NR4A2通过肝纤维化中的MAPK通路抑制肝星状细胞增殖.docx

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NR4A2通过肝纤维化中的MAPK通路抑制肝星状细胞增殖

孤核受体NR4A2通过肝纤维化中的MAPK通路抑制肝星状细胞增殖

摘要：

肝星状细胞（HSC）在肝纤维化中起关键作用，肝纤维化是以细胞外基质积累的病理过程。

NR4A2是属于NR4A亚科的核受体，在调节细胞生长，代谢，炎症等生物功能至关重要。

然而，它在HSC中的作用尚不清楚。

我们对纤维化肝脏中的NR4A2表达和刺激的HSCs与对照组作对比，并研究了NR4A2敲除后对细胞增殖，细胞周期，细胞凋亡和MAPK通路的影响。

通过实时聚合酶链反应，Western印迹，免疫组织化学和免疫荧光分析检测NR4A2表达。

纤维化肝组织和PDGFBB或TGF-β中NR4A2表达显着降低后刺激的HSCs与对照组相比。

NR4A2敲除后，α-平滑肌肌动蛋白和Col1表达增加。

此外，NR4A2沉默促进细胞增殖，S期的细胞百分比增加，HSCs中ERK1/2，P38和JNK的磷酸化水平降低。

这些结果表明NR4A2可通过MAPK通路抑制HSC增殖，并减少肝纤维发生中的细胞外基质。

NR4A2可能是治疗肝纤维化的治疗靶点。

关键词：

纤维化，肝星状细胞，MAPK，NR4A2，增殖

介绍

肝纤维化是细胞外基质积累为特征的病理过程。

它可能由炎症，药物，酒精，病毒和胆汁郁积引起。

许多细胞如内皮细胞，肝星状细胞（HSC）和枯否细胞参与肝纤维发生。

其中HSCs起着关键作用，是细胞外基质的主要细胞来源。

HSC，也称为贮脂细胞或窦周细胞，及在肝脏的窦周隙中发现的周细胞。

当肝脏受损时，静息状态的HSC细胞被活化。

MAPK/细胞外调节激酶（ERK）途径对HSC的活化起十分重要的作用。

最近在动物模型中证明肝纤维化是可逆的。

然而，一些机制还仍然不知道。

NR4A亚家族的报道越来越多。

NR4A家族广泛分布在调节分化中，增殖和凋亡的细胞，并且涉及许多疾病如癌症，血管硬化和代谢综合征。

NR4A成员都有高度保守的细胞区域：

可变的氨基末端区域，中心的DNA结合区域在可变且连续的D区域，DBD连接到羧基末端保守E/F区域的。

NR4A是早期反应基因，作为转录因子。

Palumbo-Zerr等人观察到NR4A1招募限制TGF-β导致纤维化的阻遏物。

TGF-β的持续激活抑制NR4A1在纤维化疾病中的表达。

yin等发现，在子宫肌瘤中NA4A1，NR4A2和NR4A3的表达显着下降。

肝脏疾病中NR4A的研究很少。

可以肯定的是，HSCs中ERK1的下调显着减弱了纤维化肝脏细胞外基质沉积。

ERK5/MAPK与NR4A2组合导致转录活性升高。

另外，NR4A2被鉴定为ERK2的靶标。

总之，NR4A2可能调节肝纤维化中的HSC。

在本文中，我们证实NR4A2的表达在纤维化肝组织和PDGFBB或TGF-β刺激的HSC中显着降低。

NR4A2沉默导致α平滑肌肌动蛋白表达量更多，促进细胞增殖和增加S期细胞百分比以及降低ERK1/2，P38和JNK在HSC中的磷酸化。

因此，NR4A2可能是抗纤维化治疗的潜在靶点。

材料与方法

抗体和试剂

来自圣克鲁斯（SantaCruz）的抗甘油脱水磷酸脱氢酶（GAPDH）（SC-25778），NR4A1（SC-5569），NR4A2（SC-991），NR4A3（SC-30154）和α-SMA（SC-32251）CA，USA）。

Alexa氟®546IgG抗体（A10040）和AlexaFluor®488的IgG（H+L）抗体（A21202）得自LifeTechnologies（Carlsbad，CA，USA）。

来自LI-CORBiosciences（Lincoln，NE，USA）的IRDye680抗兔抗体（926-32221）和IRDye680抗小鼠抗体（926-32220）。

来自CellSignaling（Danvers，MA）的Erk1/2（4695P），P-erk1/2（4370P），JNK（9258P），P-JNK（4668P），P-P38（4511P）和P38（8690P），美国）。

Nycodenz（QK1002424-1）来自Nycomed（瑞士苏黎世）。

NC硝化纤维素来自Pall（PortWashington，NY，USA）。

脱氧核糖核酸酶I得自Roche（Basel，Switzerland）。

D-HanK和30％丙烯酰胺溶液来自Bio-Light（中国上海）。

二氨基联苯胺（DAB）试剂盒（GK50705）来自GeneTech（中国上海）。

细胞周期和细胞凋亡分析试剂盒购自R＆S（中国上海）。

膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂盒来自Keygen（中国新泽西州）。

TGF-ββ1得自Peprotech（RockyHill，NJ，USA）。

吐温-20和过硫酸铵均获自国药（中国北京）。

Lipofect-amineTM2000购自Invitrogen（Carlsbad，CA，USA）。

胶原酶IV，PDGFBB和Pronase购自Sigma（St.Louis，MO，USA）。

粪便小牛血清（FBS）购自Gibco（Waltham，MA，USA）。

RIPA缓冲液，苯基甲基磺酰氟，TEMED，5×SDS加载缓冲液和BCA试剂盒均来自Beyotime（中国上海）。

动物和肝脏样品

将大约250-270g的雄性Sprague-Dawley大鼠（SLAC，中国上海）保持在12小时黑暗/12小时光照循环中。

所有动物实验均经上海交通大学附属第六人民医院动物保护使用委员会批准（许可证编号SYXK2011-0128）。

人肝脏样本由上海交通大学附属第六人民医院肝胆外科科提供。

所有样品均按照上海交通大学伦理委员会的要求。

细胞培养

HSC-T6细胞由纽约大学西奈山医学院（MSSM）的Friedman博士亲自提供。

细胞在补充有10％热灭活胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中培养。

将所有细胞在37℃下用5％CO2保持在潮湿的培养箱中。

使用血小板衍生生长因子（PDGF）BB或TGF-β进行刺激。

RNA分离和定量实时聚合酶链反应

使用Trizol从HSC-T6细胞中提取总RNA，并使用PrimeScriptRTMasterMix逆转录。

使用SYBRGreenPCRKit和AppliedBiosystems7500实时PCR系统进行实时聚合酶链反应（RT-PCR）。

引物序列如下：

NR4A1（Fw：

5'-ACACCGGAGAGTTTGACACC-3';Rev：

5'-GGGTAGCAGCCATACACCTG-3'）;NR4A2（Fw：

5'-AGATTCCTGGCTTTGCTGAC-3';Rev：

5'-CTGGGTTGGACCTGTATGCT-3'）;NR4A3（Fw：

5'-GGCTGCAAGGGCTTCTTCA-3';Rev：

5'-CACCATCCCGACACTGAGACA）;α-SMA（Fw：

5'-CCAGGGAGTGATGGTTGGA-3';Rev：

5'-CCGTTAGCAAGGTCGGATG-3'）;Col1（Fw：

5'-AGGCATAAAGGGTCATCGTG-3';Rev：

5'-ACCGTTGAGTCCATCTTTGC-3'）;β-肌动蛋白（Fw：

5'-ACCCACACTGTGCCCATCTATG-3';Rev：

5'-AGAGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3'）。

循环条件为95℃30秒，95℃5秒和60℃34秒循环40次，95℃95秒15秒，60℃1分钟，95℃15分钟秒。

将所得序列归一化为β-肌动蛋白表达水平，并通过2-ΔΔCT方法测量相对基因表达。

免疫组织化学和免疫荧光

将肝组织包埋在石蜡中并切片。

将切片在3％H2O2的甲醇中孵育，并用10％正常山羊血清阻断非特异性结合。

将切片与第一抗体在4℃孵育过夜，洗涤并在室温下与二抗孵育60分钟。

使用DAB试剂盒观察抗原-抗体复合物。

如先前所述进行免疫荧光。

为了检测NR4A2和α平滑肌肌动蛋白（α肝组织中α-SMA）的表达，将切片孵育48小时，在4℃下用下列一抗：

NR4A2（1:

50），Alexa氟®546的IgG（1：

500），Alexa氟®488的IgG（H+L）（1：

500）。

将切片在4,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，1:

100）中孵育1分钟并安装在抗褪色试剂中。

NR4A2siRNA转染

对于RNA干扰测定，将细胞以5×105的密度接种到6孔细胞培养板中细胞。

根据制造商的说明书，用siRNA和Lipofectamine2000转染细胞。

针对NR4A2（GenePharma，Shanghai，China）的双链小干扰RNA（siRNA）如下：

siRNA

（1）（Fw：

5'-CGCGAAAUAUGUGUGUUUATT-3';Rev：

5'-UAAACACACAUAUUUCGCGTT-3'）;siRNA

（2）（Fw：

5'-GACCAUGUGACUUUCAAUATT-3';Rev：

5'-UAUUGAAAGUCACAUGGUCTT-3'）;siRNA（3）（Fw：

5'-GACCUCACCAACACUGAAATT-3';Rev：

5'-UUUCAGUGUUGGUGAGGUCTT-3'）;阴性对照（Fw：

5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3';Rev：

5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'）。

简言之，将100nmolsiRNA和5μlLipofectamine2000以最终体积为500μl稀释在血清和抗生素游离opti-DMEM（Invitrogenn，Carlsbad，CA，USA）中。

在室温下混合20分钟后，2培养箱。

合成了与大鼠基因没有已知同源性的非沉默siRNA作为阴性对照。

初级HSC隔离

制备了主要HSCs的Sprague-Dawley大鼠。

麻醉后，打开大鼠腹壁，将肠移开，以露出腔静脉和门静脉。

将固定到适当位置的精细插管插入静脉。

灌注溶液在使用前在37℃下孵育。

然后使用可调式蠕动泵来控制原位肝灌注过程。

肝肿胀后，打开下腔静脉插管以排出。

随后，用D-HanK溶液，胶原酶IV溶液，Pronase溶液在37℃下依次灌注肝脏15分钟。

收集破碎细胞，洗涤并置于缓冲液的顶层和18％Nycodenz的底部缓冲液之间。

在1400g离心22分钟后，得到顶部和中间层之间的HSCs部分。

最后，将细胞在补充有10％FBS的DMEM培养基中培养。

蛋白质印迹

根据之前所述方案进行Western印迹分析。

使用针对α-SMA（1:

500），GAPDH（1:

1000），NR4A1（1:

500），NR4A2（1:

500），NR4A3（1:

500），IRDye680抗兔（1：

5,000），IRDye680抗鼠（1:

5000），Erk1/2（1:

5000），P-erk1/2（1：

1,000），JNK（1：

1,000），P-JNK（1：

P-P38（1：

1,000）和P38（1：

1,000）。

将蛋白质样品进行SDS-PAGE，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。

封闭后，将膜与一抗，然后与过氧化物酶结合的二抗一起温育。

通过奥德赛红外成像系统扫描蛋白质样品。

CCK-8测定

根据制造商的说明书，使用CellCountingKit-8评估细胞活力。

简言之，将用NR4A2siRNA转染的HSC-T6细胞接种到96孔板（每孔3×103个细胞）中。

接下来，向每个孔中加入10μlCCK8，将细胞在37℃下孵育2小时。

使用酶标仪在450nm下评估吸光度。

各组孔平均光密度（OD）用于绘制细胞生长曲线。

细胞周期分析

将细胞以5×105个细胞的密度接种到6孔细胞培养板中。

细胞用siRNANR4A2转染，48小时后，根据制造商的方案收集细胞，染色并用碘化丙啶（PI）固定，并使用流式细胞仪进行细胞周期分析，。

细胞凋亡测定

将细胞以5×105个细胞的密度接种到6孔细胞培养板中。

细胞用siRNANR4A2转染，48小时后收获细胞。

使用FITCAnnexinV细胞凋亡检测试剂盒根据制造商的方案测量细胞凋亡测定，并使用流式细胞仪进行细胞周期分析。

统计分析

结果以平均值±SD表示，并通过方差分析（ANOVA）或Student'st检验进行分析，随后进行配对比较。

P<0.05作为最小显着性水平。

结果

活化的HSCs中NR4A2表达降低

HSCs在肝纤维化中起重要作用。

安静的HSC可以被许多因素激活并产生细胞外基质。

α-SMA是肝纤维化的标志物。

PDGF和TGF-β是强刺激因子。

HSC-T6细胞被PDGFBB（10ng/ml或20ng/ml）刺激后，NR4A2mRNA水平显着降低，而α-SMA水平显着升高（图1A）。

在HSC-T6细胞中，用PDGFBB（分别为10ng/ml，20ng/ml）处理后，NR4A2蛋白水平显着降低，但在NR4A1和NR4A3表达中发生不明显的变化（图1B）。

用TGF-β（2ng/ml）处理后，图1C）。

我们还在PDGFBB（图1D）或TGF-β（图1E）刺激后，在短时间内筛选了NR4A2表达。

与对照组相比，NR4A2mRNA水平显着升高12小时，NR4A2蛋白水平在PDGFBB（图1F）或TGF-β（图1G）刺激后略有升高。

此外，我们从SD大鼠中分离出原代HSC。

原代肝星状细胞可以自发刺激并分离数天后增殖（Davis＆Vucic，1988）。

我们观察到NR4A2mRNA表达量明显下降，而α-SMA水平在分离后的原代肝星形细胞中增加2-7倍（图2）。

NR4A2在纤维化肝组织中的表达下降

SSkip[0.25em加.1em减.1em]α-SMA主要表达纤维化区域，其中细胞外基质积累而NR4A2在肝组织的纤维化和非纤维化区域中表达。

然而，与正常肝相比，纤维化肝脏纤维化面积占更多。

免疫组织化学分析所示纤维化的NR4A2比非纤维化区域表达量低（图3A和3B）。

通过免疫荧光分析观察到相同的结果（图3C）。

NR4A2在HSCs中抑制α-SMA和Col1的表达

为了阐明NR4A2与肝纤维化之间的相关性，我们通过三种siRNA敲除了NR4A2，并检测了HSC-T6细胞中细胞外基质标记物的表达。

RT-PCR分析表明，NR4A2的mRNA表达水平减少了50％以上（图4A）α-SMA和Col1中增加大于50％（4B和4C）。

NR4A2抑制细胞增殖，调节细胞周期和促进细胞凋亡

在HSC-T6细胞中的NR4A2敲除后，我们通过流式细胞仪分析细胞周期和凋亡，并通过检查光密度测定CCK8。

流式细胞术显示在G1期降低细胞的百分比，并用NR4A2敲除后与对照组相比，S期增加百分比图（5A和5B）。

5B）。

NR4A2敲除也导致减少细胞凋亡（图5C和5D）和对HSC-T6细胞促进增殖（图5E）。

NR4A2在HSC增殖中MAPK通路的上调

在肝纤维发生中，MAPK是由ERK1/2，P38和JNK组成的重要信号通路。

Western印迹分析表明HSC-T6细胞中NR4A2敲除后ERK1/2，P38和JNK的磷酸化水平降低（图6A-6C）。

讨论与结论

在全世界肝纤维化普遍存，主要由HSCs发挥重要作用。

一方面，清除活化的HSC一直作为抗纤维化的治疗;另一方面，激活的HSC也可以恢复为静止状态。

激活的HSC在肝纤维化中被抑制的机制值得广泛研究。

现有的证据表明核受体介导是HSCs激活的关键步骤。

过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）抑制静止期HSCs的促纤维化基因表达。

用PPAR-γ激动剂治疗可以抑制HSCs的活化和胶原蛋白的产生。

RAR和RXR对HSC具有相似的作用。

NR4A1在肝纤维化中表达较低。

TGF-β的长时间刺激下调NR4A1的表达水平，而短时间刺激导致人皮肤成纤维细胞中NR4A1的表达量增加。

yin等调查了NR4A家族在子宫肌瘤中的作用。

他发现平滑肌瘤中NA4A1，NR4A2和NR4A3的表达明显低于对照组。

NA4A2和NR4A3的降低显着高于人类纤维瘤中的NR4A1。

与上述结果一致，我们的研究表明NR4A2表达在肝纤维化和PDGFBB或TGF-β中降低激活的HSC。

同时NA4A1或NR4A3没有观察到显着变化。

NR4A2主要涉及多巴胺神经元的功能维持并与神经系统疾病如阿尔茨海默病和帕金森病相关。

据我们所知，这是关于NR4A2在肝纤维化中的作用的第一份报告。

为了进一步测试短时刺激的影响，我们在刺激后评估HSC-T6细胞中NR4A2水平低于24小时。

响应于PDGFBB，NR4A2mRNA水平从1小时升高至24小时，特别是其水平升高12小时，增加了60倍以上。

相比之下，NR4A2蛋白水平从3小时到24小时并没有显着增加。

用TGF-β刺激获得相似的结果。

从某种程度上来说，我们的结果与Palumbo-Zerr等人一致

原代肝星状细胞可以自发刺激并在分离后数天增殖，同时静息HSC转化成类似于体内过程的活化HSC。

我们发现NR4A2表达急剧下降，分离的肝星状细胞中α-SMA和Col1表达明显增加。

NR4A2敲除后，α-SMA和Col1及肝纤维化的其他特征标志物显着下调。

总之，NR4A2与肝纤维化有关系，NR4A2可能下调ECM基因。

前列腺组织NR4A2表达显着升高，NR4A2敲除细胞增殖，浸润和迁移受到抑制。

与癌症不同，我们发现NR4A2的损失导致细胞凋亡减少，促进增殖，G1期细胞百分比降低，肝纤维化S期百的分比增加。

相反，NR4A2的过度表达降低了细胞增殖。

NR4A2可以通过各种信号通路调节MAPK在其中发挥重要作用。

MAPK由ERK1/2，P38和JNK组成。

我们的研究表明，NR4A2沉默后抑制ERK1/2，P38和JNK的磷酸化。

可以得出结论，NR4A2通过磷酸化ERK1/2，P38和JNK，HSC抑制细胞增殖。

用TGF-β处理导致NR4A2水平降低，NR4A2敲除诱导ERK1/2，P38和JNK的磷酸化水平降低。

所以似乎TGF-β的刺激导致抑制MAPK的磷酸化。

这与TGF-β在肝纤维发生中诱导MAPK/ERK活化的理论是矛盾的。

然而，证实通过抑制ERK激活TGF-β抑制胰腺癌细胞和T细胞中的细胞增殖。

我们推测，NR4A2不是TGF-β的唯一靶标，其他基因可能抵消NR4A2。

此外，TGF-β和NR4A2可以相互作用。

但目前的机制尚不清楚。

同时，我们也注意到肝脏组织中肝细胞中NR4A2的表达较高。

其他细胞在体内表达NR4A2并不矛盾。

Taura等人表明肝细胞不参与肝纤维发生。

我们的研究表明NR4A2通过MAPK通路下调HSC增殖，并减少肝纤维发生中的细胞外基质积累。

然而，还有一些缺点，如缺乏动物实验。

NR4A2的靶基因和NR4A2调节HSC的机制需要在未来的研究中进行探讨。

总之，NR4A2可通过调节MAPK通路抑制HSC的增殖，减少细胞外基质。

NR4A2可能是抗纤维化的有希望的靶点。

1.NR4A1，NR4A2，NR4A3和α-SMA在HSC-T6细胞中的表达。

NR4A1，NR4A2，NR4A3的（A）中的表达及α通过实时PCR（检查-SMA在有或没有PDGFBB（20纳克/毫升）48个小时刺激的HSC-T6细胞Ñ≥3）。

*P<0.05vs.NC。

（B）不同浓度（0ng/ml，10ng/ml和20ng/ml）刺激48h的PDGFBB刺激的HSC-T6细胞中NR4A1，NR4A2和NR4A3的Western印迹分析。

（C）用TGF-β（2ng/ml）刺激的HSC-T6细胞中NR4A1，NR4A2和NR4A3的Western印迹分析48小时。

（D）在通过PDGFBB刺激HS-T6细胞NR4A2水平的实时PCR分析（20纳克/毫升）1个小时，12小时和24个小时（Ñ≥3）。

***P<0.001对NC。

（E）在由TGF-β刺激的HSC-T6细胞NR4A2水平的实时PCR分析β（2纳克/毫升）1个小时，12个小时和24个小时（Ñ≥3）。

***P<0.001vs.NC。

（F）由PDGFBB（20ng/ml）刺激的HSC-T6细胞中3天，12小时和24小时的NR4A2水平的Western印迹分析。

（G）TGF-β（2ng/ml）刺激的HSC-T6细胞中3h，12h和24h的NR4A2水平的Western印迹分析。

2.NR4A2的表达和α通过实时PCR（检查在分离之后初级肝星状细胞-SMAÑ≥3）。

**P<0.01与第0天组。

结果表示为平均值±SD。

3.NR4A2在人肝组织中的表达。

在正常肝脏（A）和肝硬化肝脏（B）中通过免疫组织化学检测NR4A2表达。

（C）NR4A2在人正常和肝硬化的肝组织表达通过用抗NR4A2（绿色）和抗双染色证实αSMA（红色）的抗体。

显示DAPI染色（蓝色）和合并图像。

刻度棒200μm。

4.在HSC-T6细胞中NR4A2敲低后NR4A2，α-SMA和Col1的分析。

NR4A2（A），表达α通过实时PCR（检查α-SMA（B）和Col1中（C）在HSC-T6Ñ≥3）。

*P<0.05vs.NC，**P<0.01vs.NC。

结果表示为平均值±SD。

5.分析HSC-T6细胞NR4A2敲低后的细胞增殖，细胞周期和细胞凋亡。

（A，B）细胞周期分析。

用于对照和siRNA感染的HSC-T6细胞的流式细胞术图（A）。

细胞周期摘要（B）。

在G1期细胞的百分比NR4A2敲除后下降，S期细胞的百分比增加（Ñ≥3）。

*P<0.05vs.NC，**P<0.01vs.NC。

（C，D）细胞凋亡分析。

用于对照和siRNA感染的HSC-T6细胞的流式细胞术图（C）。

（D）细胞凋亡的总结。

NR4A2敲低后HSC-T6细胞的凋亡百分比显着下降（Ñ≥3）。

*P<0.05vs.NC。

（E）的细胞增殖通过细胞计数试剂盒-8（分析Ñ≥3）。

*P<0.05vsNC。

结果表示为平均值±SD。

6.在HSC-T6细胞NR4A2沉默敲低后分析ERK1/2，P38和JNK。

（A）通过Western印迹和相对强度（P-ERK1/2归一化针对ERK1/2）ERK1/2的磷酸化分析（Ñ≥3）。

*P<0.05vs.Con。

通过Western印迹和相对强度（P-JNK对JNK归一化）（JNK的磷酸化（B）分析Ñ≥3）。

*P<0.05vs.Con。

通过Western印迹和相对强度（P-P38对P38归一化）P38的磷酸化的（C）分析（Ñ≥3）。

**P<0.01vs.Con。

结果表示为平均值±SD。