1栽培箭叶淫羊藿中黄酮类化合物的微波辅助提取提取领域和机制抗氧化性和化学成分.docx

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1栽培箭叶淫羊藿中黄酮类化合物的微波辅助提取提取领域和机制抗氧化性和化学成分

栽培箭叶淫羊藿中黄酮类化合物的微波辅助提取：

提取领域和机制、抗氧化性和化学成分

Hua-FengZhanga,c,XiangZhanga,Xiao-HuaYangb,∗,Nong-XueQiua,

YingWangc,Zhe-ZhiWanga,∗

a药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，中国西北地区濒危药材资源开发国家工程实验室，食品工程与营养科学学院，陕西师范大学，西安710062，中国

b卫生部法医科学重点实验室，西安交通大学医学院，陕西西安710061，中国

c武汉植物园，研究生院，中国科学院，武汉430074，中国

文章信息

关键词：

黄酮类化合物栽培箭叶淫羊藿微波辅助提取萃取机理抗氧化活性化学成分

摘要：

优化微波辅助提取工艺来分离栽培箭叶淫羊藿中的黄酮。

比较微波辅助提取与两种传统提取方法（即加热萃取和搅拌床提取）的提取率和提取机制，抗氧化活性和化学组成。

扫描电子显微照片说明微波辐射导致叶样破坏（分解），这可能会增加萃取剂和细胞内成分之间的转移，特别是促进黄酮向萃取剂的分泌（溶出）。

微波辅助萃取得到的类黄酮提取物的抗氧化活性比那些传统提取方法高。

通过微波辅助提取，加热提取和搅拌床萃取所得的黄酮提取物含有不同数量的朝藿定（淫羊藿定）A，B，C和淫羊藿苷。

相比传统的提取方法，微波辅助萃取呈现出独特的优势，因为它有优越的提取率、高抗氧化能力的提取物和更高比例的标记化合物，因此在成为栽培箭叶淫羊藿资源有效利用的替代技术方面显示出巨大的潜力。

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1.介绍

淫羊藿是中国近两千多年最有名的中草药资源之一，是常用的一种壮阳药，补药和抗风湿药（Zhang等，2008）。

淫羊藿有大约57种，其中绝大多数是分布在中国（Ma等，2011）。

五个品种在中国药典里被指定为官方药材资源（中国人民共和国国家药典委员会，2010）。

其中，箭叶淫羊藿被公认为是一种很好的药材，因为它在中国分布较广，生物量生产高而且其中朝藿定A、B、C，淫羊藿苷和总黄酮的含量较高，（Zhang等，2008;Liang等，2012）。

近年来，箭叶淫羊藿在应用到药用植物和医学处方方面显示出明亮的前景（Zhang等，2008）。

根据资源调查，在中国，市售约三分之二的药用植物从野外收集，只有20％的商业化药材品种是栽培所得（坎特等，2005;Ma等，2011）。

目前，淫羊藿野生植物（包括箭叶淫羊藿）仍然是药材的主要来源。

野生采伐已经极度耗尽自然种群，一些淫羊藿品种已经濒临灭绝（张，杨，2012）。

因此，迫切需要采取适当的措施，以保护野生淫羊藿植株，可持续利用野生淫羊藿资源（张，杨，2012）。

一个有效的办法是提高淫羊藿生物活性成分的提取率，从而促进原材料的利用效率。

另一个重要的方法是用在GAP（良好农业规范）条件下栽培的箭叶淫羊藿作为原料，以减少野生植物，同时促进标准化箭叶淫羊藿的利用率以克服克服中国草药的问题，如误认和提取物可变性的问题（坎特等人，2005）。

箭叶淫羊藿的主要有效成分是黄酮类化合物，并且目前已经有超过60种黄酮类化合物从少数几个淫羊藿品种中被鉴定出（张，杨，2010）。

在中国药典中，总黄酮含量被认为淫羊藿品质的指标（中国人民共和国国家药典委员会，2010）。

大量研究表明，淫羊藿黄酮具有调节内分泌和改善免疫系统的疗效，并有抗炎，抗衰老，抗癌，抗抑郁和抗氧化功能（吴，2005;张，杨，2010）。

不幸的是，淫羊藿中类黄酮并不丰富，这呈现出了一个巨大的挑战在淫羊藿黄酮的重获和纯化方面。

一般情况下，传统提取方法（例如，加热萃取）所获得的黄酮类化合物的数量和质量是不能令人满意的（Zhang等，2011;埃斯特雷亚和凯瑟琳娜，2011）。

因此找到一个有效的方法来分离栽培箭叶淫羊藿中的黄酮类化合物有重要的经济和生态学意义。

微波辅助提取是从植物原料中提取有价值化合物重要技术之一（Tameshia等，2010;Zhang等，2011;伊沃娜等，2013）。

一般来说，微波辅助提取具有明显的优点，因为它与传统提取方法相比，有更高的提取率，更短的提取时间，更高的选择性和质量更好的的目标提取物（Zhang等，2011;Tanongkankit等，2013）。

由Chen等设计的（2008）一种动态微波辅助萃取系统显著提高了草本淫羊藿中黄酮类化合物的提取率。

虽然有大量的文献拿微波辅助提取和传统的提取方法作了比较，但大部分的手稿只涉及提取时间和提取率。

事实上，目标提取物的药理活性和化学成分也是淫羊藿资源有效利用率的重要方面，因为生物活性和化学组分的变化很有可能影响提取物的质量。

因此开发一个微波辅助提取的草案（协议）也是很有用的，这种微波辅助提取草案更侧重于目标提取物的生物活性和化学组分。

据我们所知，还没有关于微波辅助提取栽培箭叶淫羊藿中黄酮类化合物的报道，而且没有文献比较微波辅助提取和传统提取方法中箭叶淫羊藿黄酮提取物的提取机制、生物活性和化学组分。

本论文研究的目的是优化从栽培箭叶淫羊藿中分离黄酮化合物的微波辅助提取条件，以阐明淫羊藿黄酮的微波辅助提取机制，并比较微波辅助提取和传统的提取方法包括加热提取和搅拌床提取所得的黄酮化合物的抗氧化活性和化学组分。

2.方法

2.1材料和试剂

箭叶淫羊藿从野外引进并栽培在实验用的GAP田里（图1）。

栽培植物被提供用单层遮阳网做的人工阴影。

在全开花期收割鲜叶，并立即用自来水和蒸馏水洗净。

清洗后的叶片在25±2◦C通风设备下阴干直到恒重。

将干叶子研磨成细粉，然后通过20目的试验筛，以确保其均一性。

然后，将均匀的粉末于55◦下在鼓风恒温干燥箱中干燥至恒重，并存储在黑暗密封容器中备用。

乙腈是一种HPLC（高效液相色谱）优级试剂（费希尔化学试剂，美国）。

去离子水用Milli-QPlus系统制备（Millipore公司，美国）。

朝藿定A，B，C和淫羊藿苷标准品（纯度≥98％）购自Chromadex公司（美国）。

1,1-二苯基-2-苦基苯肼（DPPH）和2,2-连氮基-双（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）购自Sigma化学公司（美国）。

所有的所用的其它试剂均为分析级，并且所有HPLC制备的溶液都通过0.45μm微孔膜过滤以备用。

2.2仪器设备

用微波实验系统（型号NJC03-2，2450兆赫，中国）进行栽培箭叶淫羊藿中黄酮类化合物的微波辅助提取。

该系统包括一个提取器（240毫升）中，可调节的功率设定（100-800瓦），温度传感器，机械搅拌器和温度调节器。

恒温摇床中的搅拌床提取（型号THZ-C，中国）。

样品制备用旋转蒸发器（型号RE-52，中国）和冷冻干燥机（型号LGJ-18C，中国）来实现。

色谱分析用配有二元泵的高效液相色谱系统（型号沃特斯1525，USA）中进行的，紫外-可见（UV-VIS）检测器（型号沃特斯2487，USA）和反相柱（型号ZORBAXSB-C8，4.6毫米×250毫米，5微米粒径，美国）。

分光光度实验用紫外-可见分光光度计（型号为TU-1810，中国）以0.3纳米的自动波长精度和1.0cm光程匹配的石英比色皿进行。

显微照片是使用扫描电子显微镜（型号日立TM1000，日本）获得，该扫描电子显微镜配备了一个离子涂布机（型号荣子ⅠB-3，日本）。

2.3提取方法

2.3.1微波辅助提取

用240毫升溶剂将叶粉末在微波萃取容器中混合，室温无微波照射的条件下浸渍，然后使用微波照射在不同温度下提取一定时间。

在提取过程中，叶末-溶剂混合物定期搅拌以确保混合物均匀暴露于微波照射下。

提取后，将混合物冷却到室温，然后在3250×g离心10分钟。

上清液通过0.45微米的微孔膜过滤并收集含黄酮提取物的滤液。

将萃取液在45-55◦C真空下旋转蒸发浓缩至小体积，最后冷冻干燥。

2.3.2加热提取

加热萃取按如前所述进行，有稍微修改（Chen等，2005）。

简言之，将3.2克的叶粉末与240毫升70％（体积/体积）的乙醇溶液相混合，在室温下浸泡20分钟，并在75◦Ç萃取25分钟。

然后将混合物在3250×g离心10分钟，通过0.45微米微孔膜过滤。

滤液（黄酮提取物）进行减压蒸馏，最后冻干。

2.3.3搅拌床提取

搅拌床萃取被Santos等改性（2010年）。

将与240ml70％（V/V）乙醇溶液相混合的3.2克的叶粉末在室温下浸渍20分钟，然后在带有搅拌器（150rpm）的恒温振荡仪中于30◦Ç下提取25分钟。

然后，将混合物离心，过滤，蒸馏，然后如上所述冻干。

2.3.4提取率测定

不同提取方法所获得的黄酮提取物中总黄酮被有色定量，用中国人民共和国国家药典委员会（2010年）所描述的方法进行。

在270纳米波长下测黄酮提取物的吸光度值。

黄酮类化合物的含量计算采用淫羊藿苷作为标准的校准曲线。

黄酮提取率的计算公式如下：

Y=Af/Ae，其中Y为箭叶淫羊藿中黄酮化合物的提取率（毫克/克），Af是从箭叶淫羊藿中提取的黄酮总量（毫克），和Ae是用于提取的叶粉末的总量（克）。

2.3.5微波辅助提取条件优化

为了开发从栽培箭叶淫羊藿中提取黄酮类化合物的最佳的微波辅助提取条件，对影响提取率的五个因素（包括液体对固体的比值，提取温度，浸泡时间，乙醇浓度和微波辐射时间）进行研究。

然后通过正交试验优化提取参数，通过验证试验进一步确认。

正交试验中每个因素的研究水平在单因素试验的基础上进行选择（表1）。

2.4高效液相色谱分析

不同提取方法所得箭叶淫羊藿中黄酮提取物的化学组分用高效液相色谱法进行分析（张等，2008）。

乙腈和1.0％（体积/体积）乙酸被用作流动相。

洗脱程序如下：

0-10分钟（20％乙腈），10-40分钟（20-25％乙腈），40-42分钟（25-50％乙腈），42分钟（50-20％乙腈）。

流速为1.0毫升/分钟和注入量（注入体积、进样量）是5微升。

UV检测器设定在270纳米波长处，柱温保持在25℃。

通过比较样品与标准品的保留时间和UV光谱来对黄酮提取物中朝藿定（淫羊藿定）A，B，C和淫羊藿苷的色谱峰进行鉴定，并通过与标准品的共注射来进一步证实。

2.5扫描电子显微图

通过不同提取方法（微波辅助提取，加热提取和搅拌床萃取）所得的叶粉-溶剂混合物于3250×g条件下离心10分钟，上清液弃用。

剩余的残留物（样本）被投入液氮，然后用冷刀（手术刀）切割（Gao等，2007）。

切片颗粒粘在样品夹（试样架）上，用薄金层溅射，并且通过扫描电子显微镜在真空和15千伏的加速电压下检查。

2.6抗氧化活性测定

2.6.1DPPH•自由基清除活性

根据Skandrani等人描述的具体方法（2010年），将各种体积（10/30/50/70/90/110微升）的黄酮提取液与0.008％（重量/体积）的DPPH混合在2毫升乙醇中，然后加入无水乙醇得到6ml终体积。

将所得的混合物剧烈振摇并在28◦下培养（温育）30分钟。

温育后，吸光度在517nm处用紫外-可见分光光度计测定。

抗氧化活性根据如下公式计算：

S（％）=（1-Am/A0）×100％，其中S（％）为DPPH•游离基清除活性，Am是样品（黄酮提取物，乙醇和DPPH溶液）的吸光度，A0是控制吸光率（乙醇和DPPH溶液的混合物）。

根据曹等（2013）所述，DPPH分析的结果被作为一定量黄酮提取物自由基清除活性的衡量指标。

2.6.2ABTS+•自由基清除活性

ABTS+•自由基清除活性的测定是基于Surveswaran等人（2007）的方法。

ABTS+•溶液的制备由7.4毫摩ABTS水溶液和2.6毫摩过硫酸钾溶液在室温下避光反应12-16小时。

反应后，ABTS+•溶液用无水乙醇稀释到734纳米吸光度为0.70±0.02。

为了衡量各种提取方法所得黄酮提取物的抗氧化能力，不同体积的黄酮提取物（10/30/50/70/90微升）