第三篇第二章柠檬酸发酵.docx

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第三篇第二章柠檬酸发酵

§第四章柠檬酸发酵机制与代谢调控

一、行业简介

柠檬酸被称为第一食用酸味剂

饮料——不仅赋予饮料水果风味，而且具有增溶、缓冲、

抗氧化等作用，能是饮料中的糖、香精、色素等

成分交融协调

果酱和果冻，酿造酒，冰激淋和人造奶油（增加乳化稳定

性）、腌制品（除腥去臭、抗氧化）、罐头食品、豆制

品和调味品

Ø国外柠檬酸发酵技术发展的三个历史时期

1893年至1917年：

青霉菌生产（德国微生物学者Wehmer

首先用青霉菌生产柠檬酸）；

1917年至1938年：

黑曲霉，浅盘发酵，奠定了大规模生

产的基础；

1938年至1951年：

深层发酵，用糖蜜为原料（1951年美

国Miles公司首先采用深层发酵法）。

Ø近几年柠檬酸工业高速发展，产量跃居世界之首，出口额突破了2亿美元，成为我国单项化工产品出口额第一的产品。

Ø提取工艺落后，收率、产品纯度等方面与国外先进水平相比尚有一定的差距，产品的收得率与国外的水平相比相差十个百分点以上，而且柠檬酸生产是重污染行业之一。

Ø由于产量迅速增长而内需不旺，迫使企业加入残酷的价格大战。

柠檬酸出口价格呈持续下滑趋势。

出口价格不断下跌已引起相关国家的抵制。

遭到反倾销投诉和他国对柠檬酸进口实施保障措施。

补充资料：

柠檬酸又称为：

枸橼酸，是目前由微生物发酵生产应用最为广泛、产量最高的有机酸。

其主要用途：

食品、饮料、医药、化妆品、洗涤剂、建材等领域。

最早的柠檬酸是从柠檬中提取的，故命名为柠檬酸。

后来采用发酵法生产。

世界上最早的发酵法柠檬酸生产是1923年的比利时，采用浅盘法发酵生产？

。

1952年，美国的Miles公司以淀粉质为原料，经水解后，深层发酵获得成功。

我国1953年刚开始也是采用浅盘法发酵生产柠檬酸，60年代后期，开始采用液体深层发酵法生产柠檬酸。

目前，我国柠檬酸行业从产量上位居世界第一，从技术上，在国际上也是处于世界领先水平，并远远领先于其他国家，其优势在于：

1.我国的柠檬酸发酵采用的菌种（黑曲霉）具有双重功能，当淀粉原料被液化后，即可进行发酵，不需要将淀粉水解成葡萄糖，简化了生产工艺，降低了生产成本。

2.尽管采用边糖化边发酵的工艺，但发酵周期只有64小时，生产周期比国外的单边发酵周期还要短。

3.柠檬酸的产酸速度大大地高于国外水平。

平均产酸速率是国外的2倍。

二、用于工业生产的菌种

黑曲霉（利用淀粉,乙醇,醋酸）

假丝酵母（利用正烷烃）

三、柠檬酸的生物合成途径

用图示之：

葡萄糖

丙酮酸+丙酮酸乙酰辅酶A（CH3CO-CoA）

CO2固定反应

草酰乙酸+

（柠檬酸合成酶）

柠檬酸顺乌头酸酶

异柠檬酸

异柠檬酸脱氢酶

α—KGA

琥珀酸

按照正常的微生物菌体的代谢规律，上述途径并不能够积累柠檬酸，而是进入TCA循环，被彻底氧化，柠檬酸产生菌之所以能够大量积累柠檬酸，其产生菌菌种必须具备一定的内在因素，也就是：

柠檬酸合成酶,丙酮酸羧化酶要强大，柠檬酸后述的各种酶，主要是，顺乌头酸酶、异柠檬酸脱氢酶酶的活性丧失或非常微弱，否则，合成的柠檬酸迅速被降解成其他物质。

菌体有了上述特点，只是具备了合成并积累一定量的柠檬酸的条件，要想大量的合成柠檬酸，或者说，追求柠檬酸的高产率，还需要解决柠檬酸合成过程中的代谢调节与控制的问题。

四、柠檬酸生物合成中的代谢调节与控制

柠檬酸是微生物生长代谢过程中的一个中间性产物，在正常的微生物体内不能够积累的，如果有积累的话，与柠檬酸合成有关的各种酶的活性，则会受到抑制或阻遏，那么，柠檬酸发酵过程中，这种抑制或阻遏是如何被克服的呢？

分述之：

1.磷酸果糖激酶（PFK）活性的调节

从葡萄糖柠檬酸的合成过程中，PFK是一种调节酶或者称之为关键酶，其酶活性受到柠檬酸的强烈抑制，这种抑制必须解除，否则，柠檬酸合成的途径就会因为该酶活性的抑制而被阻断，停止柠檬酸的合成，……

研究表明，微生物体内的NH4+，可以解除柠檬酸对PFK的这种反馈抑制作用，在较高的NH4+的浓度下，细胞可以大量形成柠檬酸，那么NH4+浓度是如何升高的呢？

进一步的研究表明，柠檬酸产生菌——黑曲霉如果生长在Mn+缺乏的培养基中，NH4+浓度异常的高，可达到25mmol/L，显然，由于Mn+的缺乏，使得微生物体内NH4+浓度升高，进而解除了柠檬酸对PFK活性的抑制作用，使得葡萄糖源源不断的合成大量的柠檬酸。

Mn+缺乏如何会使NH4+浓度升高呢？

当培养基中Mn+缺乏时，NH4+浓度升高，同时微生物体内积累几种氨基酸（GA、GLu、Arg、Oin等），这些氨基酸的积累，意味着体内蛋白质的合成受阻，而外源蛋白质的分解速度则不受到影响，这样NH4+的消耗下降，NH4+浓度就会升高，微生物体内蛋白质和氨基酸的代谢关系可以使用下图示之：

氨基酸合成蛋白质分解氨基酸

氨基化合成氨基酸

2.顺乌头酸酶活性的控制

该酶的丧失或失活是阻断TCA循环，大量生成柠檬酸的必要条件。

通常柠檬酸产生菌体内该酶的活性本身就要求很弱，但在发酵过程中仍需要控制它的活性。

由于该酶的活性受到Fe2+的影响，控制培养基中的Fe2+的浓度，可以使该酶失活。

因此，柠檬酸发酵要求采用不锈钢为反应器的材料，目的就是控制培养基中的Fe2+的浓度。

但是在柠檬酸发酵过程中，培养基中的Fe2+的浓度有要求不能够低于0.1mg/L，原因目前尚没有搞清楚。

3.能荷调节对柠檬酸发酵的影响

那么，解决了柠檬酸发酵过程中的上述几个问题：

……，是不是就意味着可以将葡萄糖源源不断的转化成柠檬酸呢？

提问：

根据微生物代谢调节的基本理论，还需要解决什么问题？

菌体要大量合成柠檬酸，从葡萄糖经过EMP到柠檬酸整个代谢途径需要畅通，在这个过程中，有一步反应：

丙酮酸氧化脱羧，每分子丙酮酸可产生一分子的NADH，在有氧的条件下，每分子的NADH经过呼吸链彻底氧化成H2O，并氧化磷酸化产生3分子的ATP，造成了微生物体内能荷的增加，能荷增加则抑制PFK等关键酶的酶活性，使得从葡萄糖到柠檬酸的代谢停止，怎么能够大量合成柠檬酸呢？

如果NADH（还原型）不能够快速的被氧化转变成NAD（氧化型），则整个反应就会因为缺乏作为推动力的氧化型的NAD而停止，仍然不能够合成柠檬酸。

而实际上，确实柠檬酸产生菌可以在有氧的条件下大量生成柠檬酸，也就是说，NADH即被氧化了，又没有产生ATP。

为了解释这种现象，有人提出了一种假设：

该菌体内存在一条侧系呼吸链，NAD（P）H经过该呼吸链，可以正常的传递H+，将其氧化为H2O，但是并没有氧化磷酸化生成ATP，能够正常产生ATP的呼吸链称之为标准呼吸链。

后来的大量的实验证明，在某些微生物体内确实存在一条这样的侧系呼吸链，该侧系呼吸链中的酶系强烈需氧，如果在柠檬酸的发酵过程中，发酵液的溶氧浓度在很低的水平维持一段时间，或者在这期间中断供氧一段时间（20分钟，根据处理情况如：

紧急保压等）则这一侧系呼吸链不可逆的失活，其结果是菌体不再产酸，而是产生了大量的菌体，因为，标准呼吸链的存在使得菌体在代谢过程中产生了大量的ATP，用于菌体自身的生长上，这种现象，在生产上通常称之为：

只长菌不产酸，大量的葡萄糖被消耗了，却没有生产出柠檬酸，是一种失败，（大型柠檬酸生产企业需要自己备用的发电系统）。

五、柠檬酸发酵的产率

一个工业化的过程，产率问题是必须研究的问题。

按照上述柠檬酸发酵过程中的代谢控制要求，菌体可以将葡萄糖转化成柠檬酸，但是，如果葡萄糖经过EMP途经生成丙酮酸后，丙酮酸在丙酮酸脱羧酶的作用下生成了乙酰辅酶A（CH3CO-CoA），则合成一分子柠檬酸需要3分子的CH3CO-CoA，也就是需要1.5分子的葡萄糖；试想，如果其中一分子的丙酮酸通过CO2固定反应生成一分子的C4二羧酸，那么合成一分子的柠檬酸需要1分子的葡萄糖，产率可以大大的提高。

1.无CO2固定反应的产率

192/（180*1.5）==71.1%

2.通过CO2固定反应提供C4二羧酸

192/180==106.6%

C6H12O6C6H8O7（C没有增加）

可见，CO2固定反应堆与柠檬酸发酵的重要性。

在柠檬酸产生菌内，存在下列CO2固定反应：

（1）磷酸烯醇式丙酮酸+CO2==草酰乙酸（C4二羧酸）

酶：

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶

（2）丙酮酸+CO2===草酰乙酸（C4二羧酸）

酶：

丙酮酸羧化酶

以上两种CO2固定反应所需要的辅酶都是生物素。

总之：

在柠檬酸发酵过程中，存在三个控制要点：

C6H12O6

控制Mn+NH4+浓度，解除柠檬酸读对PFK的抑制

（1）点：

EMP畅通无阻

控制溶氧，防止侧系呼吸链失活

丙酮酸+丙酮酸

（2）点：

通过CO2固定反应生成C4二羧酸，强化这一反应的方法：

乙酰辅酶A+C4二羧酸

柠檬酸（3）点：

柠檬酸后述的酶的酶活性丧失或很低，控制培养基中的Fe2+的浓度

六、柠檬酸产生菌的育种

柠檬酸发酵和其他代谢控制发酵一样，都是在环境水平上的代谢控制发酵，亦即，选育有代谢技能的突变株，在有控制的培养基上，在有选择的条件下，才能大量合成产物。

因此菌种的选育是非常重要的，根据菌种选育的方法不同可以分为：

分子生物学水平上的、传统的。

分子生物学水平：

选定特定的基因（需要大量的基础工作）

加在？

某一载体上（宿主细胞，Host）

在特定的条件下的基因表达

今天介绍的是传统的方法：

Ø出发菌株:

黑曲霉,假丝酵母

Ø选择透明围大的突变株

平板：

10%甘薯+2%的琼脂+0.5%CaCO3

Ø诱变后，涂布，透明圈大的则好获得柠檬酸产量高的生产菌。

为何？

淀粉的水解能力。

Ø选择显色圈直径大的突变株

Ø平板：

麦汁培养基+pH值指示剂（0.01%溴酚蓝）

Ø诱变后，33℃培养3天，柠檬酸产量越高，显色圈就越大

Ø选育耐高渗透压的突变株

Ø仍然能正常生长，并具有代谢的能力，和柠檬酸的合成不受影响

Ø选育在含16％一25％甘薯粉的平板上生长良好的突变株

Ø选育在含10％一20％柠檬酸的培养基上生长良好的突变株

Ø不分解柠檬酸的菌株（说明其TCA循环中柠檬酸后述的酶的活性较低，或者丧失）

Ø选育在以柠檬酸为唯一碳源的培养基不生长或生长微弱的突变株。

Ø选育乌头酸酶活性低的突变株

选育对单氟乙酸,三氟乙酸等敏感的突变株

Ø选育CO2固定反应强的突变株

Ø选育氟丙酮酸敏感突变株

ØAla-或AlaL

ØAsp-或AspL

Ø加大生物素的量或克隆

Ø强化柠檬酸合成酶

ØPH控制3.0以下,生成草酸

Ø控制Fe2+和供氧

Ø选育不长孢子、少长孢子、迟长孢子的菌株

Ø在培养基中如果菌株能够大量合成积累柠檬酸，自然会使TCA循环中的中间产物浓度降低，这样不利于孢子的形成。

（为何？

中间产物少，C架少，不利于合成代谢……）