海水中痕量重金属的薄膜扩散梯度技术.docx
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海水中痕量重金属的薄膜扩散梯度技术
海水中痕量重金属的薄膜扩散梯度技术
原位富集
冯丽凤，刘宝敏，袁东星*
（厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室，环境与生态学院，
福建厦门361102）
摘要：
研究表明对生物体有直接作用的金属并非溶解态的全部，而是其中的活性部分。
薄膜扩散梯度技术（DGT）作为一种原位富集有效态金属的新技术，被广泛应用于自然水体里重金属的分析中。
本研究设计了一DGT装置同时原位富集海水中的Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Cd、Pb。
使用自制的凝胶扩散系数测定装置获得了金属离子在扩散相凝胶中的扩散系数。
考察了pH、离子强度等对富集效果的影响，pH为5.6~8.6、离子强度在10~700mmol/L范围内，富集效果不受影响。
在厦门近岸海域成功地进行为期7d的海水中重金属的原位富集，实验结果显示，DGT能够富集该海域海水中溶解态重金属的6.67%~45.33%，即获得DGT有效态。
平行样测定的相对标准偏差均小于10%，该方法可用于海水中痕量有效态重金属的分析。
关键词:
薄膜扩散梯度技术；重金属；海水；有效态
中图分类号：
X832文献标志码：
A
随着工农业发展，近海重金属污染日益严重。
重金属在海水中以各种化学形态存在，研究表明与生物体直接作用的并不是溶解态金属的全部，而是溶解态金属中的一部分，这个部分被定义为活性（labile）金属[1]。
海水中重金属的存在形态是研究其毒性和生物可利用性的一个关键参数。
自由金属离子、弱结合态金属与生物可利用性之间有很好的相关关系[2]。
目前用于微量重金属的形态分析技术主要包括：
离子交换法、离子选择性电极法、电化学伏安法、荧光法、凝胶渗透色谱法、粒径分级方法[3]。
一般需将样品采集回实验室后进行分析，但水样中重金属的化学形态容易在样品采集、运输、样品预处理与保存过程中发生变化；且各种试剂的添加也可能影响重金属的形态分布。
薄膜扩散梯度技术（diffusivegradientsinthinfilms，DGT）是1994年由Davison和Zhang[4]提出的一种原位富集有效态金属的新技术。
DGT采样装置的关键部件包括扩散相和结合相；水体中的重金属通过扩散相进入结合相而被富集，富集量与时间有关而与样品体积无关。
*通信联系人：
**************.cn
DGT装置可以定时收回，可同时富集多种元素；并提供富集时间内的平均浓度值，尤其适用于待测离子浓度随时间波动较大的水环境[5]。
目前DGT装置已商品化，但改性琼脂糖批次之间的差异会引起扩散系数的差异，因此厂商无法提供准确的扩散系数，用户还是得自行校正扩散系数以便测定。
目前国际上应用DGT技术同时富集多种重金属的报道不多。
国内的DGT研究很少，均只应用于重金属浓度较高的沉积物孔隙水[6]和淡水体系[7]或实验室加标水样[8]，在重金属浓度较低的海水体系的应用尚未见报道。
本实验使用英国兰卡斯特大学提供的改性琼脂糖交联剂，自制DGT采样装置，对其进行性能测试，并应用于厦门市湖里山炮台附近海域有效态重金属的富集。
1实验部分
1.1主要仪器与试剂
ICP-MS（7700x，美国Agilent公司），自制凝胶制备装置，自制凝胶扩散系数测定装置，自制DGT采样装置，超纯水（18.2MΩ·cm，美国Millipore公司），恒温磁力搅拌器（PC-420D，美国Corning公司），数显恒温水浴锅（HH-1，上海梅香仪器有限公司）。
N,N,N',N'-四甲基乙二胺（99%，英国AlfaAesar公司），过硫酸铵（98%，英国AlfaAesar公司），丙烯酰胺（99.9%，生工生物工程（上海）股份有限公司），改性琼脂糖交联剂（2%，英国DGTResearch公司），Chelex-100（Na型100~200目，美国BioRad公司），硝酸（Suprapur，德国Merck公司），聚醚砜膜（0.45μm，美国Pall公司）。
1.2DGT凝胶的制备
DGT凝胶包括扩散相凝胶和结合相凝胶，其制备是薄膜扩散梯度技术的关键。
自制的用于制备凝胶的装置如图1所示，利用两块有机玻璃板将具有一定厚度的三条边垫片夹在中间，用塑料夹固定，从留空的边注入凝胶制备液，再将另一插片置入留空的边，固定。
图1凝胶制备装置示意图
Fig.1Themoldforgelpreparation
1.2.1扩散相凝胶
用超纯水将酸浸泡过的有机玻璃板和垫片冲洗干净，在洁净箱中晾干；用移液枪移取扩散相凝胶制备液（15%丙烯酰胺，0.3%改性琼脂糖交联剂）溶液5mL于25mL的PFA瓶中，分别加入35μL的10%（m/v）的过硫酸铵溶液和12.5μL的N,N,N',N'-四甲基乙二胺溶液，迅速混匀；立即将溶液注入制备装置，并将其平置于恒温（42±2）℃水浴锅中45min。
取出扩散相凝胶放入装有450mL超纯水的PFA瓶中，放置24h，期间换3~4次水，洗去未反应的试剂，使胶充分膨胀。
将胶切成直径2.4cm的圆片，室温保存在0.01mol/L的NaNO3溶液中。
1.2.2结合相凝胶
结合相凝胶制作时除在扩散相凝胶制备液中加入螯合树脂Chelex-100（5mL:
2g）外，其他过程同扩散相凝胶制备。
凝胶制成后在4℃下保存于超纯水中。
1.3金属离子在扩散凝胶内扩散系数的测定和结果的计算
使用自制的凝胶扩散测定装置测定所制备的扩散相凝胶的扩散性能，以计算金属离子在扩散凝胶内的扩散系数[9]。
如图2所示，装置分为A室、B室。
两室之间有一个直径为1.5cm的圆孔，将所制备的直径2.4cm的扩散相凝胶固定在圆孔上，A室和B室中的物质只能通过这个有一定面积和离子渗透性的扩散相凝胶进行交换。
图2自制凝胶扩散系数测定装置示意图
Fig.2Diaphragmdiffusioncell
在A室加入40mL各金属元素质量浓度为1mg/L、NaNO3浓度为0.01mol/L、pH约为2.1的溶液。
在B室加入NaNO3浓度为0.01mol/L、pH约为2.1的溶液。
两室均使用磁力搅拌子搅拌，定时从A室、B室各取出1mL溶液，用于金属离子浓度的测定；同时向A室、B室各补充1mL原溶液。
每次扩散实验进行2.5h，同时测定温度。
根据溶液中金属离子浓度，计算其在扩散相凝胶中的条件扩散系数。
为验证所制备的扩散相凝胶的稳定性，同一片凝胶的扩散系数重复测定7次，并测定7个不同批次制备的凝胶的扩散系数。
根据DGT薄膜扩散的原理计算金属离子在扩散凝胶内的扩散系数：
A室的待测金属离子通过厚度为△g、有效面积为A的扩散相凝胶，扩散到B室。
由于A、B两室待测金属离子有浓度差异，金属离子在A室和B室之间的凝胶内部形成一个与待测浓度相关的浓度梯度。
短时间内由于A室待测金属离子浓度远大于B室的待测金属离子浓度，因此A室的待测金属离子浓度基本不变，B室的浓度忽略不计，当扩散一段时间t后，待测金属离子在扩散相凝胶内的扩散系数可根据式
（1）[10]进行计算：
（1）
式中D为扩散系数，C为A室试液中待测金属离子浓度，△g为扩散相厚度，t为扩散时间，M为扩散入B室的待测金属离子的质量，A为凝胶有效面积。
通过测定B室溶液待测金属离子的浓度，可获得扩散量M，通过测定A室溶液待测金属离子的浓度，可获得原溶液待测金属离子浓度C；已知采样时间、凝胶有效面积以及凝胶的厚度，即可通过式
（1）计算出待测金属离子的扩散系数D。
扩散系数是与温度相关的常数，在不同温度下扩散系数会有相应的变化，校正关系见式
（2）[11]：
（2）
式中Dt为测定温度下的扩散系数值，t为测定扩散系数时的实际温度，D25是25℃下的扩散系数值。
1.4实验方法
1.4.1DGT组装与样品采集
将预处理后的结合相凝胶、扩散相凝胶、聚醚砜滤膜按图3所示放置，由于结合相凝胶在制备过程中Chelex-100树脂会沉降至凝胶一侧，故需确保结合相凝胶含树脂的一面朝上。
本实验所用聚醚砜滤膜厚度为0.135mm，扩散相凝胶厚度为0.727mm，即扩散相厚度△g为0.862mm；装置与水体接触有效面积A为3.14cm2。
将组装好的DGT采样装置放入干净自封袋内，在滤膜表面加入1~2滴0.01mol/L的NaNO3溶液，密封，4℃下保存。
将DGT放入水中采集样品时，应确保采样全过程中DGT表面完全浸入水里，并准确记录放置时间、测定样品采集前后水体的温度和pH值。
取出后的DGT以超纯水充分淋洗，放入自封袋密封4℃下保存，带回实验室。
图3DGT采样装置
Fig.3SchematicofDGTdevice
1.4.2方法空白样的制备
将7个DGT采样装置放入2L超纯水中，用NaNO3调节离子强度为10mmol/L；以磁力搅拌器搅拌，搅拌速度400r/min；用HNO3、NaOH溶液调节pH约为5.6；富集8h，实验温度介于20.3~21.1℃之间。
取出后的DGT以超纯水充分淋洗，放入自封袋密封，4℃下保存。
1.4.3pH影响的测试
对2L超纯水进行加标，各金属离子的加标量均为20μg，并加入NaNO3调节溶液离子强度至约10mmol/L。
分别调节pH为3.6、4.6、5.6、7.6、8.6，共制备5个实验试液。
溶液配制完成后用磁力搅拌器搅拌过夜（搅拌速度400r/min）。
然后将DGT采样装置分别放入各溶液中采样，每个pH试液中放9个，富集时间分别为0、4、8h，每次回收3个DGT采样装置，超纯水冲洗，密封4℃保存。
同时采集试液待测，并测量温度。
1.4.4离子强度影响的测试
对2L超纯水进行加标，各金属离子的加标量均为20μg，调节pH为5.6。
加入NaNO3溶液，调节溶液离子强度分别为0.26mmol/L，10mmol/L，0.35mol/L，0.70mol/L。
其余步骤同pH的影响实验。
1.4.5实际海水的富集
于2014年1月7日将DGT采样装置悬挂于厦门湖里山炮台近岸海域的近海生态浮标平台（24°25′43.90″，118°05′37.93″）上，分别在3d和7d后采样。
实验过程中该海域水体温度平均为10.8℃，pH为8.02。
在放置和回收DGT采样装置的同时，分别采集海水样品，过0.45μm滤膜后酸化至pH<1，4℃下保存待测。
1.4.6DGT所采集样品的预处理
DGT采样完成后，取出结合相凝胶放入干净的离心管中，加入1mL1mol/L的HNO3，确保凝胶完全浸在洗脱液中，振荡24h后，用超纯水稀释成4mL，取1mL溶液待测。
1.4.7样品分析
待测样品溶液直接由ICP-MS分析。
若实际水样是海水，则用2%HNO3（体积分数）稀释10倍（样品量与2%硝酸之比为1:
9），以铑作为内标，用标准加入法建立校正曲线，以消除海水高盐基体对测定结果的干扰。
1.4.8水体中待测金属离子浓度的计算
根据DGT薄膜扩散的原理计算水体中待测金属离子浓度。
水体中待测金属离子通过厚度为△g、有效面积为A的滤膜和扩散相凝胶组成的扩散层，扩散到结合相层，被结合层上的Chelex-100树脂吸附。
由于结合相的作用，扩散相内部形成一个与待测金属离子浓度相关的浓度梯度。
由于Chelex-100树脂能够快速稳定地螯合从待测水体扩散进来的待测金属离子，待测金属离子的浓度在扩散相与结合相交界面上近似为零，在水流>0.02m/s的条件下扩散边界层可忽略不计[12]。
放置一段时间t后，待测物的浓度可根据式（3）[11]进行计算：
（3）
式中C为待测水体中待测金属离子浓度，D为扩散系数，△g为扩散相厚度，t为扩散时间，M为富集的待测物的质量，A为凝胶有效面积。
由于自由金属离子及无机络合物态金属分子的体积较小，其在扩散相凝胶中的扩散系数与其在水溶液中的扩散系数十分相近，故可直接将1.3所测得的自由离子的扩散系数D代入式（3），计算水体中待测金属离子的浓度。
而有机络合态金属化合物由于体积相对较大，在扩散相凝胶中的扩散系数比自由离子的低，采用自由离子的扩散系数计算有机络合态金属的浓度，将引入较大误差。
自然水体的组分十分复杂，有机络合形态多样且很多为未知态。
目前尚无法获取各类有机络合态金属离子的扩散系数，故在实际工作中，仍采用自由离子的扩散系数计算水体中包括有机络合态在内的待测金属离子的浓度[13]。
2结果与讨论
2.1待测重金属离子在凝胶扩散内扩散系数的测定
不同时间多次重复测定待测金属离子在同一片扩散相凝胶的扩散系数，结果一致，表明制得的扩散相凝胶的扩散性能良好、稳定。
不同批次制备的扩散相凝胶的扩散性能的测定结果同样良好、稳定，数据见表1。
图4为典型的扩散相凝胶扩散系数测定实验中，待测金属离子从A室扩散到B室的扩散量与时间的关系图。
表1不同批次扩散相凝胶内金属离子扩散系数的测定结果
Tab.1Diffusioncoefficientsofmetalionsmeasuredin
differentbatchesofdiffusiongel
金属
扩散系数/
（10-6cm2·s-1）
RSD/%
（n=7）
Mn
5.92
1.59
Co
5.95
1.72
Ni
5.77
5.92
Cu
5.99
1.98
Zn
6.09
1.75
Cd
6.08
1.47
Pb
8.07
1.79
24.2~24.5℃,pH2.12.
图4重金属离子的扩散量随时间的变化
Fig.4MeasuredmassofmetalsincompartmentBofthediffusioncellasafunctionoftime
2.2方法空白
取出方法空白样的结合相部分，用1mol/L的HNO3洗脱，稀释成4mL，以ICP-MS测定。
Mn、Cu、Zn、Pb的方法空白分别为0.13、0.14、6.5、0.17ng/片；Co、Ni、Cd空白均低于ICP-MS检出限，仪器检出限分别为0.0069、0.0042、0.0086μg/L。
空白较低，能够满足海水中痕量金属元素的分析要求。
2.3pH和离子强度的影响
2.3.1pH的影响
DGT样品的前处理及分析按照1.4所述实验方法进行。
除pH为3.6及4.6的条件下DGT采样装置对重金属的回收率略有降低，分别约为49%~53%、76%~89%外，其他条件下回收率良好，为88%~108%。
3个平行样的相对标准偏差均小于10%。
Chelex-100树脂是一种以聚苯乙烯二乙烯基苯为基质的螯合剂，其官能团为亚氨基二乙酸盐，能够有选择地螯合二价金属离子。
在低pH下，大量H+会与重金属竞争有效螯合官能团，所以在较低的pH下，DGT的富集效果变差[6]。
2.3.2离子强度的影响
在离子强度为0.26mmol/L的条件下，DGT采样装置对水中重金属的回收率明显降低。
各金属元素的回收率在38%~61%范围内，与Scally等[14]的研究一致。
研究[15]表明，在离子强度较低（<1mmol/L）的情况下，凝胶和溶液之间产生道南电位；由于用超纯水充分洗涤的凝胶呈弱酸性，带正电荷，所以在此条件下凝胶会排斥阳离子的进入，使扩散相内的金属离子浓度梯度低于正常水平，降低富集效率；当电解质溶液浓度大于1mmol/L，溶液中的电解质即可屏蔽该道南电位。
当离子强度为0.35和0.70mol/L时，Mn的富集效率明显下降，回收率分别只有59%、47%，具体机理有待进一步研究。
在其他条件下各金属的回收率良好，介于87%~102%之间。
该结果表明，DGT适用于各种离子强度的水体。
尤即是在河口和近岸等盐度和离子强度变化较大的水体中，富集效果影响不大。
3个平行样的相对标准偏差均小于10%。
2.4海域中重金属的富集
将DGT采样装置布放在厦门湖里山炮台附近近岸海域，对该水体中溶解态Mn、Co、Ni、Cu、Zn、Cd、Pb进行时间序列富集观测，DGT富集结果如表2所示。
将两个批次的富集效率进行平均，得到平均富集率在6.67%~45.33%之间。
与国外的一些研究[16]相比，本实验的DGT有效态比例较低，这可能是由于本研究的观测点靠近滨海旅游区，海水中有机质含量比较高，使不稳定态金属离子的比例较低。
表2厦门近岸海水中重金属的DGT富集结果（n=3）
Tab.2MeanconcentrationofmetalsmeasuredwithDGTinXiamencoastalarea（n=3）
金属
利用DGT所测浓度/（μg·L-1）
原海水平均浓度/（μg·L-1）
平均有效态比例/%
3d平均
7d平均
两批次平均
Mn
1.9870±0.2270
0.8630±0.0182
1.4250
7.142
19.95
Co
0.0078±0.0001
0.0069±0.0004
0.0073
0.028
25.90
Ni
0.8005±0.0206
0.6274±0.0046
0.7139
3.203
22.29
Cu
0.5748±0.0102
0.5545±0.0049
0.5646
4.823
11.71
Zn
1.7525±0.0510
1.4385±0.0380
1.5955
23.91
6.672
Cd
0.0188±0.0023
0.0133±0.0004
0.0160
0.035
45.33
Pb
0.4473±0.0061
0.3551±0.0058
0.4012
5.309
7.556
表3显示了采用ICP-MS对海水试样和经DGT富集试样的测定结果。
可以看出DGT的应用大大提高了ICP-MS测定方法的灵敏度。
使用ICP-MS分析海水样品时，为避免高盐份对炬管造成堵塞，需要对海水样品进行稀释。
DGT除了有富集作用外，还能去除高盐基底，故能将ICP-MS的测定灵敏度提高1~2个数量级。
表3厦门近岸海水中重金属的DGT富集效果（n=3）
Tab.3ThepreconcentrationofDGTinXiamencoastalarea（n=3）
样品
Mn
Co
Ni
Cu
Zn
Cd
Pb
海水进样浓度*（μg/L）
0.71
0.003
0.32
0.48
2.39
0.004
0.53
富集后进样浓度**（μg/L）
17.64
0.07
6.93
5.17
16.01
0.17
5.42
*：
ICP-MS实测的海水浓度；**：
ICP-MS实测的DGT富集的样品浓度
3结论
以Chelex-100树脂为结合相、改性琼脂糖交联的聚丙烯酰胺凝胶为扩散相的DGT采样装置，能准确原位地富集海水中的生物有效态重金属。
该方法具有原位测定、便捷、pH适用范围广、在河口和近海富集时基本不受离子强度影响及样品存放时间长等优点，为海水中痕量重金属的形态分析提供了有效的采样技术。
致谢：
本研究获厦门大学近海海洋环境科学国家重点实验室自主课题MELRI1001和MELRI1202的资助。
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