钱迪纳米二氧化钛对多重耐药质粒RP4接合转移的影响研究.docx

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钱迪纳米二氧化钛对多重耐药质粒RP4接合转移的影响研究

D2*******3

密级：

纳米二氧化钛对多重耐药质粒RP4接合转移的影响研究

Effectofnano-TiO2ontheconjugativetransferoftheRP4plasmid

姓名

钱迪

学科专业

生物化学与分子生物学

研究方向

基因工程与酶工程

指导教师

张部昌教授

完成时间

2013年4月

独创性声明

本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得　　　　　或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

学位论文作者签名：

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　　　　年　　月　　日

学位论文版权使用授权书

本学位论文作者完全了解　　　　　　有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。

本人授权　　　　可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。

（保密的学位论文在解密后适用本授权书）

学位论文作者签名：

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摘要

随着广谱抗生素的过度使用而引发的抗生素耐药问题日趋严重，世界卫生组织（WHO）已将抗生素抗性基因（ARGs）作为21世纪威胁人类健康的重大挑战之一。

细菌产生抗生素抗性基因的原因之一是由于过度使用和滥用抗生素导致细菌产生抗生素抗性突变；另一主要原因是细菌通过水平转移的方式（转化、转导和接合）获得抗生素抗性基因。

其中接合是环境中最常见、最有效的水平转移方式，是借助质粒并通过细胞与细胞接触发生DNA的转移。

细菌抗生素抗性基因往往编码在可移动质粒上，通过质粒接合转移在细菌间进行传播。

接合转移受许多环境因素的影响，而环境水体是细菌发生耐药基因水平转移的重要场所。

由于纳米TiO2具有比表面积大，光催化活性高，化学性质稳定等特点，因而成为优良的光催化材料，并被广泛用于空气净化、污水处理和消毒杀菌等方面。

然而，纳米TiO2在环境中的残留对环境、生物以及人体的负面影响正在引起人们重视。

大量研究表明，纳米TiO2可产生大量活性氧，破坏细菌细胞膜，影响蛋白质和基因，载带DNA或RNA分子进入动物和植物细胞。

现在，水环境中存在着大量耐药菌和纳米TiO2，纳米TiO2是否影响耐药基因在细菌间传播还不清楚。

本研究基于以上事实提出，水中纳米TiO2可作用于细菌细胞膜和/或调控基因表达，促进细菌耐药基因接合转移的假说，并建立质粒介导的接合转移模型，研究水中纳米TiO2对细菌耐药基因接合转移的影响及规律，分析纳米TiO2作用过程中各种因素的影响规律，从细胞生物学、生物化学、分子生物学角度探讨了纳米TiO2促进细菌耐药基因接合转移机制。

主要研究结果如下：

研究结果表明，纳米TiO2可以显著地促进RP4接合转移，而且随着纳米TiO2浓度的升高，这种促进作用先逐渐增强再减弱。

在0.5mmol/L纳米TiO2干预下，接合4h后接合转移频率上升约100倍，1mmol/L干预组产生的接合转移频率最高，是空白对照组的150倍左右，随后开始下降。

纳米TiO2的作用效果随浓度的变化有峰值出现，可能原因是纳米TiO2在对RP4接合转移有促进作用的同时，能够使细胞产生严重的氧化应激反应，对细菌细胞产生毒性，造成细菌死亡。

纳米TiO2促进RP4接合转移的作用随着初始菌密度的升高而增强。

随着接合时间的延长，纳米TiO2对RP4接合转移的促进作用先升高再下降，其中1mmol/L纳米TiO2干预下，24h时接合转移频率达到最大值，为空白对照的1500倍，随后开始下降。

而且随着温度的提高，相同浓度处理组的接合转移频率也逐渐升高，即温度越高接合转移频率越高，但高于15℃后差异不太明显。

在水体中pH值对纳米TiO2促RP4接合转移没有显著影响。

机制研究发现：

透射电镜结果表明，纳米TiO2对细菌细胞膜产生影响，细胞膜表面变得不光滑，部分细胞膜发生溶解。

纳米TiO2浓度越高对细菌细胞膜影响越严重。

大颗粒TiO2却无类似的结果，说明纳米TiO2的纳米结构是产生细胞膜损伤的主要因素。

纳米TiO2对细菌细胞膜的影响为供、受体菌的细胞膜融合和DNA跨膜转运创造了便利条件。

纳米TiO2通过抑制korA和korB的mRNA表达，激活了trbBp基因的mRNA表达，进而促使供、受体菌间形成“接合桥”，促进了接合转移的第一个过程。

电镜结果也证实纳米TiO2使形成的“接合桥”数量增加。

同时纳米TiO2通过抑制korB和trbA的mRNA的表达，激活了trfAp基因的mRNA表达，促使RP4质粒的转移与复制，促进了接合转移的第二个过程。

总的来说，纳米TiO2能通过影响细菌细胞膜状态，影响接合转移过程相关的调控基因mRNA表达而促进了接合质粒的接合转移的发生。

本研究工作发现纳米TiO2具有促进水环境中耐药质粒接合转移的现象，并且初步探讨了其机理，提出了纳米TiO2可能会促进细菌耐药性在水环境中的传播，危害水环境安全，并有可能危害人类健康。

该研究丰富了纳米材料的生态风险理论，为纳米材料的污染防护理论提供了理论依据。

关键词：

纳米TiO2；细菌耐药性；接合质粒；接合转移

ABSTRACT

Theincreasingproblemofantibioticresistancecausedbytheexcessiveuseofbroad-spectrumantibiotics,theWorldHealthOrganization（WHO）hasantibioticresistancegene（ARGs）asoneofthemajorchallengesofthe21stcenturythreattohumanhealth.Oneofthecausesofbacterialantibioticresistancegenestobacteriaasaresultofantibioticresistancemutationsduetooveruseandmisuseofantibiotics;Anothermainreasonisbacteriathroughhorizontaltransfer（transformation,transductionandconjugation）antibioticresistancegenes.Conjugationbyself-transferableplasmidsmediatehorizontalgenetransferbetweenbacteriamaybethemostcommonandeffective.Bacterialantibioticresistancegenesareoftenencodedinthemobileplasmid,byplasmidconjugaltransferspreadinbacteria.Affectedbymanyenvironmentalfactors,andenvironmentalwaterisanimportantplaceforbacteriaresistanthorizontalgenetransfer.

Nano-TiO2hasalargespecificsurfacearea,highphotocatalyticactivity,chemicallystable,andthusbecomeanexcellentphotocatalyticmaterial,andiswidelyusedinairpurification,sewagetreatmentanddisinfection.However,Theiruseinwatertreatmentmayresultinaconsiderableamountofnano-TiO2residueinthewater,andcausenegativeimpactontheenvironment,biologicalandhumanbody.Numerousstudieshaveindicatedthatnano-TiO2canproducelargeamountsofreactiveoxygenspecies（ROS）todestructbacterialmembrane,canaffectproteinandgene,andcandeliverDNAorRNAmoleculesintoanimalorplantcells.Recently,therearealargenumberofresistantbacteriaandnano-TiO2inwaterenvironment.nano-TiO2promotedthespreadofresistancegenesbetweenbacteriaisstillunclear.

Basedontheabovefacts,wehypothesisedthatnano-TiO2thatarepresentinwatermaypromotethehorizontaltransferofmultidrug-resistancegenesbyactingoncellmembranesand/orregulatinggenesinvolvedinplasmidtransfer.Andonbasisoftheconstructionoftheconjugativetransfermodelsmediatedbyplasmids,westudiedtheeffectofnano-TiO2inwaterenvironmentontheconjugativetransfer,andanalyzedtheeffectofvariousfactorsonconjugativetransferundernano-TiO2induced,andexploredthemechanismsbywhichnano-TiO2promotethehorizontaltransferofantibioticmultiresistancefeaturesbymorphological,biochemical,andmolecularbiologicalmethods.

Themainfindingsareasfollows:

Theresultsshowthatnano-TiO2cansignificantlypromotetheRP4conjugativetransfer,andwiththeincreaseofnano-TiO2concentration,thisroleisfirstgraduallyincreasedandthenweakened.0.5mmol/Lnano-TiO2intervention,afterconjugativing4htransferfrequencyincreasedbyabout100times,1mmol/Lnano-TiO2interventiongroupgeneratedthehighestfrequency，whichisabout150timesgreaterthanthecontrolgroup,andthenbegantodecline.Theeffectofnano-TiO2withthechangesintheconcentrationofthepeakmaybeduetonano-TiO2inwaterincreasedtheconjugativetransferofresistancegenesinvolvethedamageofbacterialmembranesbyoxidativestress,totoxicbacterialcells,killedbacteria.ThenanoTiO2promoteRP4conjugativetransfertheroleofenhancedastheinitialbacterialdensityincreases.TiO2nanoparticlesonRP4conjugativetransferroleinpromotingfirstincreasedandthendecreasedwithtime.1mmol/LnanoTiO2intervention,24hwhenconjugativetransferfrequencyreachingitsmaximumvalue,is1500-foldthanblank,thenbegantodecline.Asthetemperatureincreases,thefrequencyofconjugativetransferofthetreatedgroupofthesameconcentrationarealsograduallyincreased,andthehigherthetemperatureofconjugationthehigherthefrequencywillbetransferred,buthigherthan15°Cdifferenceislesspronounced.nano-TiO2promotingRP4conjugativetransferpHvalueinthewaterhadnosignificanteffect.

     Wealsoexploredthepotentialmechanismsofnano-aluminainpromotingconjugativetransferofRP4.TEMresultsshowedthatthenano-TiO2haveanimpactonthebacterialcellmembrane,themembranesurfaceisnotsmooth,dissolvedinthepartofthecellmembrane.Thecytoplasmofthebacteriaagglomerated,andthepartsofthecellmembraneswereundefined,andthecellmembranesdisplayedwrinklesandfissureswhennano-TiO2induced.Thehighertheconcentrationofnano-TiO2isthemoreseriousimpactonthebacterialcellmembrane.LargeparticlesofTiO2butnosimilarresults,indicatingthatthenano-TiO2nano-structureisthemainfactortoproducemembranedamage.Nano-TiO2canenhancetheconjugationefficiencythroughtheregulationofconjugativegeneexpression.Weobservedthatnano-TiO2significantlypromotedbacteriaconjugation.ThisphenomenonresultsfromthepromotionofRP4conjugationgeneexpressionbynano-TiO2.ThetrbBpexpressionwasenhancedaftertreatmentwithnano-TiO2,whichledtotheformationofmoreconjugants.Inaddition,nano-TiO2couldpromotetheexpressionoftrfAp,whichisagenethatplaysanimportantroleinthetransferandreplicationofRP4.nano-TiO2maypromotethehorizontaltransferbyrepressingtheexpressionofglobalregulatorygenesthatareinvolvedinRP4conjugation.WefoundinthisstudythatkorA,korBandtrbAmRNAexpressionwererepressedsignificantlybynano-TiO2.TheseresultsmeanthattrfAandtrbBareactivatedandincreasethisexpression,whichprovidesthesequentialstepsthatenhancetheefficiencyoftransfer.

Overall,thenano-TiO2canaffectthestateofthebacterialcellmembrane,affecttheregulationofconjugativetransferprocessmRNAexpressionandpromoteconjugativeplasmidconjugaltransfer.

    Thisworkwasfirstproposednano-TiO2promotethephenomenonofresistanceplasmidconjugaltransferinthewaterenvironment,andexploreitsmechanism,nano-TiO2maypromotethespreadofbacterialresistanceinthewaterenvironment,endangeringthesafetyofthewaterenvironment,andmaybehazardoustohumanhealth.Thestudyenrichestheecologicalrisktheoryofofnanomaterials，providesatheoreticalbasisfornanomaterialspollutionpreventiontheory.

Keywords:

Nano-titaniumdioxide;drugresistance;conjugativeplasmid;conjugativetransfer

目录

摘要I

ABSTRACTIII

目录VI

缩略词表VIII

第1章前言1

1细菌耐药性问题1

1.1细菌耐药性的产生及危害1

1.2细菌的耐药性的生物化学机制1

1.3细菌获得耐药性的方式2

1.4质粒的接合转移过程3

1.5水环境中抗生素、耐药菌和耐药基因3

2纳米TiO2的性能及生物安全性研究进展5

2.1纳米TiO2的性能5

2.2纳米TiO2的结构和分类6

2.3纳米TiO2的应用7

2.4纳米TiO2在水环境中的残留9

2.5纳米TiO2安全性问题10

3课题的提出12

4研究的目的和意义13

4.1研究目的13

4.2研究意义13

第2章：

纳米TiO2影响多重耐药质粒RP4接合转移的规律14

1前言14

2材料与方法14

2.1质粒与菌株14

2.2主要试剂、培养基及溶液配制15

2.3细菌的培养和接合转移实验16

2.4单因素影响的接合实验17

2.5接合子和受体菌数目的筛选18

2.6接合子的确认18

2.7接合转移频率的计算19

3结果19

3.1接合子确证的结果19

3.2各种单因素条件对RP4接合转移影响的结果21

4讨论25

第3章：

纳米TiO2促进多重耐药质粒RP4接合转移的机制26

1引言26

2材料与方法27

2.1实验材料27

2.2菌株的培养和处理28

2.3纳米与大颗粒TiO2对接合实验的干预28

2.4透射电镜样品制备与观察29

2.5接合调控基因与整体调控基因的mRNA表达水平测定29

2.8结构统计分析33

3结果33

3.1纳米TiO2对细菌细胞膜的影响33

3.2纳米TiO2对细菌接合的影响34

3.3纳米TiO2对接合转移调控基因和整体调控基因的影响36

4讨论38

结论40

参考文献41

致谢48

硕士期间发表论文目录49

缩略词表

Abbrivations

英文缩词

英文全称

中文全称

Km

kanamycin

卡那霉素

Amp

ampicillin

氨苄青霉素

TC

apramycin

四环素

Mpf

Matingpairformation

配接对形成

Dtr

DNAtransferandreplication

DNA转移复制

Rif

rifampicin

利福平

bp

basepair（s）

碱基对

OD

opticaldensity

光密度

PCR

PolymeraseChainReaction

聚合酶链式反应

ddH2O

doubledistilledwater