性病诊断彩色图文报告系统Word文档格式.docx

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其培养所需要的时间为24-72小时，对于急性的感染，容易错失治疗的最好时机。

单克隆荧光抗体染色法检测的是病原体的抗体，结果与金标准法结果对比完全一样，而检测所需的时间只45分钟，比培养法更方便、快速。

性病类

●淋病（荧光法、涂片法或培养法）

●梅毒（FTA-ABS法或暗视野检查法）

●非淋菌性尿道炎（支原体、衣原体抗原荧光检测）

●尖锐湿疣（组织病理学检测、醋酸白试验）

●软下疳（涂片法、培养法）

●细菌性阴道炎（加特纳菌抗原荧光检测）

●白色念珠菌（湿片镜检、念珠菌抗原荧光检测、培养法）

●滴虫（湿片镜检）

（以上方法为卫生部推荐检查方法）

其他类

●染色体及性别鉴别

●TB（结核）系列

●OKT系统（主要用于T细胞亚群）

●肺炎支原体

●红斑狼疮

（一）荧光显微基本技术

1、荧光显微镜基本知识

（1）全色光谱的波长不同，折射率不同，波长越长折射率越小，紫光波长最短，折射率最大。

（2）激发滤光片只有蓝紫光透过，照射标本上反射标本上反射出绿色或红色荧光及激发光，经过压制滤光片只有绿光透过。

（3）分色镜（干涉分光滤镜）对光可选择性的反射和透射

2、落射式荧光显微镜的工作原理

（1）滤色系统

是荧光显微镜的重要部分，常用滤光片为蓝色光激发光片（400mm）、紫蓝光激发滤光片（300—490mm）、紫外蓝光激发滤光片（300—450nm）以及选择性很强的金属膜干涉滤片。

（2）压制滤光片：

主要阻挡激发光通过，要根据荧光显微镜及荧光素的荧光波长选择压制滤光片。

（二）、免疫荧光标记及抗原片制备

1、直接荧光染色技术

[原理]

荧光标记抗原或抗体，直接与相对应抗体和抗原结合，则抗原和抗体结合部位发出亮绿的荧光，为特异性结合。

[试剂和材料]

（1）

荧光标记抗体（或抗原）

（2）0.01mol/LpH7.2PBS

（3）湿盒

（4）泡洗缸

（5）荧光显微镜

[方法]

（1）抗原底片从冰箱取出时，应立即电风扇吹干，无水乙醇固定，或丙酮固定，或不固定，要根据不同抗原性质。

（2）将荧光标记抗体（抗原），滴于抗原（抗体）膜上，放湿盒内，室温或37℃温箱30min。

（3）用0.01mol/LpH7.2PBS冲洗150min，中间换水两次。

（4）pH7.2缓冲甘油封片，荧光显微镜观察。

[特点]

（1）免疫荧光直接法，特异性强。

（2）只能检测一种抗原或抗体。

（3）适用于细菌抗原和病毒抗原检查。

2、间接荧光染色技术

间接荧光染色分双层法和夹层法，双层法主要是定位于抗原和鉴定未知抗体。

夹层法主要是示踪细胞内的免疫球蛋白，它的关系如下：

双层法：

抗原+抗体1——抗原，抗体复合物+荧光标记抗体2。

（1）抗原底物：

可以是各种动物组织冰浇灌切片，也可是涂片，也可是培养细胞（玻片培养）等抗原片，从冰箱取出后，必须立即风干。

（2）固定：

无水乙醇或丙酮，固定5-10min。

（3）将被检血清用0.01mol/LpH7.2PBS稀释1：

5，滴加在抗原膜上，放湿盒中，室温或37℃温箱30min。

（4）冲洗：

用0.01mol/LpH7.2PBS冲去抗原膜上的血清，放在PBS冲洗缸内，浸泡冲洗15min，中间换两次PBS。

（5）荧光标记抗体染色：

将冲洗后的标本片取出，晾潮干，开始滴加荧光标记抗人IgG工作液，放湿盒30min同上。

（6）冲洗：

同上。

（7）晾干后缓冲甘油封片：

荧光显微镜观察。

（1）双抗体的作用：

1抗体—病人血清，它可以显示抗原万分和鉴定未知抗体，同时对第二步的荧光抗体又起抗原作用。

荧光标记抗体可以示踪抗原和抗体结合位置，显示了方法的敏感性，因为一个抗原单位可以结合很多抗体单位，如果每个抗原单位可结合5个抗体单位，而每个抗体单位又可结合5个荧光抗体单位的话，则细胞内的抗原是以25倍的荧光物质显示出来。

（2）既可定位和鉴定抗原，还可测未知抗体，这就扩大了免疫荧光技术的应用范围。

（三）几种荧光实验及方法简介

1、抗核抗体（ANA）

病人血清中存在抗细胞核抗体，可以特异与核抗原成分结合，形成抗原抗体复合物（主要是IgG），再与荧光标记的抗人IgG结合，在荧光显微镜下可观察到特异亮绿色荧光为阳性。

用大白鼠肝冰冻切片或人工培养细胞做抗原底物，间接荧光抗体法（双层法）。

常见ANA荧光染色模型种类

镜下荧光染色模型核材抗体成分抗体名称

核膜型（周边）鼠肝、细胞dsDNA抗dsDNA抗体

均质型鼠肝、细胞DNP抗体抗DNP抗体

斑点型鼠肝、细胞ENA抗ENA抗体

散点型细胞DNA蛋白结合体抗着丝点抗体

核仁型鼠肝、细胞4-6SRNA抗核小体抗体

PCNA型细胞DNA聚合酶抗PCNA体

纺锤体型细胞纺锤体抗纺锤本抗体

核膜型（Lamin型）细胞60-80KD多肽抗Lamin抗体

斑点型（La型，Sm型）细胞抗La,抗Sm抗体

斑点型（SPII型）细胞不明抗SPII抗体

斑点型（NSP—1）细胞抗NSP—1抗体

中心粒型细胞抗中心粒抗体

抗核抗体阳性时，可进一步做血清对倍稀释，测其抗体滴度。

[注意事项]

（1）抗原片需保存在2-8℃，-40℃可保存1年。

（2）抗原片从冰箱中取出时需立即风干。

[临床意义]

（1）正常健康人1：

5稀释为阴性，但高龄老人有时会出现低滴度阳性。

（2）活动期SLE病人ANA阳性，阳性率达100%，非活动期SLE病人阳性率可达80%以上。

（3）其它胶原性疾病：

硬皮病、皮肌炎、混合性结缔组织病、干燥综合症、类风湿关节炎、慢性活动性肝炎等可出现ANA阳性。

2、抗双链DNA抗体（抗dsDNA抗体）

间接荧光法——TE-IF法

马疫锥虫（简称TE），虫体结构中核和动基体纯双链DNA，用马疫锥虫作抗原底物，测抗双链DNA抗体，阳性时可见到核和动基体发出亮绿荧光。

阴性则无物特异荧光。

（1）疫锥虫接种小白鼠的腹部皮下，4天后，从尾部取一点血在镜下观察，高倍镜每视野30-40条虫子，即可放血制片。

（2）将感染的小白鼠尾部剪断，取血涂成直径0.5×

0.5cm大小圆点，晾干，放冰箱待用。

（3）使用时从冰箱取出必须立即风干，放蒸馏水中30s-1min溶解血红蛋白，晾干。

（4）以下步骤同（ANA）

抗dsDNA抗体是SLE的重要抗体。

ANA荧光染色模型为均质膜型，马疫锥虫活动基体、核、呈亮绿荧光。

活动期SLE，特别是肾性活动期，部分狼疮肾患者抗dsDNA抗体大多为阳性，而非活动期SLE病人，dsDNA抗体阳性率低，其它胶原病则阳性率委低。

3、阴道加德纳菌（Gardnerellavagionalis）的检测

[用途]

（1）疾病诊断：

检出病变部位（如女性阴道、男性尿道）阴道加德纳菌，以确诊细菌性阴道病和尿道炎。

（2）用于阴道加德纳菌的鉴定。

[使用程序]

（1）于每支阴道加德纳菌荧光抗体试剂中加入0.5ml无菌生理盐水溶解；

（2）将无菌棉拭子伸入阴道或尿道口3cm处旋转，采集阴道或尿道分泌物和上皮细胞涂片，火焰固定；

（3）用记号笔在涂有标本的玻片背面划一小区，于小区内标本上加荧光抗体试剂10ul，将玻片放入湿盒内密盖，37℃孵育30分钟，用缓冲液浸泡5-10分钟，蒸馏水冲洗甩干。

滴加缓冲甘油，加盖玻片封片，再滴加缓冲甘油作为镜油，于荧光显微镜下检查。

[结果报告]

标本镜下查见成堆发亮绿色荧光的小杆菌，可报告“阴道加德纳菌荧光染色阳性”。

4、支原体荧光单克隆抗体的检测

本试剂盒用于快速诊断支原体所致生殖泌尿系统感染，亦可用于健康检查和婚前检查。

生殖泌尿系统感染支原体后，经1-3周潜伏期。

开始出现临床症状。

男性表现为：

非淋菌性尿道炎、附睾炎、前列腺炎、直肠炎；

女性表现为阴道炎、宫颈炎、盆腔炎、输卵管炎、直肠炎等。

此时采集尿道或宫颈标本，经支原体特异性荧光单克隆抗体染色，在荧光显微镜下可查见支原体。

[取材与涂片]

用无菌棉拭子插入尿道或宫颈2-3厘米，稍转动，停留片刻后取出，将采集到的分泌物和上皮细胞涂在干净的特制功玻片圆孔内。

涂片在空气中充干燥。

在圆孔内加入适量丙酮固定10分钟待完全挥发后即可进行染色。

如涂片在10日内染色，贮于4℃冰箱内干燥保存即可。

[使用方法]

（1）按试剂盒要求和所提供的试剂，配制缓冲液；

（2）在荧光抗体冻干粉试剂中加入0.5毫升生理盐水，使之完全溶解，试剂一旦溶解，不宜再作冻融；

（3）标本玻片圆孔内加入10微升荧光抗体溶液，玻片放入湿盒内密盖，37℃孵育30分钟，缓冲液浸泡5-10分钟，蒸馏水冲流甩干。

滴加缓冲甘油，加盖玻片封干，于荧光显微镜下检查，玻片甩干后，或直接于高倍镜下检查。

[结果判断]

标本镜下查见亮绿色，具有典型大小，边界清晰的梨状圆形颗粒，可报告为“支原体荧光抗体染色阳性”。

5、衣原体荧光单克隆抗体的检测

本试剂盒用于快速诊断衣体所致结膜炎（沙眼），生殖泌尿系统感染及部分鹦鹉热衣原体感染等。

[工作原理]

本试剂盒使用的抗衣原体单克隆抗体是异硫酸盐荧光素标记的EVI-HI，单克隆抗体（FITC-EVI-HI-McAb），属性特异，通过直接免疫荧光法可以检测标本涂片中存在的已知所有15种人类沙眼衣原体血清型抗原（即A-K、Ba、L1、L2、L3）以及鹦鹉热衣原体抗原（BPIC、6BC、Mn等）。

[有关参数]

蛋白浓度______mg/ml

荧光素（FITO）浓度：

______mg/ml

F/P克分子比值：

________

特异生结合部位：

衣原体表面脂多糖中KDO（2-酮基-3-去氧辛酮糖酸）部分。

[试剂盒组成]

50人份

单克隆抗体工作液

1ml

抗体稀释液

2ml

封片液

5ml

采集衣原体标本用纯棉拭子（可以自备）。

[试剂盒使用方法]

（1）按产品介绍将0.5ml抗体稀释液加入冻干的单克隆抗体瓶中，轻轻摇动，使粉末溶解；

（2）在每张标本片的圆孔加10ul上述抗体工作液；

（3）湿盒内孵育30分钟，室温下；

（4）在蒸馏水中轻轻摇动玻片冲洗10分钟，空气干燥；

（5）在圆孔内加一滴封片液，放盖玻片，荧光显微镜下判读结果；

（6）每张标本涂片至少有10个完整上皮细胞及10个典型原体颗粒才判断为阳性。

[注意]

（1）单抗工作液保存期：

液态

冻干

4℃

三个月

一年

-20℃

一年以上

（3）稀释液，封片液均可保存于2-8℃时，可存放六个月。

[标本采取方法]

a、结膜标本

（1）将患眼用1%的可卡因麻醉；

（2）用小拭子在上下眼脸及穹隆部进行采样，如果取双眼标本，应先选感染轻的眼，以免加重感染。

b、男性尿道标本

（1）取样前1小时病人不排尿；

（2）将小拭子插入尿道2-4cm（至少2cm,不超过4cm。

轻轻转动后，停留1"

-2"

，退出，涂片。

c、女性宫颈标本

（1）用大拭子擦去宫颈外口多余粘液；

（2）用小拭子插入宫颈管内直至大部分拭子头看不到为止，轻轻转动5-10"

；

（3）退出拭子，不能接触阴道壁。

[涂片方法]

（1）轻轻转动拭子一侧涂在玻片圆孔（8mm）上半部，再轻轻转动拭子另一侧涂在下半部，应涂满全孔而不超过孔界；

（2）透过光线看到圆孔内呈均一不透明状，即表示涂片满意；

（3）将涂片在空气中充分干燥（此步骤很重要）；

（4）放平玻片，在孔中加0.5ml丙酮固定10’，使之完全挥发；

（5）如涂片在7日内染色，则贮于4℃；

如超过7日，则应置于-20℃保存，上述两种情况下，标本盒内均应放干燥剂（如变色硅胶等）；

（6）染色前从冰箱内取出标本盒，应在室温放置30’，使标本完全升至室温。

再打开标本盒检查硅胶是否变色；

如已变色，表明标本保存不好，染色将受影响，阴阳性对照片的处理方法相同。

6、梅毒FTA-ABS的检测

检出各期梅毒病人体液中抗梅毒螺旋体的特异IgG和GgM抗体，确定梅毒感染诊断和监测疗效；

（2）供血者和婚前及各种健康体检。

原理：

（1）FTA试验：

以梅毒密螺旋体为抗原，固定于载玻片上，加待检血清，如血清中含有抗螺旋体抗体，即与片上的抗原结合，再加抗人免疫球蛋白荧光抗体，螺旋体被感染成发荧光的螺旋体，为阳性。

（2）FTA-ABS试验：

为了排除FTA试验的交叉反应，彩无毒密螺旋体培养液吸收血清中群我叉抗体，使用权血清在1：

5稀释时不产生叉瓜，可作确诊。

[试剂盒提供材料]

（1）抗原；

（2）抗人IgGFA（1:

10）50ul；

（3）人阳性血清50ul；

（4）吐温-80；

（5）吸引剂；

（6）封片剂；

（7）PBST（0.5%Tween-80）,加蒸馏水600ml，加吐温-80：

300ul

[FAT试验程序]

抗原混匀后以接种环涂制抗原片，晾干后，丙酮10分钟或火焰固定；

56℃30分钟灭活血清标本，PBS190ul加血清标本10ul，1：

20稀释后取10ul于抗原片上；

抗原片置室内37℃30分钟，以PST浸泡5分钟，提拉数次，取出吹干；

以PBST0.5ml稀释抗人IgG荧光抗体，10ul/孔滴加抗原片；

重复步骤3；

以封片剂封片。

阳性标本可进一步做FTA-ABS试验。

FTA-ABS试验程序：

吸收剂20ul稀释灭活血清标本5ul（1：

5），滴加在抗原片上，然后重复3、4、5、6步骤。

[报告结果]

标本于镜下呈亮绿色螺旋体，形态典型，强度在1+-4+之间，报告为阳性。

7、单纯疱疹病毒荧光单克隆抗体检测

本试剂盒用于快速诊断单纯疮疹病毒所致生殖系统感染。

单纯疱疹病毒（HSV）分HSV-2两个血清型。

HSV-1主要引起唇疱疹、咽炎、角膜结膜炎和散发性脑炎；

而生殖器的炎症状和疱疹主要由HSV-2所引起，少数由HSV-1所引起。

生殖器疱疹的临床表现主要是在生殖器部位出现小丘疹、水疱、糜烂和溃疡性损伤，女性感染可导致流产、胎儿畸形、死亡，HSV-2与宫颈癌的发生关系密切。

采集疱液或溃疡基底层分泌物、宫颈和阴道分泌物，经与单纯疱疹病毒型共同型单克隆抗体和荧光标记二抗（染色间接法）后，在荧光显微镜下可查见HSV，特异敏感快速地为临床提供诊断结果。

用刮片或无菌棉拭子取疱液（穿破）、溃疡基层分泌物及宫颈阴道分泌物，将标本涂在干净的特制载玻片园孔内，空气中充分干燥后，置标本缸内，用冷丙酮固定10分钟，吹干，蒸馏水洗一次，吹干后可进行染色。

（1）按试剂盒要求和所提供试剂配制缓冲液；

（2）在单疱病毒单体（一抗）和荧光标记二抗冻干粉剂中，各加入0.5ml生理盐水，充分溶解。

试剂溶解后，不宜再冻融；

（3）标本园玻孔内，加10微升一抗溶液，玻片放湿盒内，密盖。

37度孵育40分钟，用缓冲液振洗2次，每次3-5分钟，再用蒸馏水振洗一次，吹干。

（4）园孔内滴加封片液，盖玻片填充片，荧光显微镜下用高倍镜或油镜观察。

标本在镜下见到暗红色的细胞上，胞膜及核周围，胞浆处有黄绿色颗粒状荧光，可报告为单纯疱疹病毒阳性。

四、几种常见致病菌的普通镜检与荧光镜检方法

（参考全国规范性病检测）

1、淋球菌

普通光镜检：

用染色法检测淋球菌。

美兰单染可观察到蓝色双球菌，革兰氏染色可观察到G（红色）双球菌

2、梅毒

（1）普通光镜检：

暗场观察梅毒螺旋体血清学方法

（2）荧光检测：

FTA试验：

a）抗原混匀后以接种环涂制抗原片，晾干，丙酮10分钟或火定；

b）56摄氏度30分钟灭活血清标本，PBS190ul，1比20稀释后取10ul于抗原片；

c）抗原片置湿盒37摄氏度30分钟，以BPST浸泡5分钟，提拉数次取出吹干；

d）以PBST稀释抗人IgG荧光抗体，10ul/孔滴加抗原片；

e）抗原片置湿盒37摄氏度30分钟，以PBST浸泡5分钟，提拉数次取出吹干；

f）以封片剂封干，荧光镜检，如阳性可进一步做FTA-ABS试验

FTA-ABS试验：

a）吸收剂20ul稀释灭活血清标本5ul（1比5），滴加在抗原片上；

b）抗原片置湿盒37摄氏度30分钟，以PBST浸泡5分钟，提拉数次取出吹干；

c）以PBST稀释抗人IgG荧光抗体，10ul/孔滴加抗原片；

d）抗原片置湿盒37摄氏度30分钟，以PBST浸泡5分钟，提拉数次取出吹干；

e）以封片剂封干，荧光镜检。

报告结果：

3、非淋菌性尿道炎

沙眼衣原体，直接涂片僮检，在细胞内寻找支原体包涵体。

将标本涂片，以甲醇固定10分钟，抗加衣原体20ul，放入湿盒37摄氏度30分钟，缓冲液冲洗，甩干，滴加缓冲甘油，封片，再滴加一滴缓冲甘油作为镜油，荧光镜检。

报告结果

标本于镜下查见呈亮绿色、具有典型大小、边界清晰的圆型颗粒，柱状细胞内可见亮绿色涵体，报告为阳性。

4、尖锐湿疣

醋酸白试验组织病理检查

5、软下疳

涂片超微检查杜克雷氏嗜血杆菌

6、单纯疱疹

（1）涂片细胞学检查

直接免疫荧光法

（3）

7、性病性淋巴肉芽肿

检查方法同非淋菌性尿道炎，同属沙眼衣原体感染。

8、阴道滴虫病

念珠菌感染

普通光镜检：

悬滴法革兰氏染色

9、细菌性阴道病

线索细胞检测胺试验

荧光检测所需部分自备试剂及器材：

固定剂：

甲醛、丙酮、乙醇

洗脱剂：

PBSPBST

蒸馏水，吸管，酒精灯，棉签，载玻片，盖玻片

荧光显微镜，染色湿盒，恒温箱（或37℃恒温水浴箱）

附：

衣原体异性诊断试剂盒使用说明书

（单克隆抗体免疫荧光法）

一、用途：

1.疾病诊断：

检出病变部位（如男性尿道、女性子宫颈）衣原体，用于确诊衣原体感染。

2.各种健康检查和婚前、孕前检查

二、原理：

生殖—泌尿道感染衣原体后，经1-3周潜伏期开始出现临床症状，男性表现为非淋球菌性尿道炎、附睾炎、直肠炎、前列腺炎、女性表现为阴道炎、宫颈炎、输卵管炎、直肠炎等此时采集宫颈或尿道标本，经抗衣原体特异性荧光抗体染色，在荧光显微镜下可查见衣原体颗粒及细胞内包涵体。

三、试验所需试剂和器材：

1.试剂盒提供基本材料：

（1）抗衣原体荧光标记单克隆抗体（用时加无菌生理盐水0.5ml）

（2）吐温–80

（3）缓冲液浓缩母液（用时每2ml加1000ml水、Nacl8.5克及吐温-800.5ml即为冲洗用缓冲液）

2.试剂盒不提供之必须材料：

（1）甲醇

（2）蒸馏水（3）吸管）（4）消毒棉签

（5）载玻片（6）37℃孵箱（7）荧光显微镜（8）染色湿盒

四、标本采集

衣原体是在细胞内寄生的微生物，检测衣原体必须采集被感染的上皮细胞。

先用消毒棉签将尿道口或宫颈口分泌物擦干净（女性患者需用扩阴器），再换一支棉签并将其深入到尿道口或宫颈内2-5cm处，旋转360度，停留片刻后取出，立即将采集的标本涂在干净的载玻片上。

五、衣原体检定程序：

将涂有标本的玻片放入标本缸中，以甲醇固定10分钟，取出后于空气中充分发挥，用记号笔于玻片背面划一小区，加抗衣原体荧光抗体20μl,放入湿盒中，密盖，置37度湿箱孵育30分钟，用上述缓冲液冲洗、甩干，滴加缓冲甘油，加盖玻片封片，再加一滴缓冲甘油作为镜油，于荧光显微镜下检查。

六、报告结果

标本镜下查见亮绿色、具有典型大小、边界清晰的原形颗粒，柱状细胞内可见亮绿色包涵体，可报告为“衣原体荧光抗体染色阳性”。

性病类荧光试剂价格表（参考）

梅毒螺旋体

25人份

500元

淋球菌

加特纳杆菌

衣原体

支原体

白色念珠菌

阴道毛滴虫

一、仪器硬件基本构成

1.三目荧光显微镜2。

图像采集卡3.彩色摄像机4.PII计算机5.彩色打印机

性病诊断彩色图文报告用户手册

一、功能介绍

启动性病诊断彩色图文报告系统，出现口令设置对话框，点“确定”按钮，即进入该分析系统桌面环境，如下所示：

1、菜单区

性病诊断彩色图文报告系统采用了下拉菜单：

视频控制、系统维护、帮助、网络服务。

如下图：

A、视频控制菜单

视频控制菜单的下拉菜单命令及功能

命令功能

连接视频（F5）与视频设备进行连接。

活动视频（F4）激活活动视频。