表达载体Word格式.docx
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密码子和终止密码子。
（1）启动子转录是由RNA聚合酶在启动子部位启动RNA转录的过程。
当转录启动以后，RNA聚合酶对启动子下游要转录的序列是无法识别的，也就是说无法识别要转录的序列是启动子在
天然状态下引导的基因，还是人为安装的基因，抑或是一段DNA序列。
这就为利用强启动子来表达目标基因提供了可能。
在载体中使用广泛的启动子主要有三类，即乳糖操纵子lac基因的启动子，及其与色氨酸合成trp启动子的杂合启动子tac或trc，所有这些基因都受IPTG诱导；
T7噬菌体的启动子；
噬菌体的
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P启动子。
L
（2）终止子转录启动以后的转录过程并不是永无止境的，会受到模板DNA序列结构的影响，当遇到茎环结构时转录便会终止，或遇到,因子介导的终止信号转录也会终止。
为了提高转录效
率，一般在要表达的目标基因下游装载一个转录终止子。
（3）核糖体结合位点转录出来的mRNA可在宿主细胞的翻译机器作用下翻译出目标蛋白。
细胞中的核糖体必须在mRNA上找到有效的核糖体结合位点（ribosomalbindingsite,RBS），以及Shine-Dalgarno序列（SD序列），从而启动临近其下游的翻译起始密码子的蛋白质翻译。
核糖体结合
位点可由目标基因自己带入，也可利用载体上预先装载的RBS位点。
如果是后者，要求目标基因装
载到载体以后，ATG与RBS位点之间的距离符合翻译起始的要求，一般间隔3-11bp。
表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体（图5-1）。
其基本骨架为来自pBR322和pUC8的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。
在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。
*不是单一位点图5-1大肠杆菌表达载体pKK223-3结构图谱
2.表达形式
在基因表达时，一方面可直接转录并翻译出目标基因ORF对应的氨基酸序列，即表达出完整
的目标蛋白。
另一方面，目标基因也可以融合蛋白的形式进行表达。
融合蛋白实际上就是杂合蛋白，
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含有两个或多个蛋白质的氨基酸序列。
一般融合蛋白是通过将两个或多个基因的开放阅读框按一定
顺序连接在一起，通过表达而形成的杂合蛋白。
载体pUC18是典型的克隆载体，但也可用作表达载
体。
当目标基因插入到多克隆位点后，如果该基因的方向及其阅读框正好与lacZ’的阅读框一致，目标基因就会与lacZ’基因形成融合基因，那么在IPTG诱导下，目标蛋白与LacZ’就会以融合蛋白的形式表达出来。
随着载体系统的发展和表达经验的积累，以融合蛋白方式进行表达主要是为了便
于目标蛋白的分离和纯化或分泌表达。
3.表达的控制
现在设计的表达载体对外源基因的表达都是在可控制的条件下进行的，而不论使用的是何种启
动子。
这种控制是通过诱导来完成的，不同的启动子使用的诱导方式不同。
通过诱导，可防止基础
表达（渗漏表达），特别可防止某些有毒产物对细胞的毒害。
启动子lac及其衍生启动子tac都是诱导型启动子，在IPTG的诱导下启动转录。
从lac启动子的诱导机制来看，在没有诱导物时，宿主细胞表达的lac阻抑物阻断转录的启动。
但由于表达载体
的拷贝数都很高（30-600），因此需要过量阻抑物才能阻断基础表达。
为了解决这个问题，往往在载
体上装载一个阻抑物编码基因lacIq，从而达到严谨调节的目的。
噬菌体的p启动子受cI基因产物的调节，cI阻抑物抑制转录的启动。
利用p启动子的载体LL
一般在,噬菌体溶原的大肠杆菌中表达。
为了达到控制表达的目的，溶原性,噬菌体上的cI基因是温
度敏感的，如M5219菌株，含有cIts857突变。
在低温（30:
C）下，该突变的cI阻抑物能抑制P启L
动子的转录，而在高温下（40-45:
C）失去活性，p启动子的表达不受抑制。
T7噬菌体启动子的表达控制相对来说比较复杂，详见以下部分。
二、利用T7噬菌体启动子的表达载体
尽管大肠杆菌表达载体的种类繁多，但利用T7噬菌体启动子的pET系列表达载体使用的更加广泛，这与其表达能力强和可控性好密切相关。
表达载体pET-5a是典型的pET载体（图5-2），其组成是在载体的基本结构的基础上加入了T7噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。
当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主
细胞中诱导表达。
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图5-2大肠杆菌表达载体pET-5a结构图谱
T7噬菌体启动子只能由T7噬菌体的RNA聚合酶识别并启动转录，而大肠杆菌的RNA聚合酶不能作用于T7噬菌体启动子。
因此要求用于表达的宿主细胞必须能表达T7噬菌体的RNA聚合酶。
大肠杆菌BL21（DE3）是常用的pET表达载体的宿主菌，该菌对T7RNA聚合酶和目标基因的转录实
行多层次的调控。
在该菌株染色体的BL21区整合有一个,噬菌体DNA，在,噬菌体的DE3区有一个T7RNA聚合酶基因，该基因受lacUV5启动子控制。
当pET载体进入BL21（DE3）细胞后，由于宿主细胞表达的lacI基因表达阻抑物，从而抑制T7RNA聚合酶基因的表达，在载体上的目标基因也无
法启动表达。
当存在IPTG诱导物后，使阻抑物失去阻抑作用，T7RNA聚合酶基因得以表达，产生T7RNA聚合酶，从而启动T7启动子控制的外源基因的表达。
在没有诱导物存在的情况下，lac启动子控制的外源基因仍会有渗漏表达。
如果外源基因对宿主
细胞有毒害作用，可能导致表达系统崩溃。
现有两套系统可控制外源基因的严谨表达。
一套是通过
宿主控制T7RNA聚合酶的量来实现，即在宿主细胞中引入一个带有T7噬菌体的溶菌酶编码基因的
质粒。
如pLysS或pLysE，它们分别低量和高量表达T7噬菌体的溶菌酶。
该溶菌酶可抑制T7RNA聚合酶的活性，从而减少在未诱导情况下外源基因的表达。
另一套是使启动子的控制效应更严谨。
在pET载体上装载lacI基因，提高阻抑物的溶度。
同时也可利用T7-lac启动子（在T7启动子序列下游装入一个由25bp组成的lacO操纵子序列），当阻抑物结合在lacO位点时，即使存在T7RNA聚合酶，外源基因也无法表达。
只有当诱导物存在时，才能解开T7RNA聚合酶基因和外源基因表达的双重阻遏。
图5-3是T7启动子在大肠杆菌中的表达调控模式示意图。
另外，在大肠杆菌中有一
些稀有密码子（如AGA,AGG,AUA,CUA,CCC），其对应的tRNA同样也稀少。
将这些稀有密码子
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对应的tRNA编码基因放在一个质粒上，构建出BL21codonplus菌株，可表达含有这些稀有密码子
的外源基因。
pET表达载体有一系列不同的形式，也有一系列不同的宿主菌，详细情况可参考Merker公司的产品介绍。
图5-3大肠杆菌中T7启动子表达调控模式图
三、表达融合蛋白的表达载体
当蛋白质表达以后，有效的分离纯化或分泌就成为获得目标蛋白的关键因素。
通过以融合蛋白
的形式表达，并利用载体编码的蛋白或多肽的特殊性质可对目标蛋白进行分离和纯化。
用作分离的
载体蛋白被称为标签蛋白或标签多肽（Tag），常用的有谷胱甘肽转移酶（glutathioneS-transferase,GST）、六聚组氨酸肽（polyHis-6）、蛋白质A（proteinA）和纤维素结合位点（cellulosebindingdomain,CBD）等。
1.GST融合表达载体
GST表达载体由原Phamarcia公司（现并入Amersham公司）开发的系列pGEX载体（图5-4），如pGEX-4T-1在启动子tac和多克隆位点之间加入了两个与分离纯化有关的编码序列，其一是谷胱甘
肽转移酶基因，其二是凝血蛋白酶（Thrombin）切割位点的编码序列。
当外源基因插入到多克隆位点后，
可表达出由三部分序列组成的融合蛋白。
GST是来源于血吸虫的小分子酶（26kDa），在E.coli易表达，
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在融合蛋白状态下保持酶学活性，对谷胱甘肽有很强的结合能力。
利用这些性质可用来分离纯化表
达的目标蛋白。
将谷胱甘肽固定在琼脂糖树脂上形成亲和层析柱，当表达融合蛋白的全细胞提取物通过层析柱
时，融合蛋白将吸附在树脂内，其它细胞蛋白就被洗脱出来。
然后再用含游离的还原型谷胱甘肽的
缓冲液洗脱，可将融合蛋白释放出来。
再用凝血蛋白酶切割融合蛋白，便可获得纯化的目标蛋白。
GST融合表达载体pGEX基因图谱图5-4
pGEX载体由13个载体组成，其基本结构相似，主要差异在蛋白酶切割位点上。
除了凝血蛋白
酶的切割位点外，其它还有Xa因子（FactorXa）和肠激酶（PreScissionProtease，enterokinase）切割位点。
2.组氨酸标签表达载体
利用组氨酸标签的表达载体有很多，在pET系列载体中也有，如pET-16b（图5-5）。
其主体框架与pET-5a相似，除了多了一个lacI基因外，主要差别在于在启动子下游含有一段编码6个组氨酸的序列和编码Xa因子酶切位点的序列。
当外源基因插入到BamHI等位点后，在BL21（DE3）菌株中可表达出带His-6标签的融合蛋白。
多聚组氨酸肽能与二价重金属阳离子结合，如镍离子（Ni
2+）。
将镍
离子固定在树脂上，便可对带His标签的融合蛋白进行亲和层析分离。
纯化的融合蛋白再用Xa因子
处理可去除标签多肽，从而获得纯化的目标蛋白。
3．内含肽标签表达载体
NewEnglandBio-Labs公司发展了一套IMPACT-TWIN表达系统，将目标蛋白放在两个可自裂
解的内含肽（intein）中间，在得到融合蛋白以后不通过蛋白酶水解就可将标签蛋白切除。
例如载体
pTWIN1，其基本结构与pET-16b相似，只是表达元件不同。
利用T7噬菌体启动子，其后依次为几
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丁质结合域（chitinbindingdomain,CBD）、Intein1、多克隆位点、Intein2和CBD。
其中Intein1来自一种蓝细菌（Synechocystissp.）dnaB基因产物的微型intein（mini-intein）,在特定pH和温度下，在该intein的C-端发生水解，从而将intein与其下游的多肽序列分开。
Intein2是来自蟾蜍分枝杆菌（Mycobacteriumxenopi）gyrA基因产物（pTWIN1）或热自养甲烷杆菌（Methanobacteriumthermoautotrophicum）rir1基因产物（pTWIN2）的微型intein,可在其N-末端进行巯基诱导的水解（thiol-inducedcleavageattheirN-terminus），利于目标蛋白形成二硫键。
在pTWIN1中，当外源目标基因插入多克隆位点并带有自身的翻译终止密码子时，可表达出在
目标蛋白N-末端带有CBD和intein1的融合蛋白（图5-6）。
表达该融合蛋白的细胞抽提物流过几丁
质树脂层析柱（chitinresin）时，融合蛋白就被吸附在树脂上，通过洗涤可将其它蛋白去除。
然后调
节层析柱的pH至7.0并于室温放置，此后目标蛋白与intein之间发生水解，最后通过洗脱便得到纯
净的目标蛋白。
图5-5组氨酸标签表达载体pET-16b基因图谱及其克隆和表达部位的序列
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图5-6表达载体pTWIN1工作原理及其产物纯化示意图
4．分泌表达载体
除了在细胞内表达外，还可让表达的蛋白分泌到细胞外或细胞周质区中。
这种表达方式可避免
细胞内蛋白酶的降解，或使表达的蛋白正确折叠，或去除N-末端的甲硫氨酸，从而达到维护目标蛋
白活性的目的。
利用信号肽序列作为融合标签可将融合蛋白分泌到细胞外，可利用的信号肽有碱性磷酸酶的信
号肽和蛋白质A的信号肽。
Phamarcia公司经销的pEZZ18表达载体利用了蛋白质A的信号肽（图5-7）。
表达载体pEZZ18的表达元件有lac启动子、蛋白质A的信号肽序列和两个合成的Z功能域（domain）。
来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的蛋白质A具有与抗体IgG结合的能力，Z功能域就是根据蛋白质A中结合IgG的B功能域而设计的。
融合蛋白表达后，在信号肽序列的指导下，
分泌到培养基中。
然后用固定了IgG的琼脂糖层析柱，通过与ZZ功能域的结合而得到纯化的融合
蛋白。
这个14kDa的“ZZ”肽链对融合蛋白的正确折叠几乎没有影响。
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pEZZ18基因图谱
图5-7分泌表达载体
第二节穿梭载体
简单地说穿梭载体（Shuttlevector）就是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体，如有些
载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在E.coli中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。
这类载体主要是质粒载体。
由于复制和选择都是有宿主专一性的，因此穿梭载体至少含有两
套复制单元和两套选择标记，相当于两个载体的联合。
另外，由于在大肠杆菌中对质粒载体进行操
作比较方便、拷贝数高且易于保藏，所以在现行的载体中只要涉及大肠杆菌以外的细胞，绝大多数
都装有大肠杆菌质粒载体的基本元件，它们都可以看作是穿梭载体。
据此，穿梭载体也可看作是载
体的一种表现形式，主要突出其在非大肠杆菌中的操作。
穿梭载体一般在大肠杆菌中保藏、扩增，
然后将其转到目标宿主中。
至于到目标宿主中的作用由其所携带的功能元件所决定，表达外源基因
是最常见的。
很多细菌都有自已的质粒和噬菌体，从理论上讲，它包们都可用作构建适合于各自宿主的克隆
载体，但这需相当长时间和精力。
另外，对于革兰氏阴性（Gram-）细菌来说，存在很多能在广谱宿主
rr范围种内复制的质粒，即广宿主范围质粒，如RSF1010[8.9kb,str,sul（磺胺）]、RP4、RP1和RK2。
其中RSF1010能在E.coli和假单胞菌（Pseudomonasspp.）等革兰氏阴性细菌中复制，但严格来说由这些质粒衍生出来的载体不能算穿梭载体。
一、大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体
大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体是典型的穿梭载体，其作用主要是将目标基因转移到芽胞杆
+菌或球菌中去。
枯草芽胞杆菌是Gram细菌中的代表种，但研究早期几乎没有发现其有质粒。
因此
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应用于该细菌的穿梭载体的质粒复制区主要来自球菌或其它芽胞杆菌。
pHT304是应用于苏云金芽胞
杆菌的穿梭载体，其构成相当于在克隆载体pUC18中插入了在苏云金芽胞杆菌中起作用的苏云金芽胞杆菌质粒的复制区和来自金黄色葡萄球菌的红霉素抗性基因（图5-8）。
通过这一载体，已经在许多苏云金芽胞杆菌中表达了杀虫晶体蛋白基因。
一般的穿梭载体只起转载的作用，对于目标基因是
否表达由目标基因自身的表达元件决定。
EcoRIKpnISmaIBamHIXbaIAccIHincIIPstISphIScaIHindIII6000
1000
5000pHT304
20006528bpsAccI
40003000Amp
ScaIErm
HincIIScaI
图5-8大肠杆菌/革兰氏阳性细菌穿梭载体pHT304基因图谱
二、大肠杆菌/酵母菌穿梭载体
酵母菌除了在真核生物的细胞生物学研究方面发挥重要作用外，在作为蛋白质的真核表达系统
方面也显示出巨大威力。
大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体，含有分别来自大肠杆菌和酿酒酵母的复制起点与选择标记，
另有一个多克隆位点区。
由于此类型的载体既可在大肠杆菌细胞中复制，也可在酿酒酵母细胞中复
制，因此在遗传学研究中很受欢迎。
它使研究工作者可自如的在两种不同的寄主细胞之间来回转移
基因，并单独或同时在两种宿主细胞中研究目的基因的表达活性及其它的调节功能。
例如，可将酵
母的某种基因亚克隆到穿梭载体上，置于大肠杆菌中进行定点诱变处理后，再把突变基因返回到酵
母细胞，以便在天然的宿主中研究此种突变的功能效应。
由于许多蛋白特别是真核来源的蛋白需要糖基化或磷酸化才能表现应有的生物学活性，因此需
要高效的真核表达系统。
现在已经有许多商业化的酵母表达载体，这些载体其实都是穿梭载体。
利
用酵母表达载体已经成功表达了许多酶类，并实现了产业化。
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同样，在动物和植物细胞中表达的载体也可看作穿梭载体。
一方面可以在大肠杆菌中操作、保
存和扩增，另一方面含有在动植物细胞中进行复制的区域和选择标记。
三、其它穿梭载体
在哺乳动物、植物、昆虫细胞等细胞中使用的表达载体或其它载体，一般都有在大肠杆菌中复
制的元件，因此都具备穿梭载体的特征。
由于携带在大肠杆菌中的复制元件已经成为一种一般性的
设计，因此对这类载体往往弱化其穿梭性质。
对于这些在真核生物中使用的载体，如动物的病毒载
体、植物的Ti质粒载体以及昆虫的杆状病毒载体，一般要复杂一些，但从其结构组成上看同样要满
足载体的一般要求。
第三节整合载体
无论是在生物学研究还是在基因工程应用中，都会涉及将某个基因或某些基因插入到染色体中
去的工作，承担这部分工作的载体，可称为整合载体（integrationvector）。
根据整合方式的不同可分
为定点整合和随即整合，按其作用来分可归为目标基因的插入或敲除以及随机突变体库的构建。
一、基因插入/基因敲除
当外源基因整合到宿主细胞的染色体后，可以稳定地遗传，进而达到稳定表达的目的。
另外，
在实验研究中经常需要敲除某个基因，从而验证其功能。
同源重组整合载体是最常用的整合载体，该载体不仅含有大肠杆菌克隆载体的骨架，更主要的
是含有一段便于同源重组的重组DNA片段。
也就是从染色体上待插入位点处取出一段DNA，将选择标记基因和多克隆位点插入到这个片段中间而得到这一重组DNA片段的。
如pDG1730载体是用来将目标基因插入到枯草芽胞杆菌,-淀粉酶基因而设计的（图5-9）。
首先，该载体含有在大肠杆菌中
复制区和选择标记（氨苄青霉素抗性基因），便于载体的制备。
同时还含有一个红霉素抗性基因erm，即用于革兰氏阳性细菌的选择标记基因。
对于该载体的功能元件，是一段,-淀粉酶基因amyE片段，并且其中插入了壮观霉素抗性基因spe。
一方面，该载体可以作为敲除amyE基因的载体。
当用SacI限制酶将载体线性化后，转化枯草芽胞杆菌，筛选壮观霉素抗性转化子，就可得到在,-淀粉酶基因上下游两条臂发生双交换的重组子，从而得到将spe插入到枯草芽胞杆菌,-淀粉酶基因中的基因敲除突变子。
按照这一原理，也可以敲除其它感兴趣的基因，即只要将该基因替换pDG1730载体中的amyE基因就可以了。
另一方面，pDG1730载体也可用作整合载体，将目标基因整合到amyE基因中。
将目标基因插入到载体的多克隆位点（BamHI-HindII-EcoRI）中，通过转化和筛选可得到目标基因和壮
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观霉素基因插入到amyE基因的突变体。
利用这一原理也可将目标基因整合到其它基因中。
pDG1730载体是针对枯草芽胞杆菌而构建的，对于其它细菌或物种可采取类似的方式构建整合/敲除载体。
图5-9枯草芽胞杆菌整合/敲除载体pDG1730基因图谱
二、随机插入突变载体
随着功能基因组研究的发展，不断需要一系列发生基因突变的材料。
为了满足这一要求，构建
随机突变体库便进入到研究工作中。
随机突变体库是指标记基因在载体的携带下通过DNA重组事件随机插入基因组中而形成的突变体的集合。
1．微生物插入突变载体
为了提高标记基因插入到基因组中的频率，一般都要借助转座子的帮助。
载体pEG922（图5-10）可用于革兰氏阳性细菌插入突变体库的构建。
该载体首先是一个穿梭载体，含有一段用于在大肠杆
菌中增殖的克隆载体pUC18的完整片段，以及在革兰氏阳性细菌中复制和选择的复制区（该复制区
是温度敏感型的，在42:
C高温下不能复制）和氯霉素抗性基因。
用于插入突变的功能元件是一个转
座子Tn5401（源自苏云金芽胞杆菌，Bacillusthuringiensis），并在其中装载了一个四环素抗性基因用
作选择标记。
当该载体转化到革兰氏阳性细菌后，转座子就会发生一定频率的转座。
在42:
C高温下筛选仅有四环素抗性的菌落，得到的菌落应该是发生转座的突变子。
由于在高温下，载体不能复制，
随着细胞的分裂，载体就会丢失。
只有发生转座事件的菌体才能表现出四环素抗性的表型。
为防止
转座突变子发生二次转座，一般将转座酶（ransposase）基因tnpA从转座子中取出来并放置在倒转重复
102
序列的外侧，构建成一个微型转座子（mini-transposon）。
这样一来既不会影响转座的发生，也可以保
证转座酶不会同时发生转座，从而避免二次转座的发生。
利用该载体已成功构建了蜡状芽胞杆菌
（Bacilluscereus）的突变体库。
图5-10转座子载体pEG922结构图。
IR，转座子Tn5401的末端倒转重复序列；
ts,温度敏感型复制区；
tnpA和tnpI,转座必须的转座酶基因和整合酶基因；
rep
cat和tet，氯霉素抗性基因和四环素抗性基因。
2．构建植物突变体库所用的载体
根癌农杆菌（
Agrobacteriumtumefaciens）介导的T-DNA插入或植物转座子标签是植物基因功能
研究中常用的产生突变体的方法。
（1）T-DNA插入突变体农杆菌介导T-DNA插入到植物基因组时往往会导致插入位点的基因
被破坏，从而创造用于基因功能分析的突变体。
为了研究插入位点基因的表达模式，人们常在T-DNA区段构建基因激活标签或基因陷阱（genetrap）等元件。
如我国水稻功能基因组计划采用了
pFX-E24.2-15R来创建大型突变体库。
pFX-E24.2-15R是
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