植物抗寒基因工程研究进展文档格式.docx

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1导入抗寒功能基因的研究

1.1抗冻蛋白基因及其转基因植物

抗冻蛋白（antifreezeproteins，AFPs）是20世纪60年代从极区海鱼的血清中发现的一种具有阻止体液内冰核的形成与生长、维持体液的非冰冻状态的高效抗冻活性物质。

之后，研究对象从极区鱼扩展到昆虫。

植物AFP的研究较晚，直到1992年加拿大Griffith等[3]才第一次提出从植物中获得内生AFPs。

之后，美国圣母大学的Duman实验室在多种植物中发现了有热滞效应的蛋白质[4]，1994年，费云标等从常绿抗冻植物沙冬青（Ammopiptanthusmonglicus）叶片分离到了抗冻蛋白[5]，1996年，卢存福等在高山植物唐古特红景天叶片及悬浮培养细胞中获得具有抗冻活性的蛋白质（AFPs）[6]。

综合目前的文献资料，AFPs具有三大特性：

①热滞效应，即AFPs能非依赖性降低溶液冰点；

②冰晶形态效应，即AFP能抑制冰晶生长，引起冰晶形态的改变；

③重结晶抑制效应，即AFPs具有抑制重结晶发生的作用，所形成的晶粒体积小且均匀[6-8]。

AFPs基因工程的目的基因多来源于鱼类。

Davies等[9]将美洲拟鲽抗冻基因（afp）整合在Ti质粒上，用叶圆片法转化郁金香、烟草和油菜等获得一定的抗冻力。

Georges等[10]将人工合成的鲟鱼afp基因导入玉米原生质体中获得表达，改良了植物的抗寒性。

Hightower等[11]将极区鱼AFPs蛋白的afa3、afa5和Spa-afa5（葡萄糖球菌A蛋白基因和afa5基因相连接的嵌合基因）基因由农杆菌介导对烟草和番茄实施遗传转化，最终得到afa3基因转化的烟草和番茄，Spa-afa5基因只得到番茄转化植株。

转基因植株的进一步检测发现，afa3基因能够表达出高稳定态的mRNA，但未检测到AFP对组织提取物中冰重晶化的抑制作用，只有携带Spa-afa5基因的转基因番茄果实中冰晶较未转移植株明显减少，具有很强的冷冻耐受性。

Kimberly等[12]将AFPⅠ型鱼类抗冻蛋白导入烟草中，在低温下亦检测到了抗冻蛋白的活性。

黄永芬等[13]用花粉管通道和子房注射法将整合在Ti质粒上的美洲拟鲽afp基因导入番茄中，田间抗寒性表明，转基因植株在低温下的生长势优于对照，致死温度也比对照降低2℃。

近年来，通过鱼类AFP基因的导入来提高作物的抗寒冻性研究方面取得了一些有益的进展，但多数情况下并不理想。

毕竟鱼类和植物在分类学上的关系太远，基因结构差异太大，因此我们寄希望于植物AFPs基因的深入研究和利用。

Worrall等[8]在应用植物AFPs基因方面作了有益的尝试，他们将胡萝卜afp的cDNA连接在双CaMV35S启动子之下，导入烟草，让其组成型表达。

结果表明，含有胡萝卜AFP的烟草提取物可以抑制烟草细胞冰晶的生长。

尹明安等[14]也克隆了胡萝卜的AFP基因，构建了植物表达载体并转化番茄，还未见结果报道。

1.2抗渗透胁迫相关基因及其转基因植物

1.2.1COR基因。

低温诱导蛋白是植物在低温作用下，由于基因表达的改变而诱发合成的蛋白质。

一些转基因研究证明，导入冷诱导基因确实具有提高植物抗寒性的功能。

目前，这一方面研究较深的是COR（Cold-regulated）家族蛋白基因。

拟南芥菜COR基因有4个基因家族COR6.6、COR15a、COR78和LEA（late-embryogenesisabundant）蛋白同源的COR47，且每个家族由2个串联连锁的基因组成。

在对拟南芥COR15a[15]、苜蓿CAS15[16]、小麦WCS120[17]和大麦HVAI[18]等冷诱导蛋白结构分析时发现它们具有共同特征：

亲水氨基酸丰富，含简单的氨基酸组成和重复的氨基酸序列；

功能上，亲水氨基酸残基排列在一侧，以氢键与冰结合，来降低体液的结冰温度，疏水氨基酸残基排列在另一侧，与膜结合而保护细胞膜免受寒害的作用。

ThomashowM.研究发现，拟南芥受低温、干旱或ABA处理时能诱导COR15a蛋白基因表达产生15kD的多肽，此多肽与叶绿体结合后转变为94kD的多肽COR15am[19]。

ArtusN.N.等使COR15am多肽在转基因拟南芥中大量表达后，与野生型相比，转基因植物分别提高叶绿体和原生质体的耐寒冷性，并增强原生质膜稳定性，减轻寒冻损害[20]。

1.2.2渗透调节相关酶基因。

低分子量的渗透调节物质（糖醇、特殊氨基酸、甘氨酸甜菜碱及脯氨酸等）的积累，被认为是增强植物对渗透胁迫适应和耐受的主要机制[21，22]。

前人的研究表明，在植物中导入糖代谢或脯氨酸代谢相关酶基因，转基因植株中糖分和脯氨酸的含量增加，增强了转基因植株对水分和盐胁迫的耐受性[23，24]。

寒冷胁迫和渗透胁迫之间有着密切的关系，植物在抵抗寒冻所导致的渗透胁迫过程中，体内也积累大量的糖类和脯氨酸等渗透调节物质，并伴随有多种冷诱导蛋白的表达。

因此，此类基因可作为抗寒候选基因加以应用。

肌醇半乳糖苷酶基因（GolS）即属于这一类。

它催化从UDP-半乳糖生化合成可溶性棉子糖家族（RFO）反应的第一步[25]，并且在蔗糖和RFO的碳元素分配上起着重要的调节作用[26]。

RFO（如肌醇半乳糖、棉子糖等）作为一种渗透保护剂在植物的抗寒及抗旱中起了很大的作用[27]。

研究发现，在耐霜冻植物夏枯草（Ajugareptans）[28]和松针（Pineneedles）[29]中发现有大量RFO积累。

Brenac等[30]在对玉米种子的研究中发现，蔗糖含量的积累与抗寒和抗旱无关，而RFO的积累与此有关。

这就说明了在抗寒与抗旱中真正起作用的是RFO的比例而不是总糖的含量。

肌醇半乳糖苷酶是一种重要的代谢调控点，它的基因为研究RFO在种子及其他组织中起渗透保护剂提供了入手点。

Taji等[27]研究发现，拟南芥肌醇半乳糖苷酶基因（AtGolS3）其启动子中含有2个CRT/DRE中心基序及2个类似CRT/DRE基序，CBF3能够结合到这些基序上，从而诱导AtGolS3表达，增加植物的抗寒性。

1.2.3LEA（late-embryogenesisabundant）蛋白基因。

LEA蛋白即种子胚胎发生后期富集蛋白质，是在种子成熟和发育阶段合成的一种蛋白质，也在植物受到干旱、低温和盐渍等环境胁迫后造成脱水的营养组织中大量表达[31]。

LEA蛋白首先在棉花中发现，后来在大麦、小麦、水稻、玉米、棉花、葡萄种子、大豆等作物中均检测到它的存在[32]。

LEA蛋白约10～30KD，富含甘氨酸和其他亲水氨基酸，疏水氨基酸含量较少，具有高亲水性和热稳定性，并具有高度保守的氨基酸序列[33]。

Xu等[34]将HVAⅠ蛋白基因转入水稻中，结果表明，转基因水稻提高了对水分胁迫和高盐胁迫的耐受性，考虑到抗寒与抗渗透胁迫之间的关系，HVAⅠ蛋白基因可作为一种抗寒基因加以应用。

LEADⅡ3类蛋白在抗寒中也有重要的作用。

Imai等[35]将西红柿中表达的LEADⅡ3类蛋白的LEA25基因转入酵母中，该基因的大量表达显著提高了酵母细胞的耐寒和耐盐性。

1.2.4脂肪酸去饱和酶基因及其转基因植物。

不同高等植物质膜中脂肪酸不饱和程度和冷敏感性密切相关，膜脂中心位置顺式双键的存在可把相变温度降至接近0℃，有些酶可催化饱和脂肪酸中顺式双键的形成，将编码这些酶的基因导入植物体内使其获得抗冷性状[36]。

Mcconn等[37]报道了拟南芥受低温诱导表达的脂肪酸去饱和酶基因fad8和fad7两者核苷酸75%同源，分别编码的ω-3去饱和酶基因彼此功能互补，共同催化膜脂中脂肪酸的去饱和。

大麦的blt14基因家族编码磷脂转移蛋白，调节膜脂相变温度[34]。

此外，在低等原核生物蓝细菌中发现的分别编码△6、△9、△12以及ω-3酰基不饱和酶基因desD、desC、desA和desB等，均具有调控膜脂去饱和，从而进行冷调节的特性[38]。

这些基因由低温诱导表达，并通过改变植物细胞膜脂磷脂组成，提高不饱和脂肪酸含量，从而增加其对低温的抗性，可以看作是植物细胞通过降低膜脂相变温度，保持液晶态膜蛋白正常功能的一种自身保护机制。

人们通过基因工程的手段进一步证明了这类基因的直接功能。

将fad7基因导入烟草后，fad7蛋白超量表达，烟草中C18-3不饱和脂肪酸含量增加。

低温处理后，野生型植株生长严重受到抑制，而转基因烟草只表现轻微受抑，且叶片褪绿不明显[39]。

Wada等[40]将抗寒蓝菌desA基因导入冷敏感蓝菌后，增强了其抗寒力。

有研究将蓝细菌的desA和desB基因引入聚球藻（SynechoccusSP.），转化菌株膜脂脂肪酸可在△12和ω-3位同时去饱和，其膜脂组成发生变化，不饱和脂肪酸含量增加，抗寒力增强，而单个基因导入则只能在各自相应的单个位点去饱和[41]。

1996年，Ishizaki等[42]将蓝细菌的脂肪酸去饱和酶基因DELTA9转入烟草，提高了烟草质膜不饱和脂肪酸水平，植株的抗寒性也随之提高。

研究表明，高比例的磷脂合成有利于植物适应冷胁迫。

植物叶绿体膜中磷脂酰甘油（PG）的脂肪酸不饱和度与膜脂相变温度及植物抗寒性关系密切[43]。

Mutata等[41]将抗冷植物拟南芥的GPAT基因转入烟草，转基因烟草内囊体PG的脂肪酸组成趋于不饱和，然而，将冷敏植物南瓜GPAT基因转入烟草中，植株膜脂脂肪酸饱和度反而增加。

因此，想改变冷敏植物的抗寒性，可利用来源于抗冷性强的植物中的GPAT基因。

有资料显示，将GPAT基因的cDNA连接到玉米泛在蛋白启动子之下，构建植物表达载体转化水稻，获得的转基因植株叶片内不仅不饱和脂肪酸含量显著增加，而且叶片的净光合率高出对照很多。

因此，很有必要进一步开展GPAT的研究和应用。

1.2.5超氧化物歧化酶基因及其转基因植物。

低温逆境下细胞内活性氧的产生和清除平衡遭到破坏，膜系统稳定性受到影响，活性氧积累使膜脂发生过氧化和脱脂作用，从而破坏膜结构，超氧化物歧化酶（SOD）可清除活性氧，维护膜系统稳定性。

早在1989年Bowler等[44，45]就把烟草的Mn-SOD酶的cDNA导入苜蓿中，进一步研究发现，转基因植物中的SOD活性增强。

Gupta[46]的转基因烟草表达豌豆（PisumSativum）的Cu/Zn-SOD的cDNA后，光合速率显著提高。

Mckersie等[47]通过农杆菌介导，把烟草Mn-SOD酶的cDNA导入到苜蓿中，经2个冬季的田间试验比较，转基因苜蓿越冬存活率大于未转移植株，平均提高25%，且在抗冻性增强的同时，对除莠剂的抗性也增强，这是通过转基因手段提高植物抗寒性研究中最为积极的一个实例。

Allen等[48]把Mn-SOD酶基因转入棉花中，也发现了转基因棉花耐冷性增强。

Breusegem等[49]报道利用质体转化技术将拟南芥的Fe-SOD和Nicotinaplumbaginifolia的Mn-SOD基因，导入玉米获得抗寒转基因玉米。

以上研究表明，将SOD的cDNA转入植物中，大量表达后增强了植株的耐氧能力，间接提高了其对低温的植物耐受能力[49]，这对于抵抗逆境胁迫具有重大意义。

因此，SOD等基因可作为抗寒候选基因加以应用。

2导入抗寒调控基因的研究

2.1CBF基因家族

CBF基因家族是一个包括CBF1、CBF2、CBF3、CBF4的小基因家族，其成员在植物抗寒、抗旱及抗盐碱方面起着很大的作用[50，51]。

1997年，Stocking在研究拟南芥冷诱导基因时发现了一种转录活性因子，由于它能结合到CRT/DRE这种DNA调控基序上，故命名为CBF1[52]。

随后，Gilmour等[50]从冷处理后的拟南芥cDNA文库中利用带有插入序列的重组分子CBF1进行杂交，结果发现了几个克隆。

DNA序列分析表明这些克隆可分为三类，每一类编码1个特定的但又紧密相关的蛋白。

除了已命名的CBF1外，其他两类命名为CBF2、CBF3。

由于CBF1~3基因除了具有抗寒作用外，还具有抗旱能力，所以它们又分别称为DREB1b、DREB1c、DREB1a[53]，2002年，Haake等[51]又发现了这个家族中的第4个成员CBF4。

DNA序列分析表明，CBF基因家族中的4个成员其基因阅读框架中都不含有内含子。

对CBF基因家族编码的蛋白质进行氨基酸序列分析发现：

CBF1、CBF2、CBF3蛋白之间的同源性为88%，相似性为91%。

最近研究表明，4种CBF蛋白中有相同的结构基序，即AP2结构域，这些基序在其他植物中的CBF类似蛋白中也有发现[54，55]。

AP2是一种DNA结合结构域，约60个氨基酸，在拟南芥APETALA2、AIBTEGUMENTA、TINY及其他一些蛋白中也存在，其作用是与COR基因启动子中的CRT/DRE片段结合，诱导抗寒及抗旱的发生[53]。

CBF4蛋白中的AP2基序，其氨基酸序列与其他3种CBF蛋白的AP2区相比具有91%～94%的同源性[51]。

2.2CBF基因家族在抗寒中的作用机制

CRT/DRE是高等植物中抗寒/抗旱基因的一种顺式作用因子，位于COR（cold-regulated）基因的启动子区域，推测COR基因的表达受CRT/DRE调控元件的调控。

CBF转录因子能够识别CRT/DRE元件，调控多个与同类性状有关的基因表达，在提高植物对环境胁迫耐性的分子育种中，改良或增强一个关键转录因子的调控能力，可使植物的耐逆性得到较为综合的改良[56]。

将拟南芥移植到低温环境，CBF1、CBF2、CBF3基因的转录水平在15min内迅速增长，并在2h后COR基因的转录水平升高。

因此，推断COR基因表达过程是一个信号级联放大过程，其中CBF的表达较COR基因早[57]。

因此，CBF转录激活因子诱导COR基因表达包括两步，第一步是CBF的诱导表达，第二步是COR的表达。

将CBF3转入拟南芥，发现CBF3的超表达不仅调控下游靶基因（CRT/DRE基因）的表达，还影响到脯氨酸和糖的代谢[57]。

正常条件下，转CBF3拟南芥中脯氨酸的含量比野生型中高5倍，与寒冷驯化后野生型中脯氨酸的含量相当；

寒冷驯化使转CBF3拟南芥中脯氨酸的含量进一步上升，比经过相同寒冷驯化的野生型中的脯氨酸含量高出2～3倍。

正常条件下，转CBF3拟南芥中可溶性糖含量比野生型中高3倍；

寒冷驯化后的野生型和转CBF3拟南芥中可溶性糖含量分别提高2倍，因此转CBF3拟南芥中可溶性糖含量仍旧比野生型中高3倍。

脯氨酸和可溶性糖作为渗透调节剂，在提高细胞渗透压、保护细胞膜和蛋白质活性、增强植物耐逆性方面的作用已经得到广泛认可。

因此，CBF3基因在提高植物耐逆性中的作用，可能不仅仅局限于只对CRT/DRE基因的调控，可能还以某种方式调控其他与耐逆相关的基因表达。

CBF基因已经成功地被用于许多物种的抗逆基因工程。

在拟南芥中过量表达CBF1或CBF3基因，都能使转基因植株的抗寒性增加。

Hsieh等[58，59]将带有CBF1基因、35S启动子及nos终止子的表达载体导入西红柿，结果发现转基因西红柿T1及T2代其抗寒性要比野生型植株高很多。

北京大学甄伟等[60]将CBF1转入油菜（Hordeumvulgare）及烟草（Nicotianatobacum），用电解质渗漏法分别检测其抗寒性，结果显示，转基因油菜的抗寒性较未转基因油菜有明显提高，转基因烟草抗寒性也有一定的提高。

3研究展望

随着植物抗寒分子机理的深入研究以及基因工程技术的日益成熟，植物抗寒冻基因工程取得了可喜的进展，同时也存在许多问题尚需要解决。

首先，目前对于植物感受和传导寒冷信号的机制和植物抗寒冻确切的分子机理的研究尚需要深入，ABA与Ca2+信号传导途径是如何系统作用将寒冷胁迫信号传递到细胞核的转录因子，转录因子又是如何调控各种抗寒基因的表达，各种抗寒基因又是如何发挥抗寒活性，对这些问题的分子机理研究是构成植物抗寒基因工程的基础。

只有弄清抗寒分子机理，才能有效地诱导和筛选出抗寒基因，才能有目的地导入合适的抗寒外源基因；

其次，在选择外源基因的时候，要考虑外源基因与植物内源基因相协调的问题。

一般以导入与植物同源性强的基因为佳，但同时应注意解决好转基因植物基因沉默的问题。

今后有必要对植物AFPs蛋白结构和功能进行深入的研究，以期将植物内源抗冻蛋白基因导入植物中增加协调性；

植物的抗寒性是数量性状，由多基因控制和调节，单个抗寒基因的导入对于提高植物的抗寒性很有限，要想有效提高植物的抗寒性，一方面，可以采取导入抗寒调控基因，如抗渗透胁迫的转录因子CBF基因。

另一方面，可以采取导入抗寒调控基因和关键性抗寒基因相结合的策略。

也可以尝试同时导入多种关键性抗寒基因，如afp、fad和desA等基因的策略，这在操作上有一定的难度；

综合对诱导基因的研究发现，许多冷诱导基因的表达具有稳定质膜结构并提高植物抗低温的作用，而这些冷诱导基因则对抗低温没有直接作用。

因此，冷诱导基因的表达产物与质膜晶态稳定性之间的相互关系成为目前抗冷分子机理研究的重要课题，它的深入研究对改进作物对低温的抗性具有重要的理论和实践意义。

研究植物抗寒性的目的在于提高农作物的抗寒性，以增加其产量和地域的分布。

采用多种抗寒冻技术措施相结合的方法，可期望最大限度地提高农作物的抗寒性。

今后将致力于植物转基因方法、遗传育种方法、化学调控方法及科学的栽培管理方法等共同的结合使用，以最终达到防止寒害，提高农作物产量的实际应用目的。

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