863国家重大科技专项公斤级重组蛋白分离纯化复性技术平台研究.docx
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863国家重大科技专项公斤级重组蛋白分离纯化复性技术平台研究
申请编号：
国家重大科技专项
“创新药物和中药现代化”
课题申请书
课题名称:
公斤级重组蛋白分离、纯化、复性技术平台研究
所属专题：
生物技术药物规模化制备技术平台
专项主题：
新药研究与开发的平台技术研究
申请人：
罗永章
联系电话：
（010）62772897传真：
（010）62794691
申请单位：
清华大学生物科学与技术系
通讯地址：
清华大学生物科学与技术系
邮编：
100084
中华人民共和国科技部
二OO二年六月
一、课题内容提要
基因工程最常用的表达体系是大肠杆菌，该表达体系不但可以提高重组蛋白的表达率、降低蛋白酶对目的蛋白的水解、简化纯化工艺及提高重组蛋白的纯度，而且还可降低生产成本及改进产品质量。
然而大肠杆菌表达蛋白一个主要技术障碍是蛋白质的二硫键错配问题及相关的复性问题。
考虑到蛋白质药物在中试规模及工业化时面临的纯化问题、折叠复性问题、质控问题及节约成本等问题，我们依据自身理论和实验基础，提出1）建立独特的纯化大肠杆菌表达的蛋白质的生产工艺；2）搭建不同类型的蛋白质复性技术平台；4）大幅度降低成本。
我们选定的主要研究模型是抗癌基因工程药物YH-16，希望通过上述研究使YH-16生产能力达到每个制备周期0.5公斤的水平。
二、课题的意义和必要性
许多临床用药量大的重组蛋白药物如BMP、TPA等，由于其每支几毫克至几十毫克的用量需要建立每年公斤级的生产能力才能满足临床及市场需求。
如何建立与市场需求相匹配的生产规模及相应的工艺路线，已成为这些药物走向市场的重要问题。
目前，抗肿瘤药物研究领域血管抑制剂蛋白药物研究开发成为世界范围内的“热点”。
血管抑制剂蛋白药物如rh-Endostatin、rh-Angiostatin等一个主要特征为用量大（几十毫克～几百毫克/天、人），且连续多日给药，使得生产规模必须达到每天几百克至几千克。
如美国EntreMed公司由于采用酵母生产体系生产rh-Endostatin及rh-Angiostatin，一方面产品质量无法保障，另一方面生产量的限制影响了临床试验的进展，高昂的生产技术成本也使得EntreMed没有财力扩大生产规模。
基因工程宿主体分为真核和原核细胞两类，采用真核宿主的优点是可以糖基化，且在蛋白表达率低的情况下一般不需要经过复性过程（在高表达率时需要复性）。
但是，产量低、生产周期长、生产成本高、生产过程不易控制等缺点严重影响真核载体的应用。
尽管采用原核载体（如大肠杆菌）有着产量高、周期短、成本低、生产过程可控等优点，但目的蛋白易形成包含体。
如何将包含体纯化及有效的复性到有活性的天然状态则是制约原核载体的大规模应用的关键环节。
随着人类基因组草图的完成，人类功能基因组学研究在世界范围内迅速开展。
目前已有许多基因功能被阐明，将这些功能明确的基因开发成为重组蛋白类药物用于人类健康，已成为各国政府、大学、研究所及各种私人公司竞相追逐的目标，众多大企业投入巨资开展此项研究。
一方面随着研究的深入，将了解越来越多的基因功能，另一方面这些功能已知的基因所编码的重组蛋白将逐渐成为走向市场的药物。
然而在这些重组蛋白市场化过程中，一个突出的“瓶颈”障碍是大用量重组蛋白的生产技术，尤其是大肠杆菌生产的重组蛋白包含体复性、纯化技术的落后，造成大量蛋白药物无法形成生产规模，或是生产周期长、成本高昂。
世界范围内“上游”基因功能研究“火热”，而“下游”生产工艺研究滞后的矛盾越来越突出，每年仅在美国因蛋白质复性技术障碍造成的损失达几十亿美元。
综上所述，克服大肠杆菌表达蛋白的复性技术障碍，系统地建立有通用性的纯化工艺及复性技术平台成为全球范围内重组蛋白研究的一个重大且急迫的技术问题。
此外，在重组蛋白药物产业化方面，尤其是对用药量大的蛋白，有效的产品质量控制至关重要。
基于以上诸多问题，有必要依据国内现有科研基础开展《公斤级重组蛋白产品分离、纯化、复性技术平台研究》，使原有的科研基础转化为世界领先的科研成果，将我国基因工程“下游”技术的整体水平提高一个层次。
三、课题主要研究内容的国内外技术现状和发展趋势，以及与课题有关的技术领域的国内外专利申请和授权情况
重组蛋白的生产过程包括“上游”的基因克隆、蛋白表达，及“下游”的高密度发酵、蛋白纯化、复性、和制剂等过程。
目前世界范围内基因工程的上游技术已逐渐成熟，而下游生产技术尤其是大规模蛋白质（百克级或百克级以上）的纯化及复性技术相对滞后。
我国在下游生产技术上与美国等发达国家相比有不小的差距。
尽管采用大肠杆菌表达体系纯化重组蛋白的技术相对简单，但仍需进一步优化纯化工艺，尤其是对百克级/周期以上的蛋白的纯化。
相对纯化工艺而言，蛋白复性技术的研究就显得更为困难、更为重要。
由于重组蛋白复性技术的障碍，国外生物制药公司在选择表达体系时有时不得不采用真核表达体系，如由于无法使大肠杆菌表达的包含体复性而形成工业化规模，美国EntreMed公司不得不转向采用毕氏酵母表达系来生产rh-Endostatin、rh-Angiostatin等基因抗癌药物。
酵母表达体系与大肠杆菌表达体系相比表达率低了很多，同时存在生产周期长、难以纯化、产物易降解的缺点。
另外，在高表达率时酵母表达体系也易形成包含体，只是该包含体通常已形成二硫键，有时还是错配对的二硫键，此种形式的包含体也需被复性。
采用大肠杆菌作为表达体系常见的生产工艺路线为：
大肠杆菌发酵→包含体洗涤和纯化→包含体复性→目的产物纯化，其复性工艺常采用0.1mg/ml以下的低蛋白浓度，造成复性效率低，难以放大形成生产规模。
由于已上市的采用大肠杆菌表达体系的蛋白或是因为二硫键少易复性，或是因为每支用量为微克级或微克级以下，所以复性工艺的优化与否与市场需求的差距尚不明显。
目前，美国随着功能基因组研究的深入，也开始逐渐重视包含体复性生产技术的研究，主要研究方向集中在高浓度、大规模生产技术的研究及不同添加剂如何减少蛋白聚集、沉淀，从而提高蛋白复性率的研究。
蛋白质复性技术是建立在蛋白质折叠、去折叠及蛋白质复性中间体理论研究的基础上。
美国针对蛋白质折叠、去折叠及蛋白质复性中间体的理论研究已有四十多年的历史，著名的实验室有斯坦福大学RobertL.Baldwin（美国科学院、艺术与科学院两院院士）实验室。
但是此项研究主要是针对蛋白质结构与功能的研究，侧重点在于基础研究，规模尚在实验室水平。
针对大用量蛋白质复性生产技术美国也未投大量精力开展系统性的研究工作，就目前基因工程蛋白质复性生产技术而言，世界范围内仍缺乏系统性理论指导下的研究工作。
国内开展蛋白质折叠、去折叠及蛋白质复性中间体理论研究机构有中科院北京生物物理所、上海生化所、清华大学、北京大学等，与美国一样国内理论研究主要目的是了解特定蛋白结构与功能的关系，很少开展将蛋白质折叠理论应用于蛋白质复性生产技术的系统性研究工作。
罗永章博士曾师从RobertL.Baldwin教授，对蛋白质折叠、去折叠及蛋白质复性中间体理论有深入的了解，其蛋白质复性中间体的稳定性与协调性相互关系的研究论文（发表于NatureStructuralBiology）引起国际同行的瞩目。
由于有深厚的理论基础，尽管哈佛大学研究人员认为rh-Endostatin包含体复性率小于99%（Cell，88，277-285，1997），罗永章博士领导烟台荣昌生物工程股份有限公司科研人员在世界上首次解决了rh-Endostatin即YH-16的复性生产技术问题，在高蛋白浓度（>0.5mg/ml）体系得到了大于50%的复性率。
在蛋白纯化方面实现了高纯度（>99%）,高产量（>100g/天）,及高回收率（>80%）。
另外，根据不同蛋白质的不同结构及氨基酸组成，我们已开展了系统性包含体复性技术研究。
这些不同结构及氨基酸组成的蛋白质包括1）含多对二硫键蛋白如rh-Angiostatin（10对二硫键），2）富含α-螺旋二级结构的蛋白如apomyoglobin，3）富含β-折叠二级结构的蛋白如神经生长因子（NGF），4）富含疏水性氨基酸蛋白如TWIN（以与富含亲水性氨基酸蛋白如YH-16相比较）等。
上述研究表明我们在某些研究方面已拥有自己的优势。
四、课题的预期目标，具体的考核指标
本课题有两个主要预期目标：
一是提出先纯化再复性的纯化工艺路线，以YH-16为模型药物，建立重组蛋白纯化技术平台；二是寻找不同类别蛋白复性的通用性技术平台。
我们选定的主要研究模型是抗癌基因工程药物YH-16。
希望通过该课题研究使YH-16生产能力达到每个制备周期0.5公斤的水平，使YH-16能够满足市场需求（据估计YH-16的用药量在几十毫克/人、天）,成为老白姓用得起的一类新药。
此外，我们还将开展针对不同结构及氨基酸组成的蛋白的纯化及复性工艺研究，以期建立有通用性的纯化及复性工艺。
具体的考核指标:
1．以YH-16为模型药物，建立YH-16高效率的纯化、复性生产工艺，最终达到每个制备周期（2天/周期）可生产0.5公斤YH-16产品，产品质量符合国家生物制品质量标准，其中纯度达到98%以上，高蛋白浓度（1mg/ml）的复性率达50%以上，最终目的蛋白收率达到40%以上。
2．通过不同类别蛋白的复性技术参数的研究，进一步细化或重新界定不同性质蛋白的分类，从而建立不同类型蛋白通用性复性技术平台。
我们的目标是三年内通过对不同性质、结构的蛋白复性参数的共性研究，建立至少2个通用性复性技术平台，研究成果将发表2-4篇SCI论文，申请2个发明专利。
五、课题的主要研究内容、工艺路线、关键技术
本课题主要研究蛋白纯化技术平台、复性技术平台两方面内容。
〈一〉主要研究内容：
1．重组蛋白纯化技术平台研究
以YH-16为模型蛋白，采用包含体纯化、复性、再纯化工艺，在目前每个制备周期产量为20克目的蛋白的基础上，通过建立大规模生产工艺技术达到每个制备周期0.5公斤目的蛋白。
2．蛋白质复性技术平台研究
蛋白质复性平台技术研究主要是根据不同蛋白的理化性质及结构研究同类别蛋白复性参数的共性，总结理化性质及结构与各种添加剂使用的关系。
我们目前先将蛋白按照以下四个分类开始研究：
Ⅰ．富含α-螺旋二级结构的蛋白复性技术平台研究
Apomyoglobin含有8个α-螺旋片断，除此以外再无任何其它二级结构，是研究富含α-螺旋二级结构蛋白的最佳模型。
通过对apomyoglobin复性条件的研究，建立apomyoglobin及其它该类蛋白最佳复性工艺路线。
Ⅱ．富含β-折叠二级结构的蛋白复性技术平台研究
神经生长因子（NGF）仅含有β-折叠二级结构，除此以外再无任何其它二级结构，是研究富含β-折叠二级结构蛋白的最佳模型。
通过对重组人神经生长因子（rh-NGF）复性条件的研究，建立NGF及其它该类蛋白最佳复性工艺路线。
Ⅲ．富含疏水性氨基酸蛋白复性技术平台研究
TWIN由高达80%的疏水性氨基酸组成，此类蛋白在复性过程中最易形成聚集和沉淀。
通过研究该蛋白的复性条件，寻找减少复性过程中蛋白聚集沉淀的各种参数。
建立TWIN及其它该类蛋白最佳复性工艺路线。
Ⅳ．富含亲水性氨基酸蛋白复性技术平台研究
以本公司YH-16及其它富含亲水性氨基酸蛋白为模型蛋白，研究其高浓度、大规模复性工艺参数。
〈二〉技术路线：
1．蛋白纯化技术平台研究
以YH-16为模型蛋白，采用重组菌体高密度发酵→提取包含体→包含体洗涤→包含体纯化→包含体复性→复性蛋白再纯化→制剂工艺路线。
其中经过包含体纯化后，目的蛋白的纯度达到90%，然后进入复性工艺。
蛋白复性后再纯化一次，纯度要求达到98%以上，最终收率达40%以上。
2．复性技术平台研究
与以往的大肠杆菌重组蛋白纯化路线不同，本平台技术是建立在先纯化后复性的工艺路线策略上，经过大肠杆菌发酵→包含体提取→包含体洗涤→包含体纯化→包含体复性→复性蛋白→纯化工艺→制剂工艺后，达到满足中国药品生物制品检定所的质量标准。
纯化后包含体复性率达到50%以上（NGF除外）。
针对上述提出的4个蛋白分类，每类蛋白分别选择1至3个蛋白作为研究模型，比较其结构的共性是否有复性工艺参数的一致性，尤其比较不同添加剂（如稳定α-螺旋或β-折叠结构的试剂）对同一类蛋白复性率的影响。
另外，针对同一类蛋白复性技术参数的差异，再细化分类标准后，总结结构与复性参数的关系。
〈三〉关键技术：
1．纯化技术平台研究
主要是大规模、高纯度、高收率生产工艺技术的建立。
2．复性技术平台研究
主要是针对不同类别蛋白，选择特异性的复性添加剂，研究蛋白极性、二、三级结构、二硫键数目、Domain个数与添加剂的关系。
六、课题的主要技术特点和创新点，可取的的专利
〈一〉主要技术特点和创新点
1．提出了先纯化后复性纯化的策略
与过去大肠杆菌重组蛋白先复性后纯化工艺路线相比较，此工艺路线可使蛋白复性率大幅度提高。
同时，复性过程也是一个纯化过程，经过此纯化路线，重组蛋白纯度容易达到质量标准的要求。
2．根据蛋白质理化性质及结构性质将蛋白分类，建立不同类别蛋白的通用性复性技术平台研究策略。
3．一个制备周期可达到公斤级目的蛋白的生产水平，创单位体积重组蛋白生产国际之最。
〈二〉可能获得专利（尤其是发明专利和取得国外专利）及知识产权分析
建立不同类别的蛋白通用性生产技术平台，国内外此方面研究工作开展的很少，我们希望通过此项研究申请两项蛋白复性技术平台发明专利，至少一项申请国际专利。
七、课题实施年限及年度计划安排
计划2002-2004年3年内完成本课题研究。
2002年：
完成富含α-螺旋二级结构的蛋白复性技术平台研究。
YH-16在300升发酵罐、40升纯化柱、复性体积1吨生产设备规模上，达到一个制备周期（2天）0.1公斤的产量。
2003年：
完成ß-折叠蛋白及富含极性氨基酸蛋白复性技术平台研究。
YH-16产量在生产设备不变的条件下达到一个制备周期0.2公斤的产量。
2004年：
完成富含非极性氨基酸蛋白复性技术平台研究。
采用2个300升发酵罐、100升纯化柱，2吨复性生产设备，达到一个制备周期0.5公斤产量。
2005年
完成rh-Angiostatin的一个制备周期生产0.5公斤蛋白的目标。
八、课题总投资预算、资金筹措及来源渠道
完成此项目研究需要金费总计1000万元人民币其中：
申请863资助400万
企业自筹600万
九、课题组主要研究人员情况
签名
毕业学校和学位
美国加州大学伯克利分校，博士
美国肯塔基大学，博士
美国加州大学伯克利分校，博士
清华大学，硕士
中科院生物物理所，硕士
芬兰，图尔库大学，博士
山东大学，学士
烟台大学，学士
北京化工大学，学士
吉林大学，学士
在课题中职务（组长、副组长或成员）及分担的任务
组长
成员，复性技术研究
成员，复性技术研究
成员，质量标准研究
成员，生产工艺研究
成员，生产工艺研究
成员，复性技术研究
成员，复性技术研究
成员，生产工艺研究
成员,质量标准研究
专业
生物化学
生物化学
生物化学
生物化学
生物化学
生物化学
生物化学
生物化学
微生物
生物化学
职务/
职称
教授
博士后
博士后
硕士
硕士
工程师
博士后
工程师
助工
助工
出生年月
1962.6
1965.1
1970．6
1967．5
1964.3
1975.7
1963．5
1974.7
1976.8
1978．4
性别
男
男
女
男
男
男
男
男
男
女
姓名
罗永章
雷清新
李颖
张卓兵
石永仲
王玉龙
原桂勇
李壮林
赵群
姚雪静
罗永章（组长）简历:
自99年至今在山东省烟台荣昌生物工程股份有限公司从事重组人血管内皮抑制素的克隆、表达、纯化及复性等研究，尤其以复性为主要研究目标。
在世界上首次将重组人血管内皮抑制素大规模复性，并初具了工业化价值。
作为主要负责人，将重组人血管内皮抑制素由实验室规模走向中试规模，并于今年7月获国家药品监督管理局批准按一类生物制品进入Ⅰ期临床研究。
有关学术论文正在整理过程中。
自94年至98年在美国斯坦福大学医学院生化系从事博士后研究，从师于美国国家科学院院士RobertL.Baldwin教授，从事蛋白质复性机理的研究。
博士后期间获美国NIH颁发的NationalResearchServiceAward，发表4篇第一作者论文（NatureStructuralBiology，PNAS，JMB及Biochemisty），其中尤以蛋白质复性中间体的稳定性与协调性互相制约的发现而引起国际同业们的瞩目。
自93年至94年在美国哈佛大学医学院生物化学与分子药物学系的MichaelA.Weiss实验室做博士后研究，从事蛋白质的结构与功能的研究。
自89年至93年在美国加州大学伯克利分校分子与细胞生物学系做博士研究生，从师于StuartLinn教授，博士论文是氧自由基对DNA损伤机理的研究，发表第一作者论文3篇（PNAS、JBC、MethodsinEnzymology）及第二作者论文2篇（JBC，Biochemistry）。
其它事迹包括：
2001.7月被教育部评为“长江学者特聘教授”；
2001.5月被教育部纳入“教育部蛋白质工程重点实验室”核心成员；
2000.6月入选清华大学“百名人才引进计划”。
已发表的部分论文情况（目前Sci引用195次、他引181次以上）：
1.YongzhangLuo&RobertL.Baldwin（2001）.“HowAla->Glymutationsindifferenthelicesaffectthestabilityoftheapomyoglobinmoltenglobule”Biochemistry40,5283-5289.
2.YongzhangLuo&RobertL.Baldwin（1999）.“The28-111disulfidebondconstrainsthealphalactalbuminmoltenglobuleandweakensitscooperativityoffolding”Proc.Natl.Acad.Sci.USA96,11283-11287.
3.YongzhangLuo&RobertL.Baldwin（1998）.“TrifluoroethanolstabilizesthePH4foldingintermediateofspermwhaleapomyoglobin”J.Mol.Biol.279,49-57.
4.YongzhangLuo,MichaelS.Kay,&RobertL.Baldwin（1997）.“CooperativityoffoldingoftheapomyoglobinPH4intermediatestudiedbysingleglycineandprolinemutations”NatureStruc.Biol.4,925-930.
5.YongzhangLuo,ErnstS.Henle,&StuartLinn（1996）.“OxidativedamagetoDNAconstitutesbyiron-mediatedFentonreaction—thedeoxycytidinefamily”J.Biol.Chem.271,21167-21176.
6.YongzhangLuo,ZhengxuHan,S.MichaelChin,&StuartLinn（1994）.“Threechemicallydistincttypesofoxidantsformedbyiron-mediatedFentonreactionsinthepresenceofDNA”Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,12438-12442.
7．YongzhangLuo,ErnstS.Henle,RajaChatopadyaya,RuchengJin,&StuartLinn（1994）.“DetectingDNAdamagecausedbyiron/hydrogenPeroxide”MethodsEnzymol.234,
51-59.
雷清新（课题副组长）简历
教育背景：
学士：
1981年9月–1985年7月兰州大学化学系金属有机化学专业
硕士：
1985年8月–1988年6月兰州大学生物系生物化学专业
博士：
1997年8月–2001年5月美国肯塔基大学生物系食品化学专业
工作经历：
2001年6月-至今烟台荣昌生物工程股份有限公司（主管科研）副总经理
1988年6月—1997年7月青岛海洋大学水产学院副教授
发表论文（节选）
1．Lei,Q.andW.L.Boatright,2002.FactorsInfluencingtheOccurrenceofMethanethiolinSoyProteinConcentratesAqueousSlurries.JournalofFoodScience,Inpress.
2．Lei,Q.andW.L.Boatright,2002.CompoundsContributingtotheOdorofAqueousSlurriesofSoyProteinConcentrate.JournalofFoodScience,66（9）:
1306-1310.
3．Lei,Q.andW.L.Boatright,2001.DevelopmentofaNewMethanethiolQuantificationMethodUsingEthanethiolasanInternalStandard.JournalofAgriculturalandFoodChemistry,49:
3567-3572.
4．Boatright,W.L.andQ.Lei,2000.HeadspaceEvaluationofMethanethiolandDimethylTrisulfideinAqueousSolutionofSoyProteinIsolate.JournalofFoodScience,65:
819-821.
5．Boatright,W.L.andQ.Lei,1999.CompoundsContributingtothe“Beany”OdorofAqueousSolutionsofSoyProteinIsolates.JournalofFoodScience,64:
667-670.
6．Boatright,W.L.,A.D.CrumandQ.Lei,1998.
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