单克隆抗体制备作业流程.docx

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单克隆抗体制备作业流程

单抗制备步骤

1975年，Kohler和Milstein发觉将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞进行融合，形成杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创建了单克隆抗体杂交瘤技术。

这一技术上突破不仅为医学和生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病诊、防、治提供了新工具。

　　制备单克隆抗体包含动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞克隆化、冻存和单克隆抗体大量生产，要经过多个月一系列试验步骤，下面根据制备单克隆抗体步骤次序，逐一介绍其试验方法。

一、细胞融合前准备

（一）　免疫方案

　　选择适宜免疫方案对于细胞融合杂交成功，取得高质量McAb至关关键。

通常要在融合前两个月左右确立免疫方案开始首次免疫，免疫方案应依据抗原特征不一样而定。

　　1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可取得很好免疫效果。

下面以细胞性抗原为例免疫方案:

　　　　　　　　　　首次免疫　　　　　　1×10７／0.5mlip（腹腔内注射）

　　　　　　　　　　　　↓　2～3周后

　　　　　　　　　　第二次免疫　　　　　1×10７／0.5mlip

　　　　　　　　　　　　↓　3周后

　　　　　　加强免疫（融合前三天）　1×10７／0.5mlip或iv（静脉内注射）

　　　　　　　　　　　　↓

　　　　　　　　　　取脾融合

　　2.可溶性抗原免疫原性弱，通常要加佐剂，常见佐剂：

福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。

要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水乳糜状，放一滴在水面上不易立即扩散呈小滴状表明已达成油包水状态。

商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀分枝杆菌充足混匀。

　　　　　　首次免疫　Ag　1～50μg　加福氏完全佐剂皮下多点注射

　　　　　　　　│　　（通常0.8～1ml　0.2ml／点）

　　　　　　　　↓3周后

　　　　　　第二次免疫　剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

　　　　　　　　│　　　　　　　（ip剂量不宜超出0.5ml）

　　　　　　　　↓3周后

　　　　　　　第三次免疫　剂量同上，不加佐剂，ip

　　　　　　　　│（5～7天后采血测其效价，检测免疫效果）

　　　　　　　　↓2～3周后

　　　　　　加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv

　　　　　　　　↓3天后

　　　　　　　取脾融合

　　现在，用于可溶性抗原（尤其是部分弱抗原）免疫方案也不停有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，首先增强了抗原免疫原性，其次可降低抗原使用量。

②改变抗原注入路径，基础免疫可直接采取脾内注射。

③使用细胞因子作为佐剂，提升机体免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

（二）　喂养细胞

　　在制备单克隆抗体过程中，很多步骤需要加喂养细胞，如：

在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入喂养细胞是十分必需。

常见喂养细胞有：

小鼠腹腔巨噬细胞（较为常见）、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有些人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为喂养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长久保留，随用随复苏。

　　　　　小鼠腹腔巨噬细胞制备

　　　　　小鼠采取和免疫小鼠相同品系，常见BaLb／c小鼠6～10周龄

　　　　　　↓

　　　　　拉颈处死　浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟

　　　　　　↓

　　　　　用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

　　　　　　↓

　　　　　用无菌注射器注入6～8ml培养液

　　　　　　↓

　　　　　反复冲洗，吸出冲洗液

　　　　　　↓

　　　　　放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟

　　　　　　↓

　　　　　用20％小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）培养液混悬，调整细胞数1×10５／ml

　　　　　　↓

　　　　　加入96孔板，100μl／孔

　　　　　　↓

　　　　　放入37℃　CO2孵箱培养

　　通常喂养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可取得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为喂养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠成纤维细胞（3T3）1×105／ml，均为100μl／孔。

（三）　骨髓瘤细胞

　　骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这么杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量　McAb。

　　常见骨髓瘤细胞系有：

NS1、SP2／0、X63Ag8.653等。

　　骨髓瘤细胞培养适合于通常培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。

小牛血清浓度通常在10～20％，细胞最大密度不得超10６／ml，通常扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。

细胞倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。

　　通常在准备融合前两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT敏感性，每3～6月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以预防细胞突变。

　　确保骨髓瘤细胞处于对数生长久，良好形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合关键。

（四）　免疫脾细胞

　　免疫脾细胞指是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。

通常取最终一次加强免疫3天以后脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞百分比较大，融合成功率较高。

　　脾细胞悬液制备：

在无菌条件下取出脾脏，用不完全培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。

通常免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积２倍，细胞数为２×10８左右。

二、细胞融合，选择杂交瘤

（一）　细胞融合步骤

（1）　取对数生长骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

（2）　同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

　　（3）　将骨髓瘤细胞和脾细胞按1∶10或1∶5百分比混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

　　（4）　弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG浓度。

　　（5）　轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

　　（6）　在室温下融合:

　　①　30秒内加入预热1ml45％PEG（Merek,分子量4000）含5％DMSO，边加边搅拌。

　　②　作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

　　③　加预热不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

　　（7）　离心，800rpm，6分钟。

　　（8）　弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起细胞散开。

　　（9）　依据所用96孔培养板数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

　　（10）将融合后细胞悬液加入含有喂养细胞96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。

　　通常一块96孔板含有1×107脾细胞。

（二）　HAT选择杂交瘤

　　应用HAT选择培养液筛选杂交瘤细胞原理已在硕士专题讲座第六专题中已经提到，这里关键介绍加HAT选择培养时间和浓度。

　　通常在融合二十四小时后，加HAT选择培养液。

HT和HAT全部有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。

　　因为在培养板内已加入喂养细胞、融合后细胞，200μl／孔。

所以在加选择培养液时应加3倍量HAT。

我们认为，融合后最初补加量可用全量2／3进行选择，可得到满意筛选结果。

　　50×HAT

　　H:

　5×10-3M

　　A:

　2×10-5M

　　T:

　8×10-4M

　　通常选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用通常培养液。

三、抗体检测

　　筛选杂交瘤细胞经过选择性培养而取得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原特异性抗体。

通常在杂交瘤细胞充满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要杂交瘤细胞系。

　　检测抗体方法应依据抗原性质、抗体类型不一样，选择不一样筛选方法，通常以快速、简便、特异、敏感方法为标准。

　　常见方法有:

　　1.　ELISA用于可溶性抗原（蛋白质）、细胞和病毒等McAb检测。

　　2.　RIA用于可溶性抗原、细胞McAb检测。

　　3.　FACS（荧光激活细胞分类仪）用于检验细胞表面抗原McAb检测。

　　4.　IFA用于细胞和病毒McAb检测。

　　上述方法均为通常试验室常规方法，故在此不介绍具体试验过程。

　　可靠筛选方法必需在融合前建立，避免因为方法不妥贻误整个筛选时机。

四、杂交瘤克隆化和冻存

　　克隆化通常是指将抗体阳性孔进行克隆化。

犚r为经过HAT筛选后杂交瘤克隆不能确保一个孔内只有一个克隆。

在实际工作中，可能会有数个甚至更多克隆，可能包含抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。

要想将这些细胞相互分开，就需要克隆化。

克隆化标准是，对于检测抗体阳性杂交克隆应尽早进行克隆化，不然抗体分泌细胞会被抗体非分泌细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞生长速度比抗体分泌细胞生长速度快，二者竞争结果会使抗体分泌细胞丢失。

即使克隆化过杂交瘤细胞也需要定时再克隆，以预防杂交瘤细胞突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体能力。

（一）　克隆化方案

　　用克隆化方法很多，而最常见就是有限稀释和软琼脂平板法。

　　1.　有限稀释法程序

　　①　制备喂养细胞悬液（同融合前准备）

　　②　阳性孔细胞计数，并调细胞数在1～5×10３／ml

　　③　取130个细胞放入6.5ml含喂养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加A、B、C三排为每孔2个细胞。

余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含喂养细胞完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。

余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含喂养细胞完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H两排，为每孔0.5个细胞。

　　④　培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。

　　⑤　第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，立即进行抗体检测。

　　注:

首次克隆化杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

　　2.　软琼脂法

　　①　软琼脂配制

　　含20％FCS（小牛血清）2倍浓缩RPMI1640

　　1％琼脂水溶液：

高压灭菌，42℃预热。

　　0.5％琼脂：

由1份1％琼脂加1份含20％小牛血清2倍浓缩RPMI1640配制而成。

置42℃保温。

　　②　用上述0.5％琼脂液（含有喂养细胞）15ml倾注于直径为9cm平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

　　③　按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆细胞悬液。

　　④　1ml0.5％琼脂液（42℃预热）在室温中分别和1ml不一样浓度细胞悬液相混合。

　　⑤　混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于37℃，5％CO2孵箱中。

　　⑥　4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含喂养细胞24孔板中进行培养。

　　⑦　检测抗体，扩大培养，必需时再克隆化。

（二）　杂交瘤细胞冻存

　　立即冻存原始孔杂交瘤细胞、每次克隆化得到亚克隆细胞是十分关键。

因为在没有建立一个稳定分泌抗体细胞系时候，细胞培养过程中随时可能发生细胞污染、分泌抗体能力丧失等等。

假如没有原始细胞冻存，则因为上述意外而全功尽弃。

　　杂交瘤细胞冻存方法同其它细胞系冻存方法一样，标准上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔杂交瘤细胞能够因培养环境不一样而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就能够冻一支安瓿。

　　细胞冻存液:

　　50％小牛血清

　　40％不完全培养液

　　10％　DMSO（二甲亚砜）

　　冻存液最好预冷，操作动作轻柔、快速。

冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时通常按每分钟降温2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。

或细胞管降至0℃后放-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。

也能够用细胞冻存装置进行冻存。

冻存细胞要定时复苏，检验细胞活性和分泌抗体稳定性，在液氮中细胞可保留数年或更长时间。

五、单克隆抗体大量生产

　　大量生产单克隆抗体方法关键有两种：

　　1.　体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。

但此方法产量低，通常培养液含量为10～60μg／ml，假如大量生产，费用较高。

　　2.　体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

　　①　实体瘤法　对数生长久杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2～4点。

待肿瘤达成一定大小后（通常10～20天）则可采血，从血清中取得单克隆抗体含量可达成1-10mg／ml。

但采血量有限。

　　②　腹水制备　常规是先腹腔注射0.5mlPristane（降植烷）或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，亲密观察动物健康情况和腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，通常一只小鼠可获1～10ml腹水。

也可用注射器抽取腹水，可反复搜集数次。

腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，这是现在最常见方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。

六、单克隆抗体判定

　　对制备McAb进行系统判定是十分必需。

应对其做以下方面判定:

　　1.　抗体特异性判定：

除用免疫原（抗原）进行抗体检测外，还应用和其抗原成份相关其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。

比如①制备抗黑色素瘤细胞McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，方便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原单克隆抗体。

②　制备抗重组细胞因子单克隆抗体，应首先考虑是否和表示菌株蛋白有交叉反应，其次是和其它细胞因子间有没有交叉。

　　2.　McAbIg类和亚类判定：

通常在用酶标或荧光素标识第二抗体进行筛选时，已经基础上确定了抗体Ig类型。

假如用是酶标或荧光素标识兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来抗体通常是IgG类或IgM类。

至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb亚类。

在作双扩试验时，如加入适量PEG（3％），将有利于沉淀线形成。

　　3.　McAb中和活性判定：

用动物或细胞保护试验来确定McAb生物学活性。

比如假如确定抗病毒McAb中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感动物或敏感细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体保护。

　　4.　McAb识别抗原表位判定：

用竞争结合试验、测相加指数方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb识别表位是否相同。

　　5.　McAb亲和力判定：

用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb和对应抗原结合亲和力。

七、影响原因、失败原因分析

　　因为制备McAb试验周期长，步骤多，所以影响原因就比较多，稍不注意就会造成失败。

　　其关键失败原因和影响原因有:

　　1.　污染：

包含细菌、霉菌和支原体污染。

这是杂交瘤工作中最辣手问题。

一旦发觉有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。

支原体污染关键起源于牛血清，另外，其它添加剂、试验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。

在有条件试验室，要对每一批小牛血清和长久传代培养细胞系进行支原体检验，查出污染源应立即采取方法处理。

对于污染杂交瘤细胞能够采取生物学过滤方法，将污染杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞，通常可除去支原体污染。

　　2.　融合后杂交瘤不生长：

在确保融合技术没有问题前提下关键考虑下列原因①PEG有毒性或作用时间过长。

②牛血清质量太差，用前没有进行严格筛选。

③骨髓瘤细胞污染了支原体。

④HAT有问题，关键是A含量过高或HT含量不足。

　　3.　杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

　　①　融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵御细胞所致。

　　②　有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

　　③　对于原分泌抗体杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞生长。

也可能发生染色体丢失。

Goding91982）曾提出“三要”“三不要”，可能是预防抗体停止分泌有效方法。

　　三要:

　　要大量保持和补充液氮冻存细胞原管。

　　要应用倒置显微镜常常检验细胞生长情况。

　　要定时进行再克隆。

　　三不要:

　　不要让细胞“过分生长”。

因为非分泌杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体杂交瘤细胞。

　　不要让培养物不加检验地任其连续培养几周或多个月。

　　不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

　　4.　杂交瘤细胞难以克隆化

　　可能和小牛血清质量、杂交瘤细胞活性状态相关，或因为细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。

若是融合后早期克隆化，应在培养液加HT。