吴珊论文4.docx

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吴珊论文4

本科毕业论文

题目：

纤维素降解菌的分离

学院:

化学工程与技术学院

专业:

生物工程

学号:

200501153042

学生姓名:

吴珊

指导教师:

陈俊

日期:

2009年6月10日

摘要

纤维素是地球上最丰富的可再生有机资源，因为难分解大部分未被人类利用。

另外，纤维素是造纸废水的COD和SS的主要来源之一。

分解纤维素并将其转化成动物易吸收或利用的能源、食物、饲料或化工原料，是纤维素合理应用的重要途径。

筛选高效纤维素分解菌，确定其酶学性质是降解纤维素的关键。

本研究从不同环境的土壤中取样，先经过富集培养，然后用纤维素选择琼脂培养基分离菌种，再将单一菌落接种于复筛培养基上，经过刚果红染色，选取在平板上生长快、透明水解圈大的为纤维素降解菌。

将此菌株接入滤纸崩解培养基中，观察滤纸降解情况及溃烂速度，比较各株纤维素降解菌降解纤维素的能力。

将此菌株制成菌悬液后，接种于液体摇瓶培养基中，取样测定CMC酶活性、并测定滤纸酶活，筛选出酶活力及残余还原糖浓度高的菌株并研究其特性。

实验结果表明：

（1）实验所取的不同环境的土样中，均有纤维素降解菌的存在。

经过富集培养和初筛，分离活性较高的纤维素降解菌26株。

（2）经过刚果红染色鉴定，筛选到10株水解圈较大的纤维素降解菌。

（3）以选取的菌株做滤纸崩解实验，对滤纸均有不同程度的降解。

（4）以选取的菌株测定CMC酶活性，菌株c、E和1的CMC酶活相对较高。

（5）以选取的菌株测定滤纸酶活，菌株c与F的滤纸酶活相对较高。

从刚果红平板水解圈的大小、CMC酶活性和滤纸酶活三个指标判断，菌株c具有较高的纤维素酶活性。

这为下一步纤维素酶基因的克隆和基因工程菌的构建打下了基础。

关键词：

纤维素降解菌；刚果红染色；CMC酶活；滤纸酶活

Abstract

Celluloseisthemostabundantearthorganicrenewableresources,butmostofithasnotbeenusedbyusbecauseitisdifficulttobreakdown.Also,celluloseisoneofthemajorsourcesofpaper-makingwaste-waterCODandSS.Itisanimportantwaytomakeuseofcellulosethatcelluloseisdecomposedandtransformedintoenergy,food,feedorchemicalrawmaterialswhicharemoreeasilyabsorbedorusedbyanimal.Screeninghighactivitycellulose-decomposingbacteriaisthekeyfactortodegradecellulose.

Thisstudywasdisignedtosamplefromdifferentsoilunderkrauroticbranchesandputrescentleaves,separatethestrainbycelluloseagarselection,followbycongoredstainingsinglecolony.Single-coloniesoffast-growing,bigtransparenthydrolysiscirclewerechosenasthecellulosedegrationbacteria.Inoculatingthescreenedstrainsoncollapseofthemediumfilterpaperculturemedium,degradationextentandspeedoffilterpaperwasobservedandcompared.Preparingthescreenedbacteriasuspensionandinoculatinginliquidmedium,enzymeactivationofCMCandfilterpaperweremeasured.Highefficientstrainscouldbeselectedbytheresidualenzymeactivityandreducingsugarinhighconcentrationsofbacteria.

Theexperimentalresultshadshownthat：

（1）Cellulosedegrationbacterialiedindifferentsoilsampleusedinthisexperiment.Afterenrichmentculturingandscreening，26strainshadbeenisolated.

（2）Aftercongoredstaining,10strainswhichhadlargerhydrolyzedcirclehadbeenscreened.

（3）Inthefilterpaperdegradationtest,allthescreenedstrainscoulddegradethefilterpapertosomeextent.

（4）BymeasuringCMCenzymeactivity,strainsofc、Eand1hadhigheractivity.

（5）Bymeasuringfilterpaperenzymeactivity,strainsofcandFhigheractivity.

Fromallaboveanalysis,itcouldbeconcludedthatstrainschadhigheractivity.Thislayedafoundforcelluloseenzymegenecloningandgeneengineeringbacteriaconstrction.

Keywords:

Cellulosedegradation;Congoredstaining;CMCenzymaticactivaty;Filterpaperactivity.

目录

前言1

1文献综述2

1.1筛选纤维素降解菌的意义2

1.2纤维素的微生物分解过程2

1.3产纤维素的各类微生物及其产酶特点3

1.3.1真菌类3

1.3.2细菌类4

1.3.3放线菌4

1.3.4低等动物和个别高等动物4

1.4纤维素分解微生物的生活条件5

1.5菌种的筛选5

1.5.1菌种筛选的原理6

1.5.2菌种筛选流程6

1.6纤维素酶高产菌选育研究进展及发展趋势6

1.6.1纤维素酶高产菌选育研究的发展概况6

1.6.2纤维素酶高产菌选育研究中殛待解决的问题7

1.6.3纤维素酶高产菌选育研究的未来发展趋势9

1.7本论文的主要研究内容11

2材料与方法12

2.1实验材料12

2.1.1实验材料12

2.1.2培养基12

2.1.3主要试剂13

2.1.4仪器设备14

2.2实验方法14

2.2.1富集培养14

2.2.2梯度稀释14

2.2.3纯化15

2.2.4目的菌的鉴别15

2.2.5酶活力的测定15

2.2.5.1滤纸条崩解实验15

2.2.5.2CMC酶活力的测定15

3结果与讨论17

3.1富集培养的利弊17

3.2刚果红染色结果17

3.3滤纸溃烂状况18

3.4酶活力测定19

3.4.1标准曲线的绘制19

3.4.2CMC酶活力测定20

3.4.3滤纸酶活（FPA）的测定21

3.5实验问题探讨21

4结论23

参考文献24

致谢26

前言

纤维素是地球上最丰富的可再生有机资源，是葡萄糖以β-1,4糖苷键结合形成的高分子化合物，包括葡萄糖单位2000~10000个，很难分解。

据报到，全世界每年通过光合作用产生的纤维素高达1.55×109吨，其中有89%尚未被人类利用。

中国每年仅农业生产中形成的农作物残渣（稻草、秸秆等）就约有7亿吨，工业生产中还有数百万吨的纤维素废弃物，另外，纤维素是造纸废水的COD和SS的主要来源之一，造纸废水中含有大量的纤维素，造纸黑液难以处理，严重污染水环境。

因此有效的开发利用纤维素资源已是目前的一个研究热点。

分解纤维素并将其转化成动物易吸收或利用的能源、食物、饲料或化工原料，是纤维素合理应用的重要途径。

纤维素的分解主要依靠微生物产生的胞外酶完成。

尽管人类对纤维素酶的认识已经经过了一个多世纪，对于相关酶结构的研究也比较深入，然而，由于优良微生物是分解或转化纤维素的关键，致使产纤维素酶的微生物分离、筛选及产酶条件的优化一直都是相关研究领域的热点。

筛选高效纤维素分解菌，确定其酶学性质是降解纤维素的关键。

能够降解纤维素的微生物有很多，可是目前的研究却大多集中在有限的几个菌株上，如康宁木霉、里氏木霉等。

然而这些菌株仍然存在着产酶成本高,酶活性不稳定，作用pH范围狭窄等问题。

因此寻找更多、更高效、作用范围更广泛的新菌种是十分必要的。

本研究拟从枯枝败叶下的土壤中取样，先经过富集培养，然后用纤维素选择琼脂培养基分离菌种，再将单一菌落接种于复筛培养基上，经过刚果红染色，挑选出在平板上生长快、透明水解圈大的单菌落,把筛选菌接入滤纸崩解培养基中，观察滤纸降解情况，比较滤纸的溃烂速度。

将筛选到的单菌落制成菌悬液后，接种于液体摇瓶培养基中，取样测CMC酶活性大小及滤纸酶活，以期筛选出酶活力及残余还原糖浓度高的菌种并研究其特性。

1文献综述

1.1筛选纤维素降解菌的意义

纤维素是地球上最丰富、来源最广泛的碳水化合物，同时也是地球上最大的可再生资源，占地球生物量的约50%[1]。

纤维素绝大多数由绿色植物通过光合作用合成，是植物体内结构多糖，植物的枝叶和秸杆等都含有大量的纤维素。

纤维素是葡萄糖以β-1,4糖苷键结合形成的高分子化合物，包括葡萄糖单位2000~10000个[2]。

天然的纤维素由排列整齐而规则的结晶区和相对不规则、松散的无定形区构成。

在植物细胞壁中，纤维素分子聚集成纤维丝，包埋在半纤维素和木质素里，形成网状结构。

纤维素分子本身的致密结构以及由木质素和半纤维素形成的保护层造成纤维素不容易降解而难以被充分利用或被大多数微生物直接作为碳源物质而转化利用。

据报到，全世界每年通过光合作用产生的纤维素高达1.55×109吨，其中有89%尚未被人类利用。

中国每年仅农业生产中形成的农作物残渣（稻草、秸秆等）就约有7亿吨,工业生产中还有数百万吨的纤维素废弃物,但都没有得到充分利用,相当大的一部分被废弃、焚烧,不仅严重污染环境，同时也浪费了可利用的有用资源和能源。

另外，纤维素是造纸废水的COD和SS的主要来源之一，造纸废水中含有大量的纤维素，造纸黑液难以处理，严重污染水环境[2]。

因此有效的开发利用纤维素资源已是目前的一个研究热点，分解纤维素并将其转化成动物易吸收或利用的能源、食物、饲料或化工原料，是纤维素合理应用的重要途径[1]。

目前纤维素降解主要是酸解、酶解和微生物降解，无论是酶解还是微生物降解都离不开高效纤维素降解菌株。

微生物对纤维素的降解与转化不仅是自然界中碳素转化的主要环节，也是土壤微生物能量代谢的主要来源。

纤维素的分解主要依靠微生物产生的胞外酶完成，纤维素酶是水解纤维素生成纤维二糖及葡萄糖的一类酶的总称[3]。

尽管人类对纤维素酶的认识已经经过了一个多世纪，对于相关酶结构的研究也比较深入，然而，由于优良微生物是分解或转化纤维素的关键，致使产纤维素酶的微生物分离、筛选及产酶条件的优化一直都是相关研究领域的热点。

1.2纤维素的微生物分解过程

纤维素是植物细胞壁的主要成分，约占植物总重量的一半，是自然界最丰富的有机化合物。

与淀粉一样，纤维素也由葡萄糖单元聚合而成。

两者的区别在于淀粉以-糖苷键连接，而纤维素则以β-糖苷键连接。

此外，纤维素分子比淀粉大，更难溶于水。

纤维素不能直接透过细胞质膜，只有在微生物合成的纤维素酶作用下，水解成单糖后，才能被吸收至细胞内利用。

纤维素酶有细胞表面酶和胞外酶两种。

细菌纤维素酶一般为细胞表面酶，位于细胞膜上，分解纤维素时，细菌必须附着在纤维素表面。

真菌和放线菌的纤维素酶为胞外酶，它们可以在胞外环境中起作用，菌体无需直接与纤维素表面接触。

根据对真菌的研究，纤维素酶是多种作用于纤维素的酶的总称，它包括如下三种酶：

①C1酶（内-β-葡聚糖酶）：

此酶主要水解纤维素分子内的β-糖苷键，产生带有自由末端的长链片段。

一种微生物能分泌一种以上的C1同功酶。

②CX酶（外-β-葡聚糖酶）：

此酶作用于纤维素分子的末端，产生纤维二糖。

与C1酶一样，一种微生物也能分泌出多种结构不同而功能相同的CX酶。

③β-葡萄糖苷酶：

此酶能将纤维二糖、纤维三糖及低分子量的寡糖水解成葡萄糖。

1.3产纤维素的各类微生物及其产酶特点

1.3.1真菌类

常见的可降解纤维素的真菌有多种。

其中，对纤维素分解作用较强的多是木霉属（Thchoderna）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）,Pellien-lalia属和枝顶孢霉属（Acremonium）的菌株[4]。

目前国内外研究较多的纤维素酶产生菌是木霉属、曲霉属、青霉属、根霉属、漆斑霉属等丝状真菌，这些微生物能产生大量的纤维素酶。

已先后选育出了一些产纤维素酶的优良菌种，多数是真菌中的木霉属和曲霉属菌株，还有一些细菌菌株。

目前主要还是利用真菌来发酵产纤维素酶，世界纤维素酶市场中的纤维素酶有20%是来自木霉属和曲霉属。

国内外对木霉属和曲霉属进行了比较透彻的研究，尤其是木霉属真菌。

木霉属被公认是产纤维素酶最高的菌种之一，是当前生产上应用较多的菌种，也是目前国内外研究最广泛的纤维素酶产生菌，在学术研究中引起广泛关注。

木霉分泌的纤维素酶是胞外酶，所以分离纯化比较容易，而且木霉具有培养粗放，适应性强的特点，适于固体培养和液态深层发酵，从而可以大规模应用于生产。

其中里氏木霉（Trichodermareesei）因其纤维素酶产量较高，易于培养和控制、产纤维素酶稳定性好、培养及代谢产物安全无毒等优良特点，成为生产纤维素酶典型菌种。

另外，绿色木霉（Thchodermaviride）和黑曲霉（Aspe-rgillusniger）被公认是产纤维素酶最稳定和无毒安全的菌种。

康氏木霉（Trichode-rmakoningii）、拟康氏木霉（Trichodermapseudokoningii）也是目前较好的纤维素酶生产菌。

迄今为止，研究表明：

木霉属虽有产酶量大，酶系组分比较齐全等优点，但它们不能利用木质素，其纤维素酶比活力较低，β-葡萄糖苷酶的比例偏低，其活性也较小，从而影响了纤维素酶活，并且生产较缓慢，这些因素在一定程度上限制了木霉大规模生产应用。

进一步筛选纤维索酶高产菌株显得尤为迫切。

1.3.2细菌类

通常把降解纤维素的细菌分为三大类：

第一类是厌氧纤维素降解细菌：

主要包括中温性细菌、嗜热厌氧细菌、瘤胃纤维素降解细菌。

嗜热厌氧纤维素降解细菌包括两种：

一种是属于芽孢梭菌属（Clostridium）和高温厌氧杆菌属（Thermoanae-robacter），包括热纤梭菌、嗜热堆肥梭菌、产黄纤维素梭菌、月素氏梭菌、嗜热溶纸梭菌、嗜纤维梭菌、热粪生热厌氧杆菌即热粪生梭菌。

另一种是属于热解纤维素菌属（Caldicellulosiruptor），包括解糖热解纤维素菌、产乳酸乙酸热解纤维素菌、克氏热解纤维素梭菌。

第二类是好氧性纤维素降解细菌：

有食纤维菌属、生孢食纤维菌属、粘细菌类中的粘球菌属、堆囊粘菌属。

纤维单胞菌属中一些菌种如产黄纤维单胞菌、强壮纤维单胞菌、黄单胞菌，及镰状纤维菌属、纤维弧菌属，也包括一些无芽孢杆菌、芽孢杆菌和梭菌。

第三类是嗜碱性纤维素降解细菌：

主要是芽孢杆菌（Bacillus）的一些菌株。

芽孢杆菌科的细菌中，能产纤维素酶的以芽孢杆菌属的细菌最多，梭状芽孢杆菌属的四个群中，仅群二的少数细菌产纤维素酶。

产纤维素酶的细菌类，目前研究较多的是纤维粘菌属、生孢纤维粘菌属、纤维杆菌和芽孢杆菌属，代表菌种有热纤梭菌（Clostridiumthermocellum），嗜酸纤维分解菌（Acidathermuscelluloluticus）,粪碱纤维单胞菌（Cellulomonasfimi），荧光假单胞菌纤维素亚种（Pseudomonasfluorescenssubsp）、褐色热单孢菌（Thermomo-nosporafusca）等。

细菌产生纤维素酶的量较少，在所产纤维素酶系的三种组分：

葡聚糖内切酶（简称为Cen）、葡聚糖外切酶（简称为Cex）,β-葡萄糖苷酶（简称为BG）中主要是葡聚糖内切酶，一般不分泌到胞外，而是处于细胞壁“固定化”的状态，可在细胞壁上形成一种突起物。

细菌纤维素酶多数结合在细胞膜上，菌体细胞需吸附在纤维素上才能起作用，使用很不方便，酶的分离提取也较困难。

尽管许多纤维素降解细菌，特别是厌氧菌，如热纤梭菌（Clostridiumthermocellum）和溶纤维素拟杆菌（Bacteroidescellulosolvens）产生的纤维素酶的比活力较高，但总产酶活力并不高。

由于厌氧细菌生长速率非常低，并要求厌氧生长条件，就应用而言，纤维素酶的许多生产和研究就集中在真菌上。

细菌主要产生中性纤维素酶和碱性纤维素酶，碱性纤维素酶产生菌主要集中在芽孢杆菌属。

目前中性纤维素酶和碱性纤维素酶在纺织工业、洗涤剂工业中有良好的应用性能和巨大的经济价值，因而备受青睐。

对这类细菌纤维素酶高产菌株的筛选是目前的研究热点。

另外，筛选耐高温、耐低温的细菌纤维素酶高产菌也正在开发应用中。

近年来所选育出的纤维素酶高产菌中有些细菌菌株不但CMC酶活较高，而且所产纤维素酶是胞外酶。

随着研究的逐步深人，对细菌纤维素酶高产菌株的选育研究将越来越受到重视。

1.3.3放线菌

放线菌是介于细菌和真菌之间的一类原核微生物。

在自然界分布很广，绝大多数为异养型需氧菌，大多数为腐生，少数寄生，产生种类繁多的抗生素，生长最适温度为28～32℃，大多数为不致病的腐生菌。

有的种类可在高温下分解纤维素等复杂的有机质。

常见的可降解纤维素的放线菌有以下种类：

链霉菌（Streptomyces），高温放线菌属（Thermoactinomycete）和弯曲热单孢菌（Thermomonosponacurvata）等[4]。

目前研究较多的是真菌和细菌，对放线菌研究得较少。

因细菌产生的纤维素酶较少，主要为内切酶，多数不能分泌到细菌细胞外，所以工业上很少采用细菌作为酶的生产菌种。

而真菌中的霉菌其致病菌较多，其孢子易传播和感染等，此类原因限制了细菌和霉菌的进一步开发应用。

放线菌产生的纤维素酶活性较高，且结构简单，为单细胞，便于遗传分析，许多研究者现在逐渐开始重视对放线菌的选育研究。

国内有文献报道选育出的纤维索酶高产菌株中有一些是放线菌菌株，其CMC酶活和滤纸酶活都较高，具有进一步研究开发应用的价值。

1.3.4低等动物和个别高等动物

细菌和真菌中都存在有复杂的纤维素酶水解系统，虽然其水解微晶纤维素的能力非常强，但由于其复合物的分子量十分巨大，并且单个组份又不具有水解微晶纤维素的能力，所以人们一直试图从其他物种中寻找更符合工业应用以及更具有应用前景的纤维素酶。

1963年，Marshall等在蜗牛（Helixpomatia）无菌的肝胰腺中检测到了纤维素酶和几丁质酶活性，而且还发现其消化液中的纤维素酶和几丁质酶的活性与消化液中菌体的含量无关。

此外，陆续研究结果表明，高等动物体内很可能存在内源性的纤维素酶。

自1998年以来，人们在多种动物体内得到的内源性纤维素酶大都属于内切-β-1，4-葡聚糖酶。

日本一家实验室从甲虫中得到一种葡聚糖内切酶，水解羧甲基纤维素钠的比活力可高达150IU/MG；国内有文献报道从福寿螺（Ampullariacrossean）的胃液中纯化得到了一种多功能纤维素酶（命名为EGX），它不仅具有很高的比活力，而且具有多种酶的活性，这是迄今为止在动物中发现的第一个具有潜在应用价值的多功能纤维素酶。

从线虫、白蚁、鲍鱼、贻贝、甲虫、福寿螺等动物中克隆出的纤维素酶基因，也进一步证实了内源性动物纤维素酶的存在。

这些结果提示动物纤维素酶不但具有应用前景，还具有理论研究意义。

1.4纤维素分解微生物的生活条件

各种好氧性纤维素分解细菌对纤维素有不同程度的专一性。

食纤维菌和生孢食纤维菌对纤维素的专一性较强，只能利用纤维素及其水解产物（纤维二糖）作为碳源和能源。

多囊菌和纤维弧菌等对纤维素的专一性较弱，不仅能利用纤维素及其水解产物，而且也能利用各种单糖、双糖和淀粉等作为碳源和能源。

好氧性纤维素分解细菌能利用硝酸盐、氨盐、天冬酰胺及蛋白胨等，其中以硝酸盐最佳，但对氮源的要求不严。

在10～15℃的条件下，好氧性纤维素分解细菌即可良好生长，最适温度为22～30℃，最适pH值为7～7.5。

厌氧性纤维素分解细菌对碳源也有不同程度的专一性，且只能利用复杂的含氮有机物作为氮源。

后一现象可能与其生长需要某些维生素有关。

厌氧性纤维素分解细菌有嗜热性和中温性厌氧纤维素分解细菌两类。

适宜在中性至碱性的环境中生活，对碱性条件的适应能力较强。

不同土壤中的纤维素分解菌活性有明显差异。

不同土壤特别是土壤有机质对纤维分解菌进行长期选择以及微生物对土壤条件定向适应，土壤纤维分解菌的种类和数量具有相对稳定性。

因此，可用来指示土壤有机质的含量及其分解强度和土壤熟化程度。

1.5菌种的筛选

1.5.1菌种筛选的原理

富集：

利用CMC-Na为唯一碳源富集纤维素降解菌。

初筛：

根据刚果红透明圈直径大小与菌落直径的比值和该酶活成正比的原理进行初筛。

复筛：

纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3，5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力[3]。

1.5.2菌种筛选流程

采样→富集培养（富集培养基）→纯化（纯化培养基）→初筛→发酵产酶→复筛（DNS测酶活）

采集土样后用无菌水溶解，取悬浮液加入富集培养基中培养。

富集后将菌液涂布于纯化培养基，待菌落长出后用划线法分离单菌落。

将各单菌落接种到培养基上，用刚果红染色观察水解圈大小进行初筛。

将菌接种到发酵培养基中发酵产酶，用DNS法测酶活复筛，再用滤纸测FPA。

1.6纤维素酶高产菌选育研究进展及发展趋势

1.6.1纤维素酶高产菌选育研究的发展概况

1906年，Seilliere在蜗牛消化液中发现有纤维素酶，能分解天然纤维素。

1912年，Kellerma等首次从土壤中分离出纤维素分解菌，此后，能降解纤维素和能产生纤维素酶的各种微生物被陆续分离鉴定。

1933年，Grassman等研究了一