微生物学复习提纲.docx

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微生物学复习提纲

第六章微生物的生长及其控制

1细胞生长营养物质（环境中）跨膜营养物质（原料、胞内）合成细胞成分细胞有规律增长菌体增重

2繁殖：

菌体重量增加到一定程度，细胞开始分裂进入分裂阶段。

3个体生长个体繁殖群体繁殖

4群体繁殖==个体生长+个体繁殖

5所以：

生长是繁殖的基础，繁殖是生长的结果。

第一节测定生长繁殖的方法

一、测生长量（细胞量）适合于所有的微生物直测菌丝长度—丝状真菌接称干重（离心法或过滤法）间比浊法用光密度（OD值）表示菌悬液的浓度—不适合丝状菌接生理指标法

二、测繁殖数（细胞数）适合于单细胞微生物

直比例计数法接血球计数板法（全菌计数法）既包括活菌又包括死菌间液体稀释法（MPN法）接平板菌落计数法（涂布法、浇注法）[活菌计数法]

一、微生物生物量的测定方法

1.湿重法

收集微生物菌体，或将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物，然后称重。

较为简便，但含水量不定，准确度差

2.干重法

将微生物菌体或离心得到的细胞沉淀物置100—105℃的烘箱中干燥至水份去除，然后再称重。

3.含氮量测定法

一般微生物细胞的含氮量比较稳定，可以用凯氏定氮法等测其总量，再乘以系数6.25即为粗蛋白含量，蛋白含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。

。

4比浊法根据细菌悬浮液的吸光度测定其数量。

比浊法：

样品中由于菌体细胞对光的消散作用而呈浑浊，细胞数目越多，对光的消散作用越强，浑浊度越高。

浊度可以用比色计或分光光度计测量，以光吸收值来表示。

单细胞生物在一定的范围内的光吸收值的大小与液体中细胞数目及细胞物质量成正比，因而可用做溶液中总细胞的计数。

检测时需用直接显微镜计数或平板活菌计数法制作标准曲线。

该方法缺点是灵敏度差，优点是简便、快速、不干扰或不破坏样品。

检测时可使用侧臂三角瓶在不同的培养时间重复测定样品的浊度，因而广泛地用作生长速率的测定。

二、微生物细胞数目的检测方法

1、血球计数板法

A血球计数板法:

利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

B缺点：

不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；

C优点：

操作简便，计数直观。

2、稀释平板计数法

细菌样品做10倍梯度稀释，取相应稀释度的样品涂布到平板上，或与融化的固体培养基混合、摇匀，培养菌落。

优点：

传统计数方法。

对设备要求不高。

稀释平板计数法：

对活菌的计数方法1）涂布法2）浇注法

稀释度的选择

①应选择平均菌落数在30~300之间的稀释度，再乘稀释数进行报告。

②若有两个稀释度，其生长菌落数均在30~300之间，则视二者之比如何来决定。

若其比值小于2，应报告其平均数，若其比值大于2，则报告其中较小的数字。

③若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数再乘稀释数进行报告。

④若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则按稀释度最高的平均菌落数再乘稀释数进行报告。

⑤若所有稀释度的平均菌落数均不在30~300之间，其中一部分大于300或小于30，以最接近30或是300的平均菌落数再乘稀释数进行报告。

⑥若所有稀释度均无菌落生长，则以小于1再乘最低稀释数进行报告，即报告为<10个。

第二节微生物的生长规律

一典型生长曲线

典型生长曲线：

将少量单细胞纯菌接种到一定量的液体培养基内，在适宜的温度下培养，并定时取样测定活菌的数目和重量的变化，以活菌个数的对数或活菌重量为纵坐标，以培养时间为横坐标作图，所得的曲线即为典型生长曲线。

这种培养方式为间歇培养或分批培养：

初始状态下含有限的营养物和微生物。

1.迟缓期

将少量菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不立即增加，或增加很少，生长速度接近于零。

也称延迟期、适应期。

迟缓期的特点：

分裂迟缓、代谢活跃

延滞期的特点:

a生长速度为零；b细胞体积急剧增大;c细胞内的RNA增高;d合成代谢活跃e易产生诱导酶;f对外界不良环境条件敏感

影响延滞期长短的因素与实践意义

接种龄:

对数期“种子”，延滞期较短；延滞期或衰亡期“种子”,延滞期较长；

接种量：

接种量大，延滞期较短；接种量小，延滞期较长；

培养基成分:

培养基成分丰富的，延滞期较短；培养基成分与种子培养基一致,延滞期较短；

2.对数期

对数生长期的细菌个体形态、化学组成和生理特性等均较一致，代谢旺盛、生长迅速、代时稳定，所以是研究微生物基本代谢的良好材料。

它也常在生产上用作种子，使微生物发酵的迟缓期缩短，提高经济效益。

特点：

•生长速率最快，细胞呈指数增长；•世代时短；代谢旺盛，细胞成分平衡发展；•群体的生理特性较一致。

一影响指数期的因素

菌种：

不同菌种的代时差异极大

营养成分：

营养越丰富，代时越短

营养物浓度：

影响微生物的生长速率和总生长量

培养温度：

影响微生物的生长速率

二指数期的实践意义

是代谢、生理研究的良好材料

是增殖噬菌体的最适宿主菌龄

是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄

G+染色鉴定时采用此期微生物

三几个重要的参数：

1繁殖代数（n）：

世代数；2生长速率常数（R）：

生长速度，单位时间的世代数；3代时（G）：

分裂一次所需要的时间；4G=1/R

四细菌研究中常用的三个参数：

1繁殖代数（n）,2生长速率常数（R）,3代时（G）

3.稳定期

A原因：

由于营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境变化，逐步不适宜于细菌生长，导致生长速率降低直至零（即细菌分裂增加的数量等于细菌死亡数量），结束对数生长期，进入稳定生长期。

B获得更多的菌体物质或代谢产物采取措施：

补充营养物质或取走代谢产物或改善培养条件，如对好氧菌进行通气、搅拌或振荡等。

C特点：

1生长速率常数R等于0；2菌体产量达到了最高值；3合成次生代谢产物；4细胞内出现储藏物质，芽孢菌内开始产生芽孢。

D稳定期的实践意义：

a是发酵生产中以菌体为终产品的最佳收获期；b某些代谢产物特别是次生代谢产物发生在此阶段某些细菌的芽孢也发生在此阶段，故又称作代谢产物合成期；c放线菌的的抗生素在此阶段大量形成。

d导致了连续培养原理的提出和工艺技术的改进。

4.衰亡期

现象：

细菌代谢活性降低，细菌衰老并出现自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。

细胞呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有些革兰氏染色反应阳性菌变成阴性反应等。

特点：

1R为负值；2细胞的形态发生变化，出现不规则的衰退形；3细胞畸变，菌体开始自溶。

产生原因：

生长条件的进一步恶化，使细胞内的分解代谢大大超过合成代谢，继而导致菌体的死亡。

二、丝状微生物微生物的群体生长曲线

1.特性：

丝状微生物在液体培养基中大多数情况下是以分散的沉淀物方式,形态从松散的絮状沉淀到堆积紧密的菌丝球不等.

丝状微生物的生长通常以单位时间内微生物细胞的物质量（主要是干重）的变化来表示.丝状微生物在液体培养基中的生长方式在工业生产中很重要。

2.生长曲线

丝状微生物的群体生长有着与单细胞微生物类似的规律。

在深层通气液体培养基中的生长曲线也显示具有迟缓期、对数期、稳定期和衰亡期。

工业发酵意义：

丝状微生物在液体培养中的生长方式在工业生产中很重要，它影响发酵过程的通气性、生长速率、搅拌能耗及菌丝体与发酵液的分离难易等。

三、连续培养与微生物的生长

（一）分批培养和连续培养

分批培养：

将微生物置于一定容积的培养基中，经过培养生长，最后一次收获的培养方式。

连续培养：

在一定恒定的容积的流动系统中培养微生物，一方面以一定速率不断地加入新的培养基，另一方面又以相同的速率流出培养物（菌体和代谢产物），以使培养系统中的细胞数量和营养状态保持恒定。

（二）连续培养类型

连续培养的基本原则：

微生物培养过程中不断的补充营养物质和以同样的速率移出培养物。

连续培养类型分为恒化连续培养和恒浊连续培养。

1恒化连续培养

在整个培养过程中通过控制培养基中某种营养物质的浓度基本恒定的方式，保持细菌的比生长速率恒定，使生长“不断”进行。

生长速率的控制因子：

一般是氨基酸、氨和铵盐等氮源，或是葡萄糖、麦芽糖等碳源或者是无机盐，生长因子等物质。

恒化器连续培养通常用于实验室的科研工作，尤其适用于与生长速率相关的各种理论研究。

2恒浊连续培养

通过连续培养装置中的光电系统控制培养液中菌体浓度恒定、使细菌生长连续进行的一种培养方式。

用于获得大量菌体以及与菌体生长平行的代谢产物生产的发酵工业中，但此法不适用于丝状微生物。

第三节微生物的纯培养生长

微生物在自然界总是混杂地生活在一起，如土壤和水中，通常栖息着的是许多不同微生物混杂在一起的群体。

哪怕是一粒砂或尘土，也常含有多种细菌及其它微生物。

要想研究某一种微生物，必须把研究对象从混杂群体中分离出来。

纯培养（pureculture）：

微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养。

一、微生物纯培养的分离

方法：

1平板划线分离法、2稀释倒平板法、3单孢子或单细胞分离法、4利用选择性培养基分离法。

1、平板划线分离法

用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。

2、稀释平板分离法：

倾注平板法和涂布平板法。

基本过程：

（1）梯度稀释过程；

（2）分离培养过程

稀释平板分离法使用过程中的几个问题：

1）梯度稀释度的确定：

需分离微生物在样品中的数量

2）选择菌落接种的依据：

a、菌落特征；b、菌体的特征

3）微生物纯培养的标准：

菌落特征一致性

4）操作要点：

无菌操作

无菌操作（asepticoperation）

定义：

在操作过程中人为地排除一切微生物或一切不需要的微生物。

它是微生物学的基本技术。

要点：

①杀死规定作业系统（如试管、三角瓶和培养皿）中的一切微生物，使作业系统变成无菌；②在作业系统与外界的联系之间隔绝一切微生物穿过（如用火焰封闭三角瓶和试管等的开口,用棉花过滤空气、用滤器过滤水等）;③在无菌室、超净操作台或空气流动较小的清洁环境中，进行接种或其他不可避免的敞开作业，防止不需要的微生物侵入作业系统。

3、单孢子或单细胞分离法

采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。

4、选择性培养基分离法

各种微生物对不同的化学试剂、染料、抗生素等具有不同的抵抗能力，利用这些特性可配制合适某种微生物而限制其它微生物生长的选择培养基，用它来培养微生物以获得纯培养。

根据所要分离的菌种的特性选用培养基，如：

①分离真菌用马丁氏培养基，PH偏酸；分离放线菌用高氏一号培养基，PH中性偏碱。

②不同菌对化学试剂的敏感性：

分离放线菌时，培养基中加入数滴10%的酚，抑制细菌和真菌；从土壤中分离真菌，培养基中加入孟加拉红或抗生素，抑制细菌生长。

③根据分离对象的营养特征：

分离能发酵纤维素的菌株，培养基中以纤维素为唯一碳源；分离固氮菌，用无氮培养基。

二、纯培养的保存

试管斜面培养基低温、干燥、隔绝空气

保存过程的注意点：

防止杂菌污染。

1、灭菌彻底2、棉塞大小要合适3、无菌操作

三、目标微生物纯培养筛选的基本思路

１、待分离样品的确定

２、培养基的选择

３、纯化过程环境条件的控制（温度、空气、PＨ、抑制剂）

第四节环境因素对微生物生长的影响

一、温度

不同的微生物生长的温度范围不同，根据生长与温度的关系，微生物的生长有三个温度基点，即最适、最高、最低生长温度，根据微生物的最适生长温度的不同，可将微生物分为：

低温微生物、中温微生物和高温微生物。

当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用。

最适生长温度有时也简称“最适温度”，其意义是某菌分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。

最适生长温度并不等于生长量最高时的培养温度，也不等于发酵速度最高时的培养温度或积累代谢产物量最高时的培养温度，更不等于积累某一代谢产物量最高时的培养温度。

⑴嗜冷性微生物

最适生长温度大多数在-10~20℃，少数可达-34℃。

分布：

海洋、冷泉、深湖和冷藏库中。

低温对微生物生长的影响

低温微生物耐低温的原因：

胞内酶耐低温；细胞膜中不饱和脂肪酸的含量高。

低于冰点的温度对微生物的影响：

水分的丧失；冰晶对细胞膜的物理损伤。

低温的用途：

菌种保藏、食品冷藏、

⑵嗜温性微生物最适生长温度在20~45℃的微生物。

分布：

土壤、植物、温血动物及人体中。

体温性微生物：

人和温血动物的寄生菌最适生长温度为37~45℃

室温性微生物：

大多数植物病原菌和许多土壤微生物最适生长温度为20~28℃

⑶嗜热性微生物

能在高于45~50℃的温度下生长（低于35~40℃便不能生长）

分布：

主要在温泉、堆肥和土壤中，一些人为的高温环境，如工厂的热水装置和人造热源等处，是嗜热性微生物良好的生存场所。

高温菌在高温下生长的原因：

抗热的酶，膜中的高饱和脂肪酸。

高温菌的生长特性：

生长曲线的各个时期均短暂，因此常会在腐败食品中检测不到，这在食品检验中要特别注意。

二、氧

根据氧与微生物生长的关系可将微生物分为好氧、好氧、耐氧型、兼性厌氧、专性厌氧

（一）专性好氧菌（strictaerobe）

必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。

绝大多数真菌和许多细菌都是专性好氧菌

（二）兼性厌氧菌（facultativeaerobe）

在有氧或无氧条件下均能生长，但在有氧情况下生长得更好；在有氧时靠呼吸产能，无氧时借发酵或无氧呼吸产能；细胞含超氧化物歧化酶和过氧化氢酶；

许多酵母菌和许多细菌都是兼性厌氧菌

（三）微好氧菌（microaerophilicbacteria）

只能在较低的氧分压下才能生长的微生物。

也通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。

例如：

霍乱弧菌、一些氢单胞菌属、发酵单胞菌属等

（四）耐氧菌（aerotolerantanaerobe）

一类可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌，即它们的生长不需要氧，分子氧对它们也无毒害。

它们不具有呼吸链，仅依靠专性发酵获得能量。

细胞含超氧化物歧化酶和过氧化氢酶。

细胞含超氧化物歧化酶和过氧化物酶，但缺乏过氧化氢酶。

一般的乳酸菌多数是耐氧菌

（五）厌氧菌（anaerobe）

它有以下几个特点：

1分子氧对它们有毒，短期接触也会抑制它们生长甚至致死；2只有在深层的无氧或低氧化还原势的环境下才能生长；3生命活动所需能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供；4细胞内缺乏超氧化物歧化酶和细胞色素氧化酶；

各种光合细菌和产甲烷菌等都属于厌氧菌

三、水分活度（Aw）

1.Aw食品在密闭容器中的水蒸气压（P）与在相同温度下的纯水蒸气压（P0）之比值。

由于纯水中加入溶质后，溶液中分子之间的引力增加，蒸气压下降，故P＜P0，因此：

Aw纯水=1，Aw无水食品=0一般食品的：

0＜Aw＜1

Aw值大小反映了溶液中溶质的多少，一般来说，溶质浓度与Aw值成反比。

Aw值反映了微生物对水的依赖程度，根据Aw值，可将微生物分为三个类型：

湿生型：

Aw在0.9以上，绝大多数细菌

中生型：

Aw在0.8~0.9之间，酵母菌

干生型：

Aw在0.8以下，大多的霉菌

2.不同类群微生物的生长和水分活性

⑴细菌生长的水分活度：

细菌生长所需的水分活性比酵母菌、霉菌高。

一般在0.90~0.99之间。

一般食品腐败菌生长的最低Aw在0.94~0.99之间。

芽孢萌发时要求的水分，比营养体所要求的水分高。

⑵酵母菌生长的水分活性：

酵母菌生长所需的水分活性比细菌低，比霉菌高。

在0.88~0.94之间

⑶霉菌生长的水分活度：

多数霉菌生长所需的Aw最低为0.80，但在0.65时，尚有少数干性霉菌生长。

当Aw低于0.64时任何霉菌都不能生长。

因此，干燥便成为一种很好的食品保藏方法。

3.食品的水分活性

⑴新鲜食品原料：

包括动物性原料和植物性原料，如鱼、肉、水果、蔬菜，均含有较多的水分，虽原料的种类不同，但其Aw多数在0.98~0.99之间，适宜于多种微生物尤其是细菌生长。

⑵干制食品：

0.80~0.85适宜于霉菌生长，其保藏期1~2周，0.72，保藏期为三个月，0.65时保藏期为1~3年。

（如奶粉）

四、渗透压

1.渗透压对微生物的影响

⑴微生物最适合在等渗溶液中生长

⑵膜内＞膜外（低渗透压环境）：

细胞吸水膨胀，破裂

⑶膜外＞膜内（高渗环境）：

脱水、质壁分离

2.不同类群的微生物对渗透压的适应性

绝大多数微生物可以在0.85~0.9%NaCl的较低溶质浓度的条件下生长，有些微生物必须在含2%以上的盐浓度条件才能良好生长，称为嗜盐性微生物。

不同类群的微生物对盐的耐受力不同，但18~25%的盐浓度才能完全抑制微生物的生长。

绝大多数细菌不能在较高渗透压食品中生存，多数霉菌，少数的酵母菌能耐受较高的渗透压。

采用盐渍（5~30%的食盐）或蜜饯（30~80%的糖）的方式，利用高渗条件可保存食品。

五PH值

每种微生物生长繁殖所能适应的pH值都有一定的范围，这个pH范围可分为最低pH值、最高pH值和最适pH值，最适pH值指微生物最适合生长繁殖的pH值，最低、最高pH值环境中微生物虽尚能生存但生长非常缓慢且容易死亡。

PH值在5~9的范围较易生长。

一般细菌生长的最适pH范围7.0~7.6

放线菌7.5~8.5；

酵母菌3.8~6.0；

霉菌4.0~5.8。

PH值影响微生物生长的主要作用在于

1影响细胞膜电荷的变化，从而影响了微生物对营养物的吸收。

2影响代谢过程中酶的活性，从而影响微生物的生命活动。

一般生长繁殖的最适PH与其合成某种代谢产物的PH通常不一样

某些有机酸如苯甲酸可用作防腐剂

第5节接种和培养

一微生物的接种

定义：

将微生物移接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程。

1、接种工具

用的最多的是：

接种针（刀形，耙形），接种环

液体接种多用到：

吸管，滴管

2接种方法

1）划线接种最常用的接种方法。

在固体培养基表面作来回直线形的移动。

在斜面接种和平板划线中常用此法。

2）三点接种研究霉菌形态时常用此法。

用接种针或牙签将单个或少量的微生物接种在平板表面上成等边三角形的三点。

3）穿刺接种保藏菌种或研究微生物的运动时常用此法。

4）浇混接种

将待接的微生物先放入培养皿中，然后倒入冷却至45度左右的固体培养基，迅速摇匀。

5）涂布接种

先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板之上，用涂布棒在表面作来回左右的涂布。

6）液体接种实验室中常用吸管或移液管作接种工具。

7）注射接种常用的疫苗预防接种。

8）活体接种

专门用于病毒或其它专性寄生活体的微生物，活体可是整个动物或某个活组织，接种方式可以是注射或是拌料喂养。

二、微生物的培养方法

根据氧气的需要与否分为两大类：

好氧培养、厌氧培养

根据培养基的物理特性分为两大类：

固体培养、液体培养

（一）好氧培养方法

1）固体好氧培养方法2）液体好氧培养方法

（二）厌氧培养方法

（三）非细胞型微生物的培养

主要是指病毒的培养。

主要方法有：

1动物培养：

采用实验动物来培养，主要是小白鼠；2鸡胚培养；3细胞培养。

第六节有害微生物的控制

在周围环境中，到处都有各种各样的微生物存在着，其中是对人类有害的微生物，我们应采取有效的措施来抑制或消灭它们。

一、几个基本概念

一）灭菌（Sterilization）

采用强烈的物化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施，称为灭菌。

商业灭菌：

从商品的角度考虑，提出对某些食品的灭菌要求。

即食品经杀菌处理后，经检验，无活的微生物检出，或仅能检出极少数非病原菌。

此菌在保藏期不能进行生长繁殖

（二）消毒（Disinfection）

消毒是一种采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌。

（三）防腐（Antisepsis）

防腐就是利用某种理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止食品等发生霉腐的措施。

防腐的措施有很多，主要有：

1）低温、2）缺氧、3）干燥、4）高渗、5）高酸度、6）防腐剂

（四）化疗（Chemotherapy）

化疗即化学治疗，它是利用具有高度选择毒力的化学物质来抑制宿主体内部病原微生物的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。

根据控制作用原理、方式和方法分类：

物理控制方法、化学控制方法两大类

二常见的灭菌和消毒的物理方法

1高温灭菌

1）干热灭菌法

A、烘箱内热空气灭菌160℃，2小时

适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。

优点：

可保持物品的干燥

B、火焰灼烧法

适用于接种针，接种环，试管口等

2）.湿热灭菌

湿热灭菌是利用热蒸汽灭菌。

在相同温度下，湿热的效力比干热灭菌好。

①热蒸汽对细胞成分的破坏作用更强

②热蒸汽比热空气穿透力强

③蒸汽潜热大，当气体转变为液体时可放出大量热量，故可迅速提高灭菌物体的温度。

（1）常压法

A、巴氏消毒法（pasteurization）

用于牛奶、啤酒、果酒和酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法。

可杀死其中的病原菌如结核杆菌、伤寒杆菌等，同时又不损害营养与风味。

巴氏消毒法是一种低温消毒法：

63ºC,30min或72ºC,15min

巴氏消毒法：

低温维持法（LTH）：

用于牛奶消毒时，63ºC下保持30分钟

高温瞬时法（HTST）：

用于牛奶消毒时，75-90℃保温15-16秒

超高温灭菌法（利乐包）：

使用特殊的设备，将原奶加温到摄氏135-140度，保持1-3秒，彻底消灭原奶中的一切微生物，不过由于温度越高，对牛奶的口感和蛋白质等营养成分的破坏就越大，因此超高温灭菌奶的口感和营养价值就比巴氏灭菌的牛奶差多了。

不过由于原奶质量差，所以许多企业的巴氏灭菌法都采用85-90度

不过超高温灭菌也不是万能的，为了杀菌，就需要采用更长的时间，4秒不行就10秒，或者15秒，总之杀到无菌为止！

B、煮沸法消毒

一般用于引用水的消毒（100ºC下数分钟）此方法适用于注射器，解剖用具等。

C、间歇灭菌法（fractionalsterilizationORtyndallization）

方法是：

将待灭菌的培养基在80~100ºC下煮沸15~60分钟，以杀死其中所以微生物的营养细胞，然后置室温或37ºC下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续重复3天。

（2）加压法

A、高压蒸汽灭菌（autoclave）:

这是一种应用最为广泛的灭菌方法。

将待灭菌的微生物放置在有少量水的加压蒸汽灭菌锅内。

将锅内的水加热煮沸，并将其中的空气彻底驱尽后将锅封闭。

再持续加热就会使锅内的蒸汽压逐渐上升，从而使温度达100℃以上。

适用于一切微生物学实验，医疗结构或发酵工厂中对培养基等多种器材、物料的灭菌。

该法不是利用高压来杀死微生物，而是利用提高压力使水的沸点升高，以提高水蒸汽的温度，更加有效地杀灭微生物。

B、连续加压灭菌法（continuousautoclav