn-,Fe-SOD三种类型的同工酶，它们的共同的生物学作用是专一的清除氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损坏作用），具有抗衰老，抗辐射，抗癌等生理作用。
在医药中，SOD可用于治疗辐射病，自身免疫性疾病，炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老，抗炎，防晒等作用。
植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并且确定SOD同工酶的类型。
根据SOD的性质，我们采用邻苯三酚自氧化法判断同工酶的最适温度，最适PH，以及双氧水对酶的活力抑制。
并采用改进的自氧化法测酶的活力.
1，SOD性质
超氧化物歧化酶（superoxidedismutase）简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。
SOD金属蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。
它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：
铜锌超氧化物歧化酶（Cu·Zn—SOD）、锰超氧化物歧化酶（Mn—SOD）和铁超氧化物歧化酶（Fe—SOD）
2、邻苯三酚自氧化法
根据国际酶学委员会规定，酶的比活性（specificactivity）用每mg蛋白质具有的酶活性单位（U∕mg蛋白）来表示。
因此，测定样品的比活性必须测定：
每mL样品中的蛋白质mg数（mg∕mL）;每ml样品中的酶活性单位数（U∕mL）。
酶的纯度越高酶的活性也就越高。
SOD酶活性测定方法很多，如邻苯三酚自氧化法、肾上腺素自氧化法、黄嘌呤氧化酶法、NBT光还原法、化学发光法等。
在一般情况下，SOD酶活性只能应用间接活性测定法，本实验采用邻苯三酚自氧化法测定。
利用邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化，释放出O2-，生成带色的中间产物。
反应开始后先变成黄绿色，几分钟后转为黄色，线性时间维持在3~4min。
加入酶液则抑制其自氧化速度，在325nm处测定溶液的吸光度。
酶活性单位采用1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶定量为一个活力单位。
邻苯三酚自氧化速率随其浓度的升高而增加
3、不连续电泳
不连续电泳是指使用不同孔径和不同缓冲系统的电泳。
由于浓缩胶的堆积作用，可使样品（即使是稀样品）在浓缩胶和分离胶的界面上先浓缩成一窄带，然后在一定浓度（或一定浓度梯度）的凝胶上进行分离。
由于不同孔径凝胶的分子筛作用，使不连续电泳的分辨率大大高于连续电泳。
虽然不连续电泳在缓冲系统的选择和制胶（特别是梯度胶）的操作方面比较繁杂，但它可以得到电泳分离最重要的指标--高分辨，因而是目前应用最广泛的技术。
二，实验试剂
玉米，氯仿-乙醇混合液、维生素、冷丙酮、邻苯三酚、浓盐酸、蒸馏水、双氧水、TEMED（N,N,N',N'-四甲基乙二胺。
）、氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、溴酚蓝、5.0mol/LPH7.8磷酸钠、10mmol/LHCl、Tris（三羟甲基氨基甲烷;氨基丁三醇）、甘氨酸。
1．2.45mol/LNBT溶液：
称取200mgNBT溶于蒸馏水中并定容至100ml置棕色试剂瓶中，避光贮存。
2.3.60mol/LPH7.8磷酸缓冲液（内含2.8mol/LTEMED和2.8维生素）：
在100ml3.60mol/LPH7.8磷酸钠缓冲液中加0.42mlTEMED及1.32mg维生素，置棕色瓶中贮存。
3．PH8.3Tris-甘氨酸电极缓冲液：
称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g，加水至1000ml,用是加水稀释10倍。
4.PH8.91.5mol/LTris-HCl缓冲液：
称取18.2g三羟甲基氨基甲烷（Tris）加24ml1mol/L盐酸，加水至100ml.
5.PH6.80.5mol/LTris-HCl缓冲液:
称取Tris6.0g,加48ml1.0mol/L盐酸溶液100ml。
6.以及不同浓度的磷酸缓冲液。
0.05mol/L，PH如下
5.86.57.07.37.67.87.98.3
三，实验仪器
移液管、离心机5000r/min,量筒、烧杯、研钵、玻璃棒、微量移液器、试管、分光光度计、1cm比色皿、恒温水浴槽、电泳槽、电泳仪、培养皿、4*108日光灯、容量瓶、烧杯、冰箱等。
四，实验内容
玉米粗酶液的提取
1、提取：
称15g左右的玉米粒至于研钵（事先冷藏）中，使细胞破碎，再加入5ml0.05mol/lPH7.8的磷酸盐缓冲溶液（事先冷藏），继续淹没搅拌15min，使SOD充分溶解到缓冲液中，然后10000r/min,离心10min，弃去沉淀，得蒜的提取液。
2、取出杂蛋白：
玉米粒提取物加入2倍体积的氯仿-无水乙醇混合溶剂，搅拌15min，10000r/min离心10min,取出杂蛋白，得粗酶液。
3、沉淀SOD：
将上述粗酶液加入等体积的冷丙酮，搅拌15min,使SOD凝聚，10000r/min离心10min，得SOD沉淀溶于2mlPH7.8的磷酸盐缓冲溶液中。
SOD性质的研究表一
邻苯三氛自氧化法测定SOD的酶活性：
1、邻苯三氛自氧化速率的测定：
取两支试管按表1加入25℃预热过的缓冲液，然后加入预热过的邻苯三氛（空白管用10mmol/lHCL代替邻苯三氛），迅速摇匀，立即倾入1cm比色皿中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化，得出每分钟的自氧化速率。
（可增减邻苯三氛自的加入量以控制光吸收值）
表一
试剂
空白管/ml
自氧化管/ml
PH8.250mmol/lTris-HCL
3
3
10mmol/lHCL
0.015
0.01
50mmol/l邻苯三酚
--
0．005
2、SOD样液活性的测定
样品管取代自氧化管（表2）。
样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三氛。
其余步骤同邻苯三氛自氧化速率的测定。
表二
试剂
空白管/ml
自氧化管/ml
PH8.250mmol/lTris-HCL
3
3
10mmol/lHCL
0．015
--
SOD样液
--
0．01
50mmol/l邻苯三酚
--
0．005
酶活性的计算：
酶活性=（（自氧化速率-样液速率）/自氧化速率）*（100%）/（50%）*反应液总体积*样液稀释倍数/样液体积根据上述SOD酶活性的测定方法测定在不同PH下、不同温度下、激活剂和抑制剂下求出酶活性。
做出酶活性和不同PH曲线、酶活性与温度曲线、以及在抑制剂条件下酶活力的大小。
①不同PH对酶活力的影响：
首先按下表（表三）加入PH分别为7.1的25℃预热过的缓冲液，注意加入预热过的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入1cm比色皿中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。
改变PH分别为7.7,8.2,8.6,9.0，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。
表三
试剂
空白管/ml
自氧化管/ml
样品管/ml
PH7.150mmol/lTris-HCL
3
3
3
10mmol/lHCL
0．015
0.01
--
SOD样液
--
--
0．01
50mmol/l邻苯三酚
--
0．005
0．005
②不同温度对酶活力的影响:
首先取试管按下表加入0℃的缓冲液，然后加入相同温度下的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入1cm比色皿中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。
记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。
改变温度分别为25℃,50℃,75℃,100℃。
记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。
表四
试剂
空白管/ml
自氧化管/ml
样品管/ml
PH8.250mmol/lTris-HCL
3
3
3
10mmol/lHCL
0．015
0.01
--
SOD样液
--
--
0．01
50mmol/l邻苯三酚
--
0．005
0．005
③抑制剂的影响：
试剂
空白管/ml
自氧化管/ml
样品管/ml
PH8.250mmol/lTris-HCL
3
3
3
10mmol/lHCL
0．015
0.01
--
SOD样液
--
--
0．01
50mmol/l邻苯三酚
--
0．005
0．005
30%H2O2
5滴
5滴
5滴
按下表25℃预热过的液体，最后加入预热过的邻苯三氛，迅速摇匀，立即倾入1cm比色皿中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化，记录自氧化速率和样液速率，计算出酶活力。
与不加抑制剂的相比较得出结论。
表五
PAGE定位染色法鉴定同工酶的类型
按配方（表七）在模具中灌注分离胶后，小心的在分离胶的表面加一层水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），封住胶面，以促使聚合并使凝胶表面垂直。
凝胶在30-40℃放置约40分钟-1小时后，可以看到一个界面，表示凝胶聚合。
吸水（或水饱和的异丙醇或正丁醇），用浓缩胶缓冲液贮液淋洗凝胶，然后灌注浓缩胶。
并插入与模具大小相同，与凝胶厚度相当的梳子。
为防止气泡陷入，梳子应倾斜插入。
然后让模具再静止放置在30-40℃，聚合约40分钟-1小时（注意在分离胶和浓缩胶聚合时，应用日光灯照射以促使凝胶凝聚）
2、加样：
按下表（表八）加入试剂，充分振荡，使醇液与变性剂均匀混合。
（Mn-SOD的活性受氯仿——乙醇的影响，Cu—Zn—SOD和Fe-SOD这两种同工酶均对H2O2酶感，Cu——SOD对KCN酶感，Mn—SOD不受CN的影响）
3、表七
贮液
100ML溶液中含量
pH
凝胶的配置
A
1Mhcl48ML
Tris36g
Temed0.24ml
8.9
分离胶T=10%
A:
C:
E:
H2O=1：
3:
1:
3
C
Acr30g
Bis0.8g
E
核黄素4mg
B
1MHCL48ml
Tis5.9g
TEMED0.46ml
6.7
浓缩T=3.75%
B:
D:
E:
F=1:
3:
1:
3
D
Acr10g
Bis2.5g
F
蔗糖40g
电极缓冲液
甘氨酸28.8g
蒸馏水1L
8.3
用时稀释十倍
编号
试剂
1
2
3
粗酶液/ul
20
20
20
40%蔗糖溶液/ul
（内含少量0.1%溴酚蓝）
20
20
20
氯仿-乙醇/ul
--
7
--
30%H2O2/ul
--
--
7
蒸馏水
7
--
--
待各管溶液配置好后，分别取10ul加入凝胶的3个齿上。
3、电泳：
SOD同工酶的分离采用不连续聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳。
连接电源，调节电流至15mA，待样品由浓缩胶进入分离胶时，再将电流调至20-30mA，当染料前言距离凝胶边缘1-2cm时，关闭电源，电泳结束。
4、SOD活性染色：
取凝胶板，采用SOD负染色方法，按以下次序浸泡于培养皿中染色：
①在2.45×10–3mol/l氮蓝四唑（NBT）黑暗下浸泡20分钟；
②在3.6×10-2mol/lPH7.8磷酸钠缓冲溶液（内含2.8×10-2mol/l四甲基乙二胺（TEMED）、2·8×10-5mol/l核黄素）中，在黑暗条件下浸泡15min；
③5×10-2mol/LpH7.8磷酸钠缓冲溶液。
凝胶板移入此浸泡液，在4×108W日光灯下光照射20~30min。
经上述染色和光照后的凝胶板，在蓝色背景上出现清晰的透明的SOD活性染色带。
染色后的胶板用水漂洗数次后，比较观察凝胶板条带，分析得出结论。
五，实验数据处理及结果
邻苯三酚自氧化速率的测定，sod样液测定
Ａ／ｔ
０
０.５
１
１.５
２
２.５
３
３.５
４
空白管
0
0
0
0
0
0
0
0
0
自氧化
0.123
0.236
0.254
0.282
0.317
0.344
0.389
0.443
0.462
pH值相同温度不同
温度、
/时间
0
0.5
1
1.5
2
2,5
3
3.5
4
0
自氧化
0.007
0.049
0.073
0.112
0.132
0.160
0.185
0.206
0.224
样品
0.130
0.183
0.187
0.194
0.205
0.21.
0.213
0.219
0.221
25
自氧化
0.102
0.124
0.201
0.236
0.275
0.290
0.303
0.310
0.319
样品
0.126
0.177
0.235
0.287
0.307
0.331
0.364
0.348
0.333
65
自氧化
0.018
0.060
0.074
0.088
0.104
0.121
0.148
0.229
0.286
样品
0.129
0.161
0.194
0.204
0.269
0.332
0.357
0.383
0.399
100
自氧化
0.023
0.070
0.079
0.093
0.110
0.131
0.156
0.241
0.297
样品
0.088
0.172
0.195
0.206
0.257
0.301
0.312
0.320
0.329
温度相同PH不同对SOD酶活性的影响
Ph/时间
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
7.1
自氧化
0.020
0.056
0.118
0.140
0.139
0.146
0.153
0.160
0.172
样品
0.259
0.358
0.360
0.379
0.404
0.409
0.416
0.426
0.435
7.7
自氧化
0.012
0.030
0.053
0.077
0.106
0.123
0.155
0.170
0.194
样品
0.450
0.480
0.482
0.487
0.503
0.516
0.522
0.536
0.539
8.2
自氧化
0.102
0.124
0.201
0.236
0.275
0.290
0.303
0.310
0.319
样品
0.126
0.177
0.235
0.287
0.307
0.331
0.364
0.348
0.333
8.6
自氧化
0.095
0.159
0.198
0.233
0.269
0.287
0.398
0.468
0.495
样品
0.096
0.148
0.194
0.225
0.260
0.265
0.302
0.356
0.401
9.0
自氧化
0.095
0.146
0.245
0.268
0.302
0.356
0.435
0.489
0.536
样品
0.099
0.126
0.256
0.266
0.312
0.368
0.401
0.490
0.523
抑制剂对酶活性的影响
抑制剂/时间
０
０.５
１
１.５
２
２.５
３
３.５
４
不含30%的Ｈ２Ｏ２
自氧化
0.102
0.124
0.201
0.236
0.275
0.290
0.303
0.310
0.319
样品
0.126
0.177
0.235
0.287
0.307
0.331
0.364
0.348
0.333
含30%的Ｈ２Ｏ２
自氧化
0.086
0.110
0.120
0.127
0.133
0.137
0.140
0.143
0.146
样品
0.088
0.123
0.138
0.16
0.154
0.162
0.169
0.176
0.181
数据处理结果
PH相同温度不同对SOD活性的影响
温度/℃
自氧化速率
样液速率
酶活性/（U/ml）
0
0.0398
0.0380
203．6
25
0.08323
0.070
462.5
６５
0.06325
0.05780
237.5
100
0.04013
0.03901
98.7
PH
自氧化速率
样液速率
酶活性/（U/ml）
7.1
0.00925
0.00908
50.8
7.7
0.0237
0.0195
278．2
8.2
0.08323
0.070
462.5
8.6
0.08355
0.07650
165.1
9.0
0.07853
0.07520
87.5
温度相同PH不同对SOD酶活性的影响
抑制剂对酶活性的影响
自氧化速率
样液速率
酶活性/（U/ml）
不含有30%的H2O2
0.08323
0.070
462.5
含有30%的H2O2
0.03126
0.02989
223．7
凝胶板条带观察结果
经过三步染色，得到一条紫色条带，实验没有成功。
六，实验结果分析
１由实验数据可知，ＳＯＤ有很强的抗氧化作用，验证了前言中所说的具有抗衰老，抗辐射，抗癌等生理作用。
在医药中，SOD可用于治疗辐射病，自身免疫性疾病，炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老，抗炎，防晒等作用。
２根据邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活力的原理，当酶处在最适温度，最适PH条件下时酶活力最大。
由数据可知最适温度为２５摄氏度，最适ph值在８左右。
３在分析H2O2对SOD的活力影响时，有实验数据知当加入H2O2，吸光光度值增大，及酶的活力减小。
所以H2O2对SOD有抑制作用.
４，提取酶液要在冰水浴中进行，实验过程中尽量保持酶在在低温环境中，配置其他试剂时将酶液放入冰箱冷藏。
５在染色时前两次一定要在黑暗中进行，最后一次在光照下进行。
实验结果讨论
本次综合实验个人认为比较失败，在实验前忘记预习，在实验中有时不知如何去做，在实验中犯了很多错误，在此反思一下实验中所出现的问题，以及做一下误差分析。
１，没有预习在实验中犯了许多错误，如在第二次离心时忘记取上清液，耽误了许多时间。
２，由于酶容易失活所以酶液是现配的，但是在第二天蔬菜并没有买新的，蔬菜中的酶可能已经失活，导致实验失败。
３，在实验中个别组测酶活性时结果呈波浪形，与理论值不符。
可能是由于在加酶液或邻苯三酚是没有搅匀所致。
４凝胶电泳最终没有成功，认为可能是隔夜之后蔬菜中的酶失活，但是测酶活力表明酶并没有失活，可能是胶片的问题。
５在测温度对酶活性影响时，除２５度的样品，其他试管必须水浴保存，在待测试再取出。
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